王正娟，蘇柳如，葉秀云，林 娟，楊 捷

(福州大學生物科學與工程學院，福建省海洋酶工程重點實驗室，福建 福州 350108)

0 引言

齒毛菌屬(Cerrenasp.)隸屬擔子菌綱(Bssidiomycetes)多孔菌目(Aphyllophorales)多孔菌科(Polyporaceae)，作為一種藥用真菌，它的次生代謝產(chǎn)物具有調(diào)節(jié)免疫、抗氧化、抗病毒、抗癌等生物活性，同時能高效分泌漆酶[1].漆酶(Laccase，EC1.10.3.2)是一種含銅的多酚氧化酶，可催化酚類、多環(huán)芳烴類、甾體激素、生物色素等多種底物氧化，將電子轉移至分子氧，生成唯一的副產(chǎn)物水分子[2].漆酶作為一種高效、環(huán)保的生物催化酶類，在紡織、造紙、食品、有機物合成、生物降解、環(huán)境修復等領域具有重要應用價值[3].

雖然擔子菌綱白腐真菌是最主要的漆酶生產(chǎn)者[4]，但是真菌漆酶的產(chǎn)量在不同種屬和菌株有所不同，大部分野生型菌株漆酶產(chǎn)量低，產(chǎn)酶周期長[3].因此，對產(chǎn)漆酶菌株的產(chǎn)酶機制進行解析及改造，獲得漆酶高產(chǎn)菌株對生產(chǎn)實踐具有重要意義.

絲狀真菌常見的遺傳改造方法，如紫外誘變、基因導入、農(nóng)桿菌轉化等由于細胞壁的存在導致改造效率低[5].因此既無細胞壁阻礙、又保持細胞完整性且具有優(yōu)良再生性能的原生質體轉化法成為了絲狀真菌遺傳轉化的優(yōu)先選擇.原生質體轉化法已被廣泛應用于多種真菌的遺傳操作中，如重傘靈芝(Ganodermamultipileum)[6]、炭黑曲霉菌(Aspergilluscarbonarius)[7]、黑粉菌(Ustilagoesculenta)[8]等.但是由于不同菌株的細胞壁組成有很大不同，甚至同一菌株不同部位的組成也有所不同，因而原生質體的制備沒有標準化的方法，也沒有普遍適用的原生質體轉化法[9].

實驗室前期獲得的Cerrenasp.HYB07菌株，具有漆酶產(chǎn)量高，產(chǎn)酶周期短的特性.本實驗以該菌株為研究對象，潮霉素B抗性基因Hyg作篩選標記，探究影響齒毛菌原生質體制備及再生的多個重要因素，建立PEG介導的原生質體遺傳轉化體系，以獲得穩(wěn)定遺傳的轉化菌株.

1 材料與方法

1.1 材料

齒毛菌Cerrenasp.HYB07菌株，由福建省海洋酶工程重點實驗室保藏； pCAMBIA1302質粒，該質粒攜帶有潮霉素B磷酸轉移酶基因(hygromycin B phosphotransferase,Hyg)和綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)基因.

1.2 試劑

溶壁酶購自廣東微生物研究所； 潮霉素B購自瑞士Roche公司； 真菌DNA提取試劑盒購自美國OMEGA公司； 2×Easy Taq PCR SuperMix購自北京全式金生物技術有限公司； 其余試劑均為分析純.

1.3 原生質體制備

1) 培養(yǎng)基制備.PDA培養(yǎng)基參考文獻[10]制備.YSJ培養(yǎng)基[11]： 麥芽糊精60 g，蛋白胨15 g，KH2PO46 g，MgSO4·7H2O 4.14 g，CaCl20.3 g，NaCl 0.18 g，CuSO4·5H2O 0.062 5 g，ZnSO4·7H2O 0.018 g，VB10.015 g，定容至1 L，pH值范圍4.5～4.8，121 ℃，滅菌30 min.

再生培養(yǎng)基1號： PDA培養(yǎng)基添加穩(wěn)滲劑至終濃度為0.8 mol·L-1，121 ℃，滅菌20 min； 再生培養(yǎng)基2號： YSJ培養(yǎng)基添加穩(wěn)滲劑至終濃度為0.8 mol·L-1，121 ℃，滅菌20 min； 再生培養(yǎng)基3號[12]： 馬鈴薯葡萄糖水24 g，酵母粉2 g，蛋白胨2 g，蔗糖10 g，KH2PO40.46 g，K2HPO41 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，VB10.2 g，瓊脂粉15 g，添加穩(wěn)滲劑至終濃度為0.8 mol·L-1，定容至1 L，121 ℃，滅菌20 min.

2) 菌絲培養(yǎng)方法.取PDA斜面保藏菌種，PDA平板劃線30 ℃活化培養(yǎng)4 d，以直徑0.5 cm打孔器打孔，取3個菌餅至50 mL PDA一級種子液，30 ℃、200 r·min-1培養(yǎng)2 d； 以6%～8%的接種量接一級種子液至100 mL二級種子液，30 ℃、200 r·min-1培養(yǎng)2 d.

3) 原生質體制備.取30 mL培養(yǎng)2 d的二級種子液于50 mL無菌離心管中，4 ℃、12 000 r·min-1離心15 min，棄上清； 無菌水洗滌一次； 穩(wěn)滲劑洗滌一次； 無菌濾紙濾干水分； 準確稱取0.2 g菌絲于4 mL離心管中，加入2 mL一定質量濃度溶壁酶(穩(wěn)滲劑溶解溶壁酶干粉，0.22 μm無菌濾膜過濾)，在一定溫度下80 r·min-1振蕩酶解一定時間； 無菌注射器(內(nèi)塞有滅菌脫脂棉)過濾除菌絲，濾液在4 ℃、8 000 r·min-1離心10 min，棄上清； 沉淀用穩(wěn)滲劑重懸洗滌2次； 加1 mL 0.6 mol·L-1的甘露醇重懸原生質體.

4) 原生質體再生.顯微鏡下用血球計數(shù)板計數(shù)原生質體懸液中的原生質體形成數(shù)(M)，取0.1 mL原生質體懸液輕輕涂布于再生培養(yǎng)基平板上，30 ℃暗箱培養(yǎng)6～8 d，菌落長出后計數(shù)平板菌落數(shù)(A).同時，以用無菌水稀釋的原生質體懸液為對照組，計數(shù)再生平板菌落(B).

5) 不同因素對原生質體制備及再生的影響.采用不同菌齡(24、36、48、60、72 h)的二級種子液菌絲為原料； 選用不同種類穩(wěn)滲劑(0.6 mol·L-1甘露醇、0.6 mol·L-1蔗糖、0.6 mol·L-1KCl)； 以不同質量濃度(10、15、20、25、30 mg·mL-1)溶壁酶，在不同溫度(20、25、30、35、40 ℃)下，酶解不同時間(1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h)制備原生質體； 并在不同種類再生培養(yǎng)基(1、2、3號)上再生培養(yǎng).探索不同因素對齒毛菌原生質體制備及再生的影響.

1.4 原生質體轉化

1) 潮霉素B敏感性實驗.原生質體轉化前配制含有0、10、20、30、40、50 μg·mL-1潮霉素B的PDA平板，涂布1 000 μL齒毛菌二級種子液菌絲，30 ℃恒溫培養(yǎng)6 d后觀察菌絲生長情況，以確定潮霉素B對齒毛菌HYB07的最低抑制濃度.

2) 齒毛菌原生質體轉化.參照Subburaj 等[13]和Yu等[8]的原生質體轉化方法，并加以改良.將新鮮制備的原生質體懸浮于MTC(0.6 mol·L-1甘露醇，10 mmol·L-1Tris-HCl、pH值為6，10 mmol·L-1CaCl2)緩沖液中，使原生質體數(shù)目為1×108個·mL-1； 每100 μL MTC原生質體懸浮液加入1 μg線性化質粒pCAMBIA1302、50 μL PEG緩沖液(400 mg·mL-1PEG 4000以MTC緩沖液溶解，0.22 μm無菌濾膜過濾)，冰浴30 min； 加入1 mL PEG緩沖液，25 ℃水浴15 min.將混合液加入5 mL液體再生培養(yǎng)基中，30 ℃、120 r·min-1培養(yǎng)12 h后涂布于含最低抑制濃度潮霉素B的再生平板上； 30 ℃培養(yǎng)，待菌落再生后挑取單菌落于潮霉素B抗性PDA平板上復篩.

3) 齒毛菌轉化子鑒定.挑取在復篩平板上生長的擬轉化子單菌落進行種子液培養(yǎng)，以未轉化齒毛菌為對照.收集二級種子液菌絲，采用OMEGA試劑盒提取基因組DNA.以基因組DNA為模板，PCR擴增Hyg和GFP基因，擴增片段大小分別為1 026 bp和750 bp.Hyg基因上游引物Hyg-F： CTATTTCTTTGCCCTCGGAC，Hyg基因下游引物Hyg-R： ATGAAAAAGCCTGAACTCACC；GFP基因上游引物GFP-F： GATCTGACTAGTAAAGGAGAAGAAC，GFP基因下游引物GFP-R： TCACACGTGGTGGTGGTGGT.引物由上海Invitrogen有限公司合成.反應條件： 94 ℃預變形5 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)，72 ℃延伸10 min.

2 結果與討論

2.1 原生質體制備及再生

2.1.1 菌齡對齒毛菌原生質體制備及再生的影響

不同菌齡的菌絲，其細胞壁結構組成有所不同，對酶的敏感程度也不同，故原生質體制備時形成數(shù)目也不同.幼嫩菌絲的細胞壁易被酶解形成原生質體，但并非菌絲越幼嫩越利于酶解[12].選取不同菌齡的菌絲制備原生質體，原生質體形成數(shù)和再生率如圖1所示.由圖1結果可知，隨著菌齡增大，原生質體形成數(shù)和再生率也隨之增加，48 h菌齡的原生質體形成數(shù)和再生率最高； 隨著菌齡繼續(xù)增大，原生質體形成數(shù)和再生率迅速下降.因此該齒毛菌原生質體形成及再生的最佳菌齡為48 h.盧明峰等[14]制備絲狀真菌AL18原生質體時的最佳菌齡亦為48 h，與本實驗結果一致.

2.1.2 穩(wěn)滲劑對齒毛菌原生質體制備及再生的影響

真菌細胞壁被破壞后形成的原生質體需懸浮于高濃度穩(wěn)滲劑中維持原生質體細胞膜內(nèi)外滲透壓平衡.菌株種屬不同，所適應的穩(wěn)滲劑種類亦不同.不同種類的穩(wěn)滲劑對原生質體形成數(shù)及再生率的影響如圖2所示.圖2結果表明，不同種類穩(wěn)滲劑對齒毛菌原生質體形成數(shù)和再生率的影響明顯不同.其中，原生質體制備數(shù)： 甘露醇>KCl>蔗糖； 再生率： 蔗糖>甘露醇>KCl.雖然以甘露醇做穩(wěn)滲劑時原生質體的形成數(shù)最多，但再生率并不是最高.而蔗糖作穩(wěn)滲劑時盡管原生質體形成數(shù)最少，但是其再生率卻最高.由此可知，以甘露醇作穩(wěn)滲劑時原生質體的制備效果最佳； 以蔗糖作穩(wěn)滲劑時原生質體的再生效果最佳.

圖1 不同菌齡對原生質體制備及再生的影響Fig.1 Effect of different hypha on protoplast’s production and regeneration

圖2 不同穩(wěn)滲劑對原生質體制備及再生的影響Fig.2 Effect of different osmoticum on protoplast’s production and regeneration

糖類、糖醇類、無機鹽類等多種穩(wěn)滲劑被用于真菌原生質體制備.雖然一般認為無機鹽類適用于絲狀真菌，糖類和糖醇類適用于酵母和高等植物，但是目前無法確切解釋某種化學試劑作為穩(wěn)滲劑適用于某一特定菌株[9].孫墨可等[15]的研究表明在靈芝(Ganodermalingzhi)原生質體制備時，以0.4 mol·L-1甘露醇作穩(wěn)滲劑時原生質體產(chǎn)量最高.盧明峰等[14]在絲狀真菌AL18原生質體制備及再生的研究中發(fā)現(xiàn)，以0.6 mol·L-1MgSO4·7H2O作為穩(wěn)滲劑時原生質體形成數(shù)最佳，而以0.6 mol·L-1蔗糖作穩(wěn)滲劑原生質體再生效果最好.表明原生質體制備及再生的最適穩(wěn)滲劑種類不一定一致，這與本研究結果相同.蔗糖作為穩(wěn)滲劑利于原生質體的再生，可能是它不單維持滲透壓平衡，還可為原生質體再生提供碳源.

2.1.3 溶壁酶質量濃度對齒毛菌原生質體制備及再生的影響

真菌細胞壁主要由纖維素、半纖維素、葡聚糖、甘露聚糖、幾丁質、蛋白質及脂類等組成[16].溶壁酶可破壞細胞壁結構，釋放原生質體.適當?shù)娜鼙诿纲|量濃度對原生質體形成具有重要影響.溶壁酶質量濃度過高，會破壞原生質體細胞膜，從而影響原生質體再生； 溶壁酶質量濃度太低，原生質體形成數(shù)少，原生質體再生率低[5].不同質量濃度溶壁酶對原生質體形成數(shù)和再生率的影響如圖3所示.由圖3可知，原生質體形成數(shù)和再生率都隨溶壁酶質量濃度的增加呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢.溶壁酶質量濃度為20 mg·mL-1時原生質體形成數(shù)最多，再生率也最高，故原生質體制備及再生的最佳溶壁酶質量濃度為20 mg·mL-1.陳鵬等[17]研究表明用20 mg·mL-1溶壁酶制備金針菇(Flammulinavelutipes)原生質體的形成數(shù)最多，與本實驗結果一致.

2.1.4 酶解溫度對齒毛菌原生質體制備及再生的影響

酶解溫度直接影響酶促反應速率.不同菌株具有不同的最適酶解溫度，過高或過低都會影響酶活性，亦會影響原生質體形成及再生.不同酶解溫度對原生質體形成數(shù)和再生率的影響如圖4所示.由圖4可知，隨酶解溫度的升高，原生質體制備數(shù)和再生率也隨之上升，當酶解溫度到達30 ℃時，原生質體制備數(shù)和再生率達最高.隨酶解溫度的繼續(xù)升高，原生質體制備數(shù)和再生率銳減.故齒毛菌原生質體制備及再生的最佳酶解溫度為30 ℃.

圖3 不同溶壁酶質量濃度對原生質體制備及再生的影響Fig.3 Effect of different lywallzyme mass concentration on protoplast’s production and regeneration

圖4 不同酶解溫度對原生質體制備及再生的影響Fig.4 Effect of different enzymolysis temperature on protoplast’s production and regeneration

邢振楠等[18]用溶壁酶裂解香菇(Lentinulaedodes)菌絲，酶解溫度為30 ℃時，原生質體制備及再生效果最佳.陳鵬等[17]利用溶壁酶制備金針菇(Flammulinavelutipes)原生質體，酶解溫度為26 ℃時，原生質體制備率最高.因此溶壁酶作用于不同菌株，其最適酶解溫度亦有所不同.

2.1.5 酶解時間對齒毛菌原生質體制備及再生的影響

適當?shù)拿附鈺r間也是影響原生質體制備的重要因素之一.酶解時間過短，細胞壁裂解不完全； 時間過長，細胞膜受損傷，原生質體破裂[19].不同酶解時間對原生質體形成數(shù)和再生率的影響如圖5所示.由圖5可知，隨酶解時間的逐漸增加，原生質體形成數(shù)和再生率亦逐漸升高.當酶解時間為3 h時，原生質體形成數(shù)和再生率最高； 之后隨酶解時間的延長，原生質體形成數(shù)和再生率都明顯下降.因此，3 h為原生質體制備及再生的最佳酶解時間.

陳鵬等[17]研究表明，金針菇(Flammulinavelutipes)以20 mg·mL-1溶壁酶酶解4 h，原生質體制備率最高.盧月霞等[20]利用溶壁酶制備雞腿菇(Coprinuscomotus)原生質體，酶解時間為3 h時，原生質體形成數(shù)最多.可見，不同菌株原生質體制備的最適酶解時長不同.

2.1.6 再生培養(yǎng)基對齒毛菌再生的影響

本實驗以甘露醇為穩(wěn)滲劑制備原生質體，以蔗糖為穩(wěn)滲劑配制1、2、3號3種再生培養(yǎng)基對原生質體進行再生培養(yǎng)，結果如圖6所示.圖6結果表明在2號再生培養(yǎng)基中原生質體再生率最高，3號再生培養(yǎng)基次之，1號再生培養(yǎng)基再生率最低.可能是2號再生培養(yǎng)基富含碳源氮源及微量元素，有利于齒毛菌的再生.

圖5 不同酶解時間對原生質體制備及再生的影響Fig.5 Effect of different enzymolysis duration on protoplast’s production and regeneration

圖6 不同再生培養(yǎng)基對再生的影響Fig.6 Effect of different regeneration medium on protoplast’s production and regeneration

2.2 齒毛菌原生質體轉化

2.2.1 潮霉素B敏感性測試

真菌遺傳轉化體系中，以抗生素抗性做篩選標記時，受體菌株對抗生素的敏感性十分重要.潮霉素B對大多數(shù)真菌都有較強的抑制作用，因此真菌遺傳轉化過程中常選擇攜帶潮霉素B抗性基因的載體進行轉化，選擇合適的潮霉素B質量濃度對轉化子進行初篩和復篩.不同菌株對潮霉素B的敏感性不同.孫墨可等[15]研究表明，靈芝(Ganodermalingzhi)的潮霉素B最小受抑制質量濃度為40 μg·mL-1； 李剛等[21]研究表明赤靈芝(Ganodermalucidum)原生質體轉化過程中，菌絲受100 μg·mL-1潮霉素B的抑制； Stephan 等[22]篩選雙色蠟蘑(Laccariabicolor)轉化子時的潮霉素B質量濃度為300 μg·mL-1.

實驗中，齒毛菌菌絲在潮霉素B質量濃度為10、20 μg·mL-1的PDA平板上生長緩慢，在潮霉素B質量濃度為30 μg·mL-1的PDA平板上生長極緩慢，在潮霉素B質量濃度為40、50 μg·mL-1的PDA平板上生長完全受抑制.因此，確定齒毛菌菌絲生長最小受抑制潮霉素B質量濃度為40 μ·mL-1，本實驗選用齒毛菌轉化實驗的篩選抗性為40 μg·mL-1潮霉素B.

2.2.2 原生質體轉化

PEG介導質粒pCAMBIA1302轉化齒毛菌原生質體后，涂布于含40 μg·mL-1潮霉素B的2號再生平板上，30 ℃暗箱培養(yǎng)7 d再生出菌落.挑取再生單菌落至含40 μg·mL-1潮霉素B的PDA平板上，以未轉化的齒毛菌為對照.轉化子因攜帶有潮霉素B抗性基因，能夠在40 μg·mL-1潮霉素B的抗性平板上正常生長，而未轉化菌株無法生長.挑取在40 μg·mL-1潮霉素B的抗性平板上生長良好的菌株，轉接至含50 μg·mL-1潮霉素B的抗性平板上進行復篩.

2.2.3 轉化子PCR鑒定

挑取復篩平板上生長良好的菌株在抗性平板上劃線擴大培養(yǎng)，收集二級種子液菌絲提取基因組DNA，PCR擴增Hyg和GFP基因驗證轉化子.陽性轉化子攜帶Hyg和GFP基因，陰性對照(未轉化菌株)無Hyg和GFP基因.從40個擬轉化子中最終驗證獲得兩個陽性轉化子，PCR驗證結果如圖7所示.1號和2號轉化子均出現(xiàn)1 026 bp大小的Hyg基因條帶和750 bp大小的GFP基因條帶，與質粒pCAMBIA1302陽性對照條帶大小一致，而陰性對照未出現(xiàn)條帶，表明質粒被成功轉入齒毛菌中.

Jiang等[23]研究發(fā)現(xiàn)，在立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)的遺傳轉化中，以潮霉素為抗性標記時，未轉化菌株出現(xiàn)了較高的耐藥性，這可能與其分泌的漆酶相關.漆酶能夠降解多種化合物，對多種抗生素也具有降解作用[24].本實驗轉化子鑒定時假陽性率較高，可能與齒毛菌高效分泌漆酶，導致出現(xiàn)耐藥性有關.也可能是由于菌絲簇的存在，使未轉化菌株對潮霉素的耐受性提升，故在抗性平板上生長.

2.2.4 轉化子遺傳穩(wěn)定性檢測

陽性轉化子，在無抗性PDA平板連續(xù)傳代5次，一次時長為5 d，最后轉接到含50 μg·mL-1潮霉素B抗性的PDA平板培養(yǎng)基上點種培養(yǎng)4 d，結果如圖8所示.1號和2號陽性轉化子經(jīng)過5次傳代后，在含50 μg·mL-1潮霉素B抗性培養(yǎng)基上生長良好，而未轉化的HYB07菌株則不能生長，由此可知轉化子對潮霉素B仍具有抗性.通過此方法驗證表明潮霉素B基因隨機插入突變體在有絲分裂過程中穩(wěn)定遺傳.

圖8 陽性轉化子遺傳穩(wěn)定性Fig.8 Genetic stability of positive transformants

孫墨可等[15]利用PEG成功對靈芝(Ganodermalingzhi)原生質體進行了轉化，其轉化率為每微克質粒DNA轉化3～4個轉化子； 李剛等[21]通過PEG介導外源基因轉入赤靈芝(Ganodermalucidum)原生質體中，其轉化效率為每微克質粒DNA轉化5～6個轉化子； Chou等[6]利用PEG介導重傘靈芝(Ganodermamultipileum)原生質體轉化的轉化率僅為每微克質粒DNA轉化0.1個轉化子.可見多孔菌科真菌原生質體轉化效率較低，原生質體轉化效率可能與菌體種特異性相關.另有研究表明，裂褶菌屬(Schizophyllumcommune)富含AT的區(qū)域可能影響轉化子獲得潮霉素B抗性基因[25]； 灰蓋鬼傘菌(Coprinopsiscinerea)中N末端的兩個氨基酸殘基可能抑制潮霉素B基因的表達[26].可見種屬特異性使獲得潮霉素抗性基因的難易程度也不同.因此在后續(xù)實驗中，還需要對齒毛菌原生質體轉化的條件做進一步優(yōu)化，從而降低假陽性比率，提升轉化效率.

3 結語

齒毛菌以0.6 mol·L-1甘露醇為穩(wěn)滲劑，20 mg·mL-1溶壁酶于30 ℃酶解2 d菌齡的菌絲3 h，其原生質體形成數(shù)可達1×108個·mL-1.以甘露醇為穩(wěn)滲劑，最優(yōu)條件下制備的原生質體，在以蔗糖為穩(wěn)滲劑的2號再生培養(yǎng)基中再生率最高，為0.1%.利用PEG介導齒毛菌原生質體轉化，在40 μg·mL-1潮霉素B抗性平板上成功篩選到穩(wěn)定遺傳的轉化子，成功建立了齒毛菌原生質體遺傳轉化體系.該遺傳轉化方法的建立可為齒毛菌的基因改造、漆酶生產(chǎn)調(diào)控機制、次生代謝藥物合成機理等研究提供技術支持.