梁智超， 姬鳳彩， 孫建新， 蔣遠(yuǎn)東， 劉 昕， 阿吉古麗·吐爾洪， 魏后樂(lè)

(新疆醫(yī)科大學(xué)1公共衛(wèi)生學(xué)院， 2動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心， 3護(hù)理學(xué)院， 烏魯木齊 830011)

目前，針對(duì)肝癌的實(shí)驗(yàn)室研究有很多，研究人員常利用大鼠肝癌模型對(duì)肝癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、治療等進(jìn)行研究[1-2]。實(shí)驗(yàn)室研究具有不受時(shí)間限制、個(gè)體差異小、研究對(duì)象數(shù)量容易控制等優(yōu)點(diǎn)，受到廣大研究者的青睞。實(shí)驗(yàn)室研究中常利用肝癌動(dòng)物模型進(jìn)行研究[1]，肝癌動(dòng)物模型中，又以大鼠肝癌模型易操作、成本低廉應(yīng)用最為廣泛[2]。

肝癌模型的制備方法比較多，包括自發(fā)性、誘發(fā)性、移植性、基因工程肝癌模型、注射式肝癌模型。自發(fā)性模型雖然與人類的發(fā)病機(jī)理、發(fā)病過(guò)程很相似，但是腫瘤發(fā)生率比較低且不穩(wěn)定。誘發(fā)性肝癌模型起病隱匿、病程較長(zhǎng)，腫瘤多為彌漫結(jié)節(jié)型，合并或不合并肝硬化?；蚬こ谈伟┠Ｐ蜑楦伟┑幕A(chǔ)理論和臨床研究開辟更為理想的途徑，但技術(shù)要求極高，價(jià)格昂貴[3]。移植性肝癌模型又分為腫瘤組織包埋法和直接注射法，現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)方法均是將大鼠開腹后，進(jìn)行相應(yīng)的操作，手術(shù)后的護(hù)理操作比較繁瑣，但造模周期短，腫瘤發(fā)生部位精確，有利于對(duì)腫瘤組織的觀察[4-5]。

實(shí)驗(yàn)研究中常用到的有誘發(fā)性肝癌模型和移植性肝癌模型[6]。誘發(fā)性肝癌模型的肝癌出現(xiàn)的時(shí)間、部位、病灶數(shù)等的個(gè)體差異比較大，多用于肝癌病因?qū)W、發(fā)生學(xué)、發(fā)病機(jī)制、遺傳學(xué)方面的研究[7-8]。移植法肝癌模型是通過(guò)開腹手術(shù)將瘤塊組織包埋在肝包膜下[9-10]，腫瘤位于肝臟接種部位，呈圓形或橢圓形，膨脹性和浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，腹水發(fā)生率高。此種模型的優(yōu)點(diǎn)是腫瘤生長(zhǎng)在肝臟，與臨床肝癌病例基本相似，實(shí)驗(yàn)周期短，模型易于建立，是研究肝癌局部治療的較好模型[10-11]。兩種肝癌模型制作方法均采用Wistar大鼠[12]，從造模操作方法的難易程度、腫瘤生長(zhǎng)周期、大小、造模過(guò)程中產(chǎn)生的并發(fā)癥、造模的成功率、動(dòng)物生長(zhǎng)狀況等進(jìn)行對(duì)比研究。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)Wistar大鼠，雄性， 70～100 g，30只。購(gòu)自于新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，生產(chǎn)許可證：SCXK(新)2016-0003 。

1.2材料Walker-256細(xì)胞株，購(gòu)自于上海通派生物細(xì)胞庫(kù)，貨號(hào)walker 256細(xì)胞株。

1.3方法

1.3.1 腫瘤組織研磨液的制備 Walker-256細(xì)胞接種 于Wistar大鼠腋下，待腫瘤組織長(zhǎng)出大約1 cm時(shí)，將腫瘤組織取出，剔除纖維包膜及壞死組織，超凈工作臺(tái)中在無(wú)菌平皿中剪碎，將腫瘤組織放入組織研磨器中，加入少量4℃生理鹽水輕輕研磨成勻漿，80目的細(xì)胞篩過(guò)濾成瘤細(xì)胞懸液，用生理鹽水調(diào)細(xì)胞濃度至107個(gè)/mL,臺(tái)盼藍(lán)染色，光鏡下瘤細(xì)胞計(jì)數(shù)，活瘤細(xì)胞>90%即可將試管放入碎冰中備用。

1.3.2 腫瘤細(xì)胞腹水懸液的制備 Walker-256細(xì)胞，接種于Wistar大鼠腹腔，傳代2代后收集腹水，離心，棄去上清液，留試管下層白色腫瘤細(xì)胞液體，將試管放入碎冰中備用。

1.3.3 大鼠分組及模型建立 30只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為3組，腫瘤組織研磨組、腫瘤細(xì)胞腹水懸液組、空白對(duì)照組,每組10只，腫瘤組織研磨組(模型1)采用腫瘤組織研磨得到細(xì)胞懸液注射肝臟造模；腫瘤細(xì)胞腹水懸液組(模型2)采用腫瘤細(xì)胞腹腔接種傳2代后得到的腹水注射肝臟造模；空白對(duì)照組采用0.9%生理鹽水注射肝臟造模。造模前將大鼠用3%的戊巴比妥鈉按照0.1 mL/100 g的劑量，腹腔注射進(jìn)行麻醉。待大鼠進(jìn)入深度麻醉狀態(tài)后，將大鼠仰臥于試驗(yàn)臺(tái)接種造模物質(zhì)。注射部位在大鼠劍突下約0.5 cm，稍偏右側(cè)的位置，注射時(shí)先將此部位的皮膚提起，將針頭刺入皮下，然后再將針頭垂直進(jìn)針刺入肝臟，進(jìn)針深度約0.5 cm，接種完成后拔出針頭，按壓進(jìn)針部位3～5 min。各組大鼠均常規(guī)喂養(yǎng)，每日觀察大鼠的飲食、大小便、腹圍及精神狀態(tài),分組及造模情況見表1。

表1 分組及造模情況

1.3.4 解剖 各組注射造模物質(zhì)后，各組大鼠每日均正常飲食，觀察并記錄動(dòng)物生長(zhǎng)情況，于實(shí)驗(yàn)第21天禁食不禁水，12 h后眼眶靜脈叢取血，分離血清，觀察血液指標(biāo)。頸椎脫白處死大鼠并解剖。取出肝左葉，放入10%的福爾馬林中固定，HE染色法制作病理切片，觀察腫瘤生長(zhǎng)情況。

2 結(jié)果

2.1剖檢觀察結(jié)果腫瘤組織研磨組和腫瘤細(xì)胞腹水懸液組的大鼠在接種造模物質(zhì)第5天后較空白對(duì)照組出現(xiàn)不同程度的豎毛、精神萎靡、活動(dòng)減少、采食量下降、消瘦等狀況，腫瘤組織研磨組中有2只大鼠出現(xiàn)腹水。各組大鼠于造模物質(zhì)接種10 d后頸椎脫臼處死，解剖取出肝臟進(jìn)行觀察?？瞻讓?duì)照組的肝臟為見腫瘤瘤體，腫瘤組織研磨組和腫瘤細(xì)胞腹水懸液組可見略突出于肝臟表面的乳白色菜花樣占位性瘤體，腫瘤組織研磨組的瘤體平均直徑為0.2～0.5 cm，腫瘤細(xì)胞腹水懸液組的瘤體平均直徑為1～2 cm。將瘤體剪開可見瘤體為實(shí)性、奶酪狀乳白色組織,各組造模結(jié)果見表2。

表2 3組造模結(jié)果

注：模型成功為不出現(xiàn)腹水且觀察到占位性瘤體，顯微鏡可觀察到腫瘤細(xì)胞。

2.2病理切片結(jié)果光學(xué)顯微鏡下觀察，腫瘤組織研磨組的肝小葉基本可見，肝細(xì)胞輕微水腫，肝血竇擴(kuò)張，腫瘤細(xì)胞呈團(tuán)塊狀分布，中央靜脈中可見有腫瘤細(xì)胞。腫瘤細(xì)胞腹水懸液組的腫瘤細(xì)胞呈巢狀分布，巢中有不同程度的出血壞死狀況，肝小葉的結(jié)構(gòu)基本破壞，肝細(xì)胞水腫，肝血竇擴(kuò)張，中央靜脈中可見有腫瘤細(xì)胞存在。在400倍的高倍鏡下觀察，兩組模型的腫瘤細(xì)胞為橢圓形，均具有胞核大、強(qiáng)嗜堿性濃染、異型性明顯、有核分裂象、細(xì)胞大小不一、胞質(zhì)量少的特點(diǎn)。兩組模型均可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn),見圖1～4。

圖1 腫瘤組織研磨組肝組織(×400)

圖2 腫瘤細(xì)胞腹水懸液組肝組織(×400)

圖3 腫瘤組織研磨組肝腫瘤細(xì)胞(×1 000)

圖4 腫瘤細(xì)胞腹水懸液組肝腫瘤細(xì)胞(×1 000)

3 討論

3.1大鼠品系和質(zhì)量的選取通過(guò)兩次預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在進(jìn)行Walker-256細(xì)胞腹腔傳代時(shí)必須選取Wistar大鼠才能造模成功。第一次實(shí)驗(yàn)時(shí)使用SD大鼠接種腹腔，并未得到腫瘤腹水。在進(jìn)行腫瘤細(xì)胞肝臟接種時(shí)也必須使用Wistar造模才能成功。本實(shí)驗(yàn)大鼠的質(zhì)量需要控制在70～100 g的范圍內(nèi)，若Walker-256細(xì)胞接種在超過(guò)100 g的Wistar大鼠肝臟內(nèi)，造模成功率很低。

3.2瘤體懸液制備注意事項(xiàng)(1)在采集大鼠腋下瘤體時(shí)需要把握時(shí)機(jī)。 (2)大鼠腋下接種后第10天即可采集瘤體，此時(shí)瘤體大約1 cm大小，手感稍有彈性，剖檢可見瘤體為實(shí)性奶酪樣組織，此時(shí)采集瘤體做細(xì)胞懸液最合適。(3)當(dāng)接種時(shí)間超過(guò)10 d后，瘤體有中空的感覺，剖檢后發(fā)現(xiàn)瘤體中間有血性液體，瘤體邊界呈現(xiàn)灰白色，組織易碎，采用瘤體制作的細(xì)胞懸液在鏡下觀察活細(xì)胞計(jì)數(shù)無(wú)法達(dá)到107個(gè)/mL。

3.3肝臟造模本課題組通過(guò)反復(fù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在進(jìn)行癌細(xì)胞肝臟接種時(shí)，大鼠必須處于深度麻醉狀態(tài)，否則在注射進(jìn)針時(shí)大鼠扭動(dòng)身體將影響接種效果。接種完畢后拔針的同時(shí)壓住進(jìn)針部位3 min以上，否則會(huì)造成造模物質(zhì)逆流進(jìn)入腹腔產(chǎn)生惡性腹水。產(chǎn)生惡性腹水后10 d左右大鼠將會(huì)出現(xiàn)死亡的情況。本次實(shí)驗(yàn)中腫瘤組織研磨組中有2只大鼠造模未成功，剖檢觀察發(fā)現(xiàn)，肝臟上未出現(xiàn)瘤體，腹腔內(nèi)有大量紅色惡性腹水，可能是接種時(shí)針頭未進(jìn)入肝臟，造模物質(zhì)直接進(jìn)入腹腔所致。

3.4瘤體生長(zhǎng)速度本研究通過(guò)對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織研磨組的肝臟瘤體小于腫瘤細(xì)胞腹水懸液組的瘤體。說(shuō)明腫瘤細(xì)胞腹水懸液制作的肝癌模型的瘤體生長(zhǎng)速度大于腫瘤組織研磨組，腫瘤細(xì)胞腹水懸液制作的模型更適合用于與腫瘤生長(zhǎng)和抑制生長(zhǎng)相關(guān)的課題研究，而腫瘤組織研磨得到的細(xì)胞液則更合適用于實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)的研究。由于本次實(shí)驗(yàn)旨在探索肝癌模型制作方法，因此，在接種瘤細(xì)胞第10天時(shí)結(jié)束實(shí)驗(yàn)，未繼續(xù)觀察大鼠在第10天以后的狀態(tài)，以及大鼠因肝癌造成的死亡時(shí)間，這些均有待今后進(jìn)一步研究。

3.5病理切片通過(guò)病理切片的觀察，本研究發(fā)現(xiàn)兩組模型的腫瘤細(xì)胞在形態(tài)和排列上沒有差別。從肝小葉的基本結(jié)構(gòu)觀察，腫瘤組織研磨組的肝小葉比較完整，腫瘤細(xì)胞腹水懸液組的肝小葉基本破壞，說(shuō)明腫瘤細(xì)胞腹水懸液組的肝臟損傷程度更為嚴(yán)重。對(duì)中央靜脈中的細(xì)胞進(jìn)一步觀察后發(fā)現(xiàn)，兩組模型的中央靜脈里均存在有腫瘤細(xì)胞，表明腫瘤細(xì)胞已經(jīng)進(jìn)入血液，并向全身轉(zhuǎn)移，與腫瘤組織研磨組相比較，腫瘤細(xì)胞腹水懸液組的中央靜脈中的腫瘤細(xì)胞更多，提示腫瘤細(xì)胞腹水懸液組的全身轉(zhuǎn)移速度可能更快。