許曉輝，邱國(guó)玉，景武堂，馬友振，王小喬，賈汝玲，杜 清

(1蘭州市食品藥品檢驗(yàn)所,甘肅 蘭州730050；2甘肅省人民醫(yī)院外科,甘肅 蘭州 730000；3江蘇萬(wàn)邦生化醫(yī)藥集團(tuán)有限責(zé)任公司,江蘇徐州,221004；4青海民族大學(xué)藥學(xué)院,青海省青藏高原植物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,青海西寧810007)

0 引言

新藥研發(fā)是尋找替代目前臨床上使用有缺陷的藥物或者尋找能夠治療特定疾病的高效低毒藥物,它是從化合物庫(kù)中,通過體內(nèi)體外活性篩選出候選藥物,再經(jīng)過臨床試驗(yàn)驗(yàn)證,才上市應(yīng)用到患者身上。因此,新藥研發(fā)是一項(xiàng)復(fù)雜、艱巨的工作,一個(gè)新藥的問世周期是12～15年(圖1)［1］。在新藥研發(fā)中應(yīng)用的分析技術(shù)有色譜、質(zhì)譜、核磁共振,而對(duì)復(fù)雜組分定性定量應(yīng)用比較廣泛的是液質(zhì)聯(lián)用(liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)。目前,液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)已經(jīng)成為新藥研發(fā)的重要技術(shù)手段,它具有高靈敏度、高通量、快速等優(yōu)點(diǎn),被廣泛的應(yīng)用到新藥結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn),新藥的吸收、分布、代謝、排泄檢測(cè),新藥藥理活性的研究等方面。本文從與藥物相關(guān)化合物結(jié)構(gòu)的鑒定、新藥體外活性研究、新藥體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)及與新藥作用相關(guān)的藥效標(biāo)志物等方面探討了液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在新藥研究中的應(yīng)用。

圖1 基于化合物生物活性篩選的新藥發(fā)現(xiàn)過程示意圖

1 LC-MS概述

LC-MS系統(tǒng)元件包括進(jìn)樣器、HPLC系統(tǒng)(或UPLC系統(tǒng))、電離源、質(zhì)量分析器和檢測(cè)器。理想情況下,這些元素都在一個(gè)計(jì)算機(jī)系統(tǒng)的控制之下。典型的反相高效液相色譜系統(tǒng)連接到MS將使用一些水或甲醇或乙腈的組合作為流動(dòng)相。同時(shí)還要添加離子化試劑,典型的離子化試劑主要包括乙酸銨、甲酸銨、乙酸和甲酸等。超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用是目前使用比較廣泛的儀器,其有多種電離源。最常見的兩種源是電噴霧電離(electrospray ionization,ESI)和大氣壓化學(xué)電離(atmospheric pressure chemical ionization,APCI)；這兩種類型源現(xiàn)在都是用于LC-MS應(yīng)用的質(zhì)譜儀標(biāo)準(zhǔn)配置。在ESI系統(tǒng)中,高壓場(chǎng)(3-5kv)向柱狀噴射,導(dǎo)致帶電荷的液滴聚焦于質(zhì)量分析裂解器,這些液滴在接近質(zhì)譜儀入口時(shí)變得越來越小,當(dāng)液滴變得越來越小時(shí),單個(gè)離子就會(huì)在一個(gè)被稱為“離子-蒸發(fā)”的過程中出現(xiàn),這些離子就會(huì)被MS系統(tǒng)分離出來。在APCI中,加熱蒸發(fā)柱洗脫液,然后電暈放電電離溶劑分子,然后通過化學(xué)電離機(jī)制產(chǎn)生分析物離子。圖2列示了目前比較常見的幾種液質(zhì)聯(lián)用儀,主要有單四極質(zhì)譜儀、飛行時(shí)間質(zhì)譜儀、三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀和離子阱質(zhì)譜儀。其中,飛行時(shí)間(TOF)質(zhì)譜計(jì),它具有額外的能力提供更高質(zhì)量分辨率光譜；三重四極質(zhì)譜儀,它最常用于生物分析,但也可用于代謝物鑒定；離子阱質(zhì)譜儀,其具有獨(dú)特的產(chǎn)生MSn數(shù)據(jù)的能力,這些數(shù)據(jù)可以進(jìn)行化合物結(jié)構(gòu)解析。除了這四種類型的質(zhì)譜計(jì)之外,還有一種混合質(zhì)譜儀,它將兩種基本的質(zhì)譜儀結(jié)合在一起,構(gòu)成了一個(gè)混合系統(tǒng),該混合系統(tǒng)囊括了“Q-TOF”MS-MS系統(tǒng)［2］?？偟膩碚f,四級(jí)桿液質(zhì)聯(lián)用的強(qiáng)項(xiàng)在定量,飛行時(shí)間或離子阱液質(zhì)聯(lián)用的強(qiáng)項(xiàng)在定性。液質(zhì)聯(lián)用強(qiáng)大的分析能力,分析級(jí)別能夠達(dá)到ng級(jí)別水平,能夠提供相對(duì)分子量和豐富的結(jié)構(gòu)信息,與譜庫(kù)檢索聯(lián)合應(yīng)用,能夠快速對(duì)化合物進(jìn)行擬合匹配,定性化合物,尤其適合微量復(fù)雜組分體系的分析、不易分離或缺乏特征紫外吸收的化合物,對(duì)已知、未知物的定性定量、在以藥物生物活性為指導(dǎo)的目標(biāo)化合物篩選,靶標(biāo)分析,藥物及其代謝物血漿、膽汁、尿液中的檢測(cè)等。新藥研發(fā)經(jīng)歷不同階段,從化學(xué)設(shè)計(jì)合成目標(biāo)化合物到候選藥物的藥理篩選,LC-MS已被用于所有這些階段,并在許多情況下成為首選的分析工具。

圖2 不同類型的質(zhì)譜儀

2 液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在新藥研發(fā)中的應(yīng)用

在新藥研發(fā)過程中,對(duì)潛在的新藥先導(dǎo)化合物進(jìn)行鑒定是新藥高通量篩選的關(guān)鍵。而液質(zhì)聯(lián)用的高分離能力和高靈敏度選擇性于一體,能夠同時(shí)分析多個(gè)化合物,可對(duì)生物基質(zhì)內(nèi)的微量藥物進(jìn)行可靠的定性驗(yàn)證與定量檢測(cè)。目前液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在新藥研發(fā)中的應(yīng)用主要集中在與藥物相關(guān)化合物結(jié)構(gòu)的確證、藥物體外生物活性篩選、體內(nèi)藥物代謝和藥代動(dòng)力學(xué)等方面。

2.1 與藥物相關(guān)化合物結(jié)構(gòu)的確證在新藥研發(fā)的初級(jí)階段,目標(biāo)化合物設(shè)計(jì)合成后,得到一系列潛在的可能成為候選藥物的目標(biāo)化合物,應(yīng)用LC-MS對(duì)這些潛在的可能成為候選藥物的化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證和純度分析,這是作為構(gòu)建化合物庫(kù)的第一步。一個(gè)通用的系統(tǒng)是運(yùn)用紫外檢測(cè)器對(duì)所得化合物進(jìn)行純度評(píng)估,用液質(zhì)聯(lián)用儀的MS系統(tǒng)對(duì)化合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行確證,MS系統(tǒng)是單四級(jí)桿或飛行時(shí)間質(zhì)譜或離子阱,這些系統(tǒng)通常高度自動(dòng)化。目前,LC-MS工作中都具備高度的自動(dòng)化和便捷化,能夠同時(shí)分析化合物的純度和給出化合物結(jié)構(gòu)方面的質(zhì)譜信息。這個(gè)過程是基于LC-MS硬件系統(tǒng)和軟件系統(tǒng)相組合的信號(hào)同時(shí)檢測(cè),這些信號(hào)是根據(jù)所觀察到或預(yù)期的化合物的m/z響應(yīng)觸發(fā)的。在新藥未知物結(jié)構(gòu)鑒定方面,應(yīng)用多的是飛行時(shí)間質(zhì)譜或離子阱質(zhì)譜,具體操作應(yīng)該是：首先用Q-TOF獲得高分辨數(shù)據(jù),得到分子構(gòu)成,其次分析每一個(gè)碎片,得出結(jié)構(gòu),最后用標(biāo)準(zhǔn)品在相同的條件下做Q-TOF,如果得到的結(jié)果與分析出的結(jié)果是完全一致,則該未知物就被鑒定出來,如果需要進(jìn)一步鑒定該未知物,則需要分離出該未知物,與1H-NMR、13C-NMR、IR相配合,確證結(jié)構(gòu)。在已知藥物結(jié)構(gòu)鑒定方面,用LC-MS/MS同時(shí)分析已知物與已知物的標(biāo)準(zhǔn)品,兩者結(jié)果相比較,如果完全一樣,一般情況就可確定已知物結(jié)構(gòu)。與新藥作用相關(guān)的藥效標(biāo)志物尋找是新藥體內(nèi)體外篩選的主要依據(jù),藥物活性標(biāo)記物的識(shí)別與檢測(cè)對(duì)于研究藥物活性與作用機(jī)理非常重要,可以準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)藥物藥理活性,同時(shí)也可減少藥物研發(fā)和臨床試驗(yàn)的時(shí)間和成本。目前,大多數(shù)藥物的研發(fā)模式都是基于活性標(biāo)記物的藥理活性研究為目標(biāo),以藥物對(duì)該相關(guān)疾病模型的標(biāo)志物的影響作用與大小為依據(jù),通過檢測(cè)藥物作用于模型后,活性標(biāo)志物上調(diào)或者下降用來預(yù)測(cè)被研究藥物藥理作用,同時(shí),藥物活性標(biāo)記物的變化可以預(yù)測(cè)或發(fā)現(xiàn)與候選藥物相關(guān)的安全問題,揭示藥理活性或表明臨床療效,在新藥研發(fā)方面,使用液質(zhì)聯(lián)用去發(fā)現(xiàn)或鑒定藥物藥理活性標(biāo)志物,藥理活性標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)與確證將加速將加速藥物的研發(fā)速度［3－7］。吳光昊［8］基于液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)開展了抗體偶聯(lián)藥物(ADC)結(jié)構(gòu)研究及鑒定,借助質(zhì)譜技術(shù),以ADC藥物的載藥分布與偶聯(lián)位點(diǎn)的質(zhì)量特性為切入點(diǎn)對(duì)抗體偶聯(lián)藥物結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征分析,為ADC藥物質(zhì)量異質(zhì)性研究打下扎實(shí)基礎(chǔ)。

2.2 藥物體外生物活性篩選藥物體外活性篩選主要包括以下幾個(gè)層次的篩選：計(jì)算機(jī)模擬藥物篩選、分子水平的藥物篩選模型、細(xì)胞水平的藥物篩選模型。候選藥物的體外活性篩選要經(jīng)過一系列生物活性實(shí)驗(yàn)來確證,主要有藥物作用于培養(yǎng)的人體細(xì)胞后細(xì)胞組織形態(tài)、DNA、RNA、酶、細(xì)胞周期等發(fā)生的變化,藥物與能夠體現(xiàn)藥物活性的藥物標(biāo)志物的作用效果,比如藥物與拓?fù)洚悩?gòu)酶的作用,藥物與細(xì)胞周期調(diào)控因子p53的作用,評(píng)估候選藥物抑制一種或多種人細(xì)胞調(diào)控因子的潛力,而LC-MS/MS被用于這個(gè)步驟主要是去研究藥物與靶點(diǎn)結(jié)合的識(shí)別或者通過高通量篩選去識(shí)別活性化合物。目前,已有大量應(yīng)用液質(zhì)聯(lián)用去篩選藥物體外生物的研究成果被報(bào)道。例如,活性乙酰水解酶(PAF-AH)是一種血小板活化因子,是血管系統(tǒng)及炎癥系統(tǒng)中的細(xì)胞間調(diào)節(jié)分子,劉維等［9］建立一種簡(jiǎn)單、快速、特異、穩(wěn)定地LC-MS/MS法檢測(cè)新型藥物過敏反應(yīng)介質(zhì)血小板活化因子C-18(PAF C-18)及其乙酰水解酶(PAF-AH)活性的方法,該方法可以通過外源性添加PAF C-18在一定時(shí)間內(nèi)的下降程度,間接反映PAF-AH活性,為開展相關(guān)藥物過敏的臨床藥效學(xué)研究提供了指導(dǎo)。也有液質(zhì)聯(lián)用與其他生物活性篩選方法相結(jié)合來篩選藥物藥理活性,如樸香蘭等［10］應(yīng)用酪氨酸酶抑制實(shí)驗(yàn)-液質(zhì)聯(lián)用方法快速尋找到苦參中具有較強(qiáng)酪氨酸酶抑制成分槐屬二氫黃酮G和苦參酮,這兩個(gè)化合物的酪氨酸酶抑制活性強(qiáng)于已知的酪氨酸酶曲酸的活性。劉侗等［11］以體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(ECV-304)為研究材料,建立以H2O2誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的氧化損傷模型,以內(nèi)皮細(xì)胞的存活率為指標(biāo),研究通頂散各萃取部位對(duì)ECV-304的保護(hù)作用,結(jié)果表明藜蘆生物堿、人參皂苷和甘草皂苷是通頂散抗過氧化氫損傷活性物質(zhì)。近年來,蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)研究是新藥開發(fā)的一種重要高通量篩選技術(shù),新藥靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn)鑒定、藥物的作用模式、藥物與蛋白質(zhì)作用機(jī)理是藥物篩選蛋白質(zhì)組學(xué)研究的主要內(nèi)容［12］,而液質(zhì)聯(lián)用是蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)研究分析的主要工具,基于液質(zhì)聯(lián)用分析技術(shù)的高通量蛋白質(zhì)組學(xué)藥物活性篩選有利于加速新藥研發(fā)的速度。ZHU等［13］基于代謝組學(xué),開發(fā)了一種快速、靈敏、高通量的腫瘤細(xì)胞中20種內(nèi)源性核苷和核苷酸的液質(zhì)聯(lián)用分析方法,而內(nèi)源性核苷和核苷酸是代謝組學(xué)研究中最具差異性的代謝物,這20種內(nèi)源性核苷酸和核苷酸的定量分析方法符合具體擴(kuò)增代謝組學(xué)研究的定量要求,具有較好的選擇性,當(dāng)應(yīng)用腫瘤細(xì)胞篩選抗腫瘤藥物,可以通過檢測(cè)施加藥物后的腫瘤細(xì)胞中內(nèi)源性核苷和核苷酸而判斷藥物藥效。

2.3 體內(nèi)藥物代謝和藥代動(dòng)力學(xué)藥物體內(nèi)活性篩選主要有以下兩個(gè)層次：動(dòng)物個(gè)體水平的藥物篩選模型和人體臨床篩選模型。LC-MS在新藥發(fā)現(xiàn)中最常見的應(yīng)用是藥物的吸收、分布、代謝、排泄(ADME)研究,它們占藥物代謝和藥代動(dòng)力學(xué)(DMPK)研究的大部分工作。藥代學(xué)研究首先是體內(nèi)ADME篩查、其次是各種體內(nèi)臨床前ADME-PK篩查、代謝產(chǎn)物的鑒定、體內(nèi)篩選還有一個(gè)重要指標(biāo)是代謝穩(wěn)定性試驗(yàn)。圖3是動(dòng)物體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)篩選樣品制備策略圖,它使用96孔板進(jìn)行樣品制備,蛋白質(zhì)沉淀常常是樣品制備的首要步驟,這種制備方式有一定的便利性和高效性,而對(duì)于一些特殊的化合物,常常液-液萃取或者固相萃取方法進(jìn)行前處理,藥代動(dòng)力學(xué)研究應(yīng)用比較多的是三重四級(jí)桿液質(zhì)聯(lián)用［2］。早期藥代動(dòng)力學(xué)評(píng)價(jià)是藥物發(fā)現(xiàn)過程的重要組成部分,能夠區(qū)分化合物的體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)特性,從而使研究具有有針對(duì)性,加快研發(fā)進(jìn)程。基于可供篩選的化合物數(shù)量、新靶點(diǎn)篩選技術(shù),藥代動(dòng)力學(xué)篩選速度成為新藥研發(fā)進(jìn)展的關(guān)鍵。目前采用基于液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)篩選藥代動(dòng)力學(xué),有單一給藥,也有盒式給藥方法,所謂盒式給藥即幾種候選化合物混合后同時(shí)給單一動(dòng)物進(jìn)行快速樣品分析,在體內(nèi)研究多選擇盒式給藥,這樣可提高化合物在體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)篩選通量,節(jié)省實(shí)驗(yàn)資源和成本,缺點(diǎn)是可能會(huì)出現(xiàn)化合物相互作用,因此對(duì)所采用的分析方法進(jìn)行評(píng)價(jià)和驗(yàn)證是必要的［14］。 王蕊等［15］應(yīng)用 HPLC-MS/MS 分析恒河猴全血中調(diào)血脂化合物IMM-H007(見圖3)的藥代動(dòng)力學(xué),結(jié)果表明,IMM-007在體內(nèi)血藥濃度較低,主要以活性代謝產(chǎn)物M1和MP形式存在,MP的體內(nèi)暴露量明顯高于M1,該研究為進(jìn)一步為探明新型調(diào)血脂藥IMM-007后續(xù)藥理毒理研究提供參考數(shù)據(jù)。楊兵等［16］基于高效液相-電噴霧-四級(jí)桿-線性離子阱串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)建立了一種高通量靶標(biāo)磷脂組學(xué)分析方法,研究尿液中的磷脂輪廓并篩選出尿液樣本中潛在的磷脂標(biāo)志物,該檢測(cè)分析方法在磷脂組學(xué)研究中具有簡(jiǎn)單、穩(wěn)定和敏感的特點(diǎn),可應(yīng)用于后續(xù)大樣本量的磷脂組學(xué)研究及潛在尿磷脂標(biāo)志物的定量研究,為研究具有磷脂標(biāo)記物的藥物的體內(nèi)代謝、藥物動(dòng)力學(xué)提供了指導(dǎo)。Hallur等［17］以 LC-ESI-MS/MS方法分析了FAK抑制劑Defactinib在小鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué),該方法簡(jiǎn)單、靈敏,具有良好的準(zhǔn)確性和精密度,完全符合美國(guó)FDA的指導(dǎo)方針。恩曲替尼是一種有效的口腔間變性淋巴瘤激酶(ALK)抑制劑,Attwa等［18］建立了一種有效的LC-MS/MS方法,用于定量人血漿基質(zhì)中的恩曲替尼,該方法具有快速、特異、靈敏等特點(diǎn),被認(rèn)為是人類血漿中恩曲替尼定量及其代謝降解評(píng)估的第一種方法?？傊?應(yīng)用液質(zhì)聯(lián)用去分析藥物體內(nèi)代謝物及藥物藥代動(dòng)力學(xué)方面越來越受到研究者的關(guān)注［19－21］,尤其在藥物早期發(fā)現(xiàn)中,代謝物研究能夠在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型描繪出完整的代謝輪廓圖,發(fā)現(xiàn)不穩(wěn)定的代謝途徑以及評(píng)估代謝物的安全性,反過來通過化學(xué)途徑修飾母體藥物以改善藥物的穩(wěn)定性,尋找到代謝有利于藥物發(fā)揮最大藥效的結(jié)構(gòu)［22］。然而,盡管LC-MS/MS作為藥物和代謝物定量主要分析技術(shù),但是一些非常基本的問題還沒有得到充分的解決,如串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)被分析物的選擇性,基質(zhì)效應(yīng)(離子抑制或增強(qiáng))的潛在影響等［23］。

圖3動(dòng)物體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)樣品制備分析策略圖

3 總結(jié)

目前,液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)已經(jīng)變成新藥研發(fā)中的重要分析技術(shù)之一,在新合成目標(biāo)化合物或新發(fā)現(xiàn)能夠潛在成為候選藥物的化合物結(jié)構(gòu)鑒定、高通量篩選,隨著新型質(zhì)譜技術(shù)及離子化技術(shù)的不斷改進(jìn)和發(fā)展,樣品前處理技術(shù)的不斷革新,鑒于現(xiàn)有儀器的潛力和可預(yù)見性,從分析能力和數(shù)據(jù)采集到化學(xué)計(jì)量學(xué)以及分析方法驗(yàn)證的瓶頸正在被取代,從自動(dòng)化分析過程到快速、高通量的分析結(jié)果,液質(zhì)聯(lián)用將成為新藥發(fā)現(xiàn)過程不可或缺的分析技術(shù),將越來越多的被應(yīng)用到新藥研發(fā)中。