張 會，趙 輝,董丹丹，劉真真，賈 楠，朱元祺，*

(1.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院，山東 青島 266071;2.青島大學(xué)附屬醫(yī)院 檢驗科，山東 青島 266555)

自2001年Yigit等[1]第一個報道產(chǎn)肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(KPC)臨床分離株以來，攜帶blaKPC-2基因腸桿菌在世界各地傳播開來。2007年國內(nèi)Wei等首次報道產(chǎn)KPC-2酶的肺炎克雷伯菌浙江分離株。此后，全國各地陸續(xù)有檢出KPC-2陽性菌株報道[2]。我們收集2017年4月某兒童醫(yī)院分離的碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌株，對其耐藥表型、耐藥基因以及同源性進(jìn)行研究，以便為采取醫(yī)院感染控制措施提供依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1菌株和病人資料9株肺炎克雷伯菌來源于2017年4月分離自某兒童醫(yī)院心血管外科(5株)、心血管科(2株)和新生兒科(2株)住院患兒。對病人的病例資料進(jìn)行回顧性分析，按照2010年1月21日衛(wèi)生部頒布的《醫(yī)院感染診斷標(biāo)準(zhǔn)(試行)》，根據(jù)病例資料判定這9例患兒的感染都屬于醫(yī)院感染。

菌株鑒定和藥敏試驗采用Vitek-2 Compact系統(tǒng)。藥敏結(jié)果判定依據(jù)美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會制定CLSI-M100(2017)標(biāo)準(zhǔn)。儀器質(zhì)控菌株為ATCC25922、ATCC35218、ATCC700603和ATCC27853。

1.2主要儀器和試劑MyCycle型PCR擴(kuò)增儀和CHEF MAPPER XA型脈沖場凝膠電泳儀為美國Bio-RAD公司； HP3400型全自動凝膠成像系統(tǒng)為美國Alpha Innotech公司。基因組提取試劑盒、瓊脂糖、PCR試劑和核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)為大連寶生生物。

1.3耐藥基因的檢測分別檢測碳青霉烯類耐藥基因(blaKPC、blaNDM、blaBIC、blaOXA-48、blaIMP、blaSPM、blaVIM、blaAIM、blaGIM、blaDIM和blaSIM)和超廣譜β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因(blaCTX-M、blaSHV、blaTEM和blaOXA-1)。耐藥基因的PCR擴(kuò)增引物序列和方法參照文獻(xiàn)[3]。引物合成和產(chǎn)物測序由生工(上海)生物技術(shù)有限公司完成。

1.4多位點(diǎn)序列分型按網(wǎng)站(http://bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/klebsiella.html)提供的7個管家基因(gapA、infB、mdh、pgi、phoE、tonB、rpoB)引物序列和擴(kuò)增條件進(jìn)行菌株的多位點(diǎn)序列分型(MLST)。

1.5脈沖場凝膠電泳脈沖場凝膠電泳(PFGE)的具體操作步驟和結(jié)果解釋依據(jù)參考文獻(xiàn)和Tenover規(guī)則[3,4]。利用BioNumerics7.6軟件，依據(jù)Dice系數(shù)和UPGMA聚類對脈沖場凝膠電泳進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1菌株的藥敏和耐藥基因檢測結(jié)果

除了磺胺甲惡唑/甲氧芐啶外， 9株肺炎克雷伯菌對頭孢菌素類、頭霉素類、碳青霉烯酶類、氨基糖苷類和喹諾酮類等抗菌藥物都表現(xiàn)耐藥。經(jīng)PCR擴(kuò)增和測序證實，所有菌株都攜帶blaKPC-2基因，其中8株菌還同時攜帶blaCTX-M-65、blaSHV-12和blaTEM-1B基因。結(jié)果詳見表1。

表1 產(chǎn)碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌對抗菌藥物的藥敏結(jié)果和攜帶的基因

2.2菌株多位點(diǎn)序列分型和脈沖場凝膠電泳結(jié)果

經(jīng)對每株菌7個管家基因的擴(kuò)增、測序和網(wǎng)站比對，除了一株為ST278型外，其他8株菌屬于ST11型。根據(jù)Tenover脈沖場凝膠電泳按條帶解釋規(guī)則，9株肺炎克雷伯菌分為A、B兩個型。其中，H2、H5、H6和H8號菌株為A型，H3、H4和H10號菌株為A1型，H7號菌株為A2型，H1號菌株為B型。A型及其亞型這8株菌的條帶位置及數(shù)目相差小于3條，其多位點(diǎn)序列分型都是ST11型，且相互間脈沖場凝膠電泳聚類分析有92.8%-100%的相似度，這表明存在克隆聚集性。但這8株ST11型與ST278型肺炎克雷伯菌的聚類分析相似度為64.3%，表明存在另一個克隆株。詳見圖1。

注: NO：菌株編號；MLST：多位點(diǎn)序列分型；Date：分離時間；Ward：分離科室；Sample：標(biāo)本類型。

3 討論

Logan等[5]報道目前國際上碳青霉烯酶耐藥腸桿菌(CRE)產(chǎn)生機(jī)制主要是產(chǎn)碳青霉烯酶，ESBLs和/或AmpC合并細(xì)菌膜蛋白結(jié)構(gòu)改變。Ambler分類中的碳青霉烯酶包括A、B和D類酶。KPC是A類中最常見的類型。國外代表株是攜帶blaKPC-2或blaKPC-3的ST258型肺炎克雷伯菌，而國內(nèi)是以攜帶blaKPC-2的ST11型肺炎克雷伯菌最為常見[6]。Tn4401為主要的相關(guān)可移動遺傳元件。B類酶又稱金屬酶，以IMP和NDM為主。IMP主要分布在中國、日本和澳大利亞，其中國內(nèi)以IMP-4和IMP-8多見，常見的相關(guān)可移動遺傳元件有IncL/M、IncA/C和I類整合子等；NDM分布于世界各地，常見相關(guān)移動遺傳元件有IncA/C和ISAba125等。D類酶主要是OXA-48，我國報道不多，常見于日本、歐洲和北非，代表菌是肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌，相關(guān)可移動遺傳元件有IncL/M、Tn1999、IS1999等[7]。

兒童作為特殊群體，由于對四環(huán)素類、喹諾酮類和氨基糖苷類抗生素的使用受到限制，這使臨床在治療兒童感染耐碳青霉烯類腸桿菌時會面對更多的困難。本研究中，8株攜帶blaKPC-2基因的ST11型肺炎克雷伯菌分離自兒童醫(yī)院心血管外科、心血管科和新生兒科的住院患兒，分離時間上相近，耐藥表型一致，脈沖場凝膠電泳條帶分布相差小于3條，根據(jù)醫(yī)院感染診斷標(biāo)準(zhǔn)和Tenover規(guī)則，判斷在這三個科室病房患兒中存在攜帶blaKPC-2肺炎克雷伯菌的暴發(fā)流行。

近年來，國內(nèi)外均有碳青霉烯類耐藥腸桿菌在兒童或新生兒群體中暴發(fā)感染的報道[8,9]。目前的研究顯示，感染多與抗生素的不合理使用、侵入性操作、菌株定植和住院時間延長等因素有關(guān)[10]。由于是回顧性研究，我們沒能采集醫(yī)院科室環(huán)境標(biāo)本，以進(jìn)一步查找感染源和感染途徑。下一步，我們將繼續(xù)進(jìn)行該流行株的基因轉(zhuǎn)移元件及基因環(huán)境的研究。

經(jīng)檢索，盡管有攜帶blaKPC-2基因的ST11型肺炎克雷伯菌散發(fā)和暴發(fā)的病例報道[9]，但沒有與該流行菌株攜帶的其他耐藥基因相一致的報道，即攜帶blaKPC-2、blaCTX-M-65、blaSHV-12和blaTEM-1B基因的ST11型肺炎克雷伯菌引起病房患兒醫(yī)院感染暴發(fā)是國內(nèi)外首次報道。因此，應(yīng)引起臨床重視，并加強(qiáng)對碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細(xì)菌的監(jiān)測和抗生素的合理使用。