乳腺癌中GRB7與HER2表達(dá)的相關(guān)性研究

王 潔 周 兵

HER2(人類表皮生長(zhǎng)因子受體蛋白2)在的浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中陽(yáng)性表達(dá)，已經(jīng)成為曲妥珠單抗的治療靶點(diǎn)，并已廣泛應(yīng)用于臨床，但因費(fèi)用昂貴和心臟毒性等副作用一直在存在較大的爭(zhēng)議[1]。因此，尋找乳腺癌新的治療靶點(diǎn)正成為熱點(diǎn)，GRB7(生長(zhǎng)因子受體結(jié)合蛋白-7基因)作為與HER2一樣同時(shí)位于17號(hào)染色體長(zhǎng)臂上的1區(qū)2帶-2區(qū)1帶(17q12-21)的基因位點(diǎn)，被認(rèn)為與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展存在密切的相關(guān)性。而在乳腺癌中有關(guān)于GRB7與HER2的關(guān)系國(guó)外研究得較少，國(guó)內(nèi)鮮見相關(guān)報(bào)道[2]?，F(xiàn)本文通過(guò)IHC與FISH法檢測(cè)乳腺癌患者GRB7蛋白與HER2基因及蛋白表達(dá)，并探討它們之間的相關(guān)性，為今后的乳腺癌患者治療選擇合適的個(gè)體化治療方案提供分子理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本收集

選取九江市第一人民醫(yī)院病理科2011年6月到2016年6月間，未經(jīng)放化療的乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌存檔組織標(biāo)本110例為實(shí)驗(yàn)組，均為女性患者，年齡22～61歲，平均(44.2±2.7)歲。同時(shí)隨機(jī)選取20例實(shí)驗(yàn)組的癌旁正常乳腺組織設(shè)為對(duì)照組。選取的對(duì)照組為實(shí)驗(yàn)組癌旁組織，存在可比性。

1.2 試劑及方法

IHC檢測(cè)。GRB7鼠抗人單克隆抗體(工作濃度1:100)購(gòu)于艾博康上海貿(mào)易有限公司。Her2為北京中衫金橋生物有限公司產(chǎn)品。所有乳腺癌蠟塊標(biāo)本均為臨床、影像及高年資病理醫(yī)生確診，常規(guī)石蠟4 μm切片，按試劑盒說(shuō)明逐步SP法免疫組化染色，實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組均采用同種處理方法，用PBS 液替代一抗作陰性對(duì)照，最后常規(guī)鏡檢。

FISH檢測(cè)。HER2基因的檢測(cè)試劑盒購(gòu)自于北京金菩嘉公司，所有操作按照試劑盒步驟，白片組織脫蠟、脫二甲苯后，胃蛋白酶孵育15 min，再次洗滌、干燥后，加入10 μl探針，雜交儀中37 ℃過(guò)夜，72 ℃暗室干燥，加入10 μl DAPI顯色液。正常乳腺組織和對(duì)照片同時(shí)作為陰陽(yáng)對(duì)照，熒光顯微鏡鏡檢。

1.3 結(jié)果的判斷

免疫組化判斷依據(jù)美國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)ASCO分級(jí)對(duì)HER2和GRB7行結(jié)果判讀。HER2陽(yáng)性呈棕黃色定位于包膜：腫瘤細(xì)胞膜染色占比≤10%、微弱不完整膜染色占比≥10%、弱完整膜染色占比≥10%、強(qiáng)完整膜陽(yáng)性占比≥10%，分別計(jì)數(shù)(0～3+)。GRB7陽(yáng)性呈棕黃色定位于包膜或胞質(zhì)：腫瘤細(xì)胞染色陽(yáng)性占比<5%、5%～25%、26%～50%、>50%，分別計(jì)數(shù)(0～3+)。

FISH結(jié)果判斷依據(jù)美國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)ASCO的HER2檢測(cè)指南，根據(jù)試劑盒DNA探針說(shuō)明，綠色信號(hào)為17號(hào)染色體絲粒(CEP17)，紅色信號(hào)為HER2基因。隨機(jī)計(jì)數(shù)30個(gè)腫瘤細(xì)胞，HER2/CEP17信號(hào)比≥2被認(rèn)為陽(yáng)性，即HER2基因存在擴(kuò)增； HER2/CEP17信號(hào)比<2為陰性，HER2基因無(wú)擴(kuò)增。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件處理并行相關(guān)性分析，P<0.05認(rèn)為統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HER2蛋白表達(dá)水平及基因擴(kuò)增情況

免疫組化檢測(cè)乳腺癌HER2表達(dá)評(píng)分0～1、2+和3+的病例占比分別為49.1%(54/110)、23.6%(26/110)和27.3%(30/110)，正常乳腺組織HER2不表達(dá)；FISH檢測(cè)共計(jì)36例乳腺癌病例出現(xiàn)基因擴(kuò)增,74例未擴(kuò)增，與免疫組化HER2評(píng)分0～1、2+和3+符合率分別為0、30.8%和93.3%。HER2的免疫組化及FISH檢測(cè)結(jié)構(gòu)存在正相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)γ=0.78(P<0.05)(表1)。

表1 HER2表達(dá)和擴(kuò)增情況及相關(guān)性/例

2.2 GRB7蛋白表達(dá)及與HER2的相關(guān)性

110例乳腺癌標(biāo)本中免疫組化方法檢測(cè)GRB7表達(dá)評(píng)分0～1和2～3+的病例占比分別為51.8%(57/110)和48.2%(53/110)，正常乳腺組織表達(dá)1例占比為5%(1/20)。Her2表達(dá)與GRB7表達(dá)存在強(qiáng)相關(guān)性 (γ=0.83，P<0.05)(表2)。

表2 乳腺癌中HER2和GRB7表達(dá)的相關(guān)性/例

3 討論

乳腺癌治療主要以傳統(tǒng)的手術(shù)、放化療、內(nèi)分泌治療為主，近年來(lái)已明確了曲妥珠單抗為HER2+乳腺癌患者的治療靶點(diǎn)，聯(lián)合輔助化療可以明顯提高h(yuǎn)er2陽(yáng)性乳腺癌的療效[3]。但是未擴(kuò)增的17號(hào)染色體HER2陰性，及轉(zhuǎn)移性血清HER2陽(yáng)性的乳腺癌患者預(yù)后仍不佳[4-5]，因此，針對(duì)乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)特點(diǎn)與乳腺癌治療及預(yù)后判定的靶點(diǎn)治療成為當(dāng)今乳腺癌研究的熱點(diǎn)[6]。具有療效好，毒副反應(yīng)小的特點(diǎn)，能大大的提高病人的生活質(zhì)量，降低死亡率。給目前乳腺癌的治療提供了1個(gè)很好的方向。而乳腺癌的發(fā)生被證明與人類17號(hào)染色體存在密切關(guān)系。17號(hào)染色體由8100萬(wàn)個(gè)堿基構(gòu)成，含有1500個(gè)基因片段，其DNA編碼存在多片段重復(fù)性，參與了多種蛋白表達(dá)及基因編碼[7]。尤其在位于17號(hào)染色體長(zhǎng)臂上的1區(qū)2帶-2區(qū)1帶(17q12-21)的基因位點(diǎn)最為密集，有多個(gè)與乳腺癌表達(dá)相關(guān)的基因位點(diǎn)(HER2、GRB7、TOP2A、RARA、LASP1、STARD3等)，被認(rèn)為與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展存在密切的相關(guān)性[8]。HER2為目前研究的比較透徹的一類具有酪氨酸激酶活性的高同源性蛋白質(zhì)，由結(jié)合區(qū)和胞內(nèi)區(qū)組成。分子量約為185KD，包含23個(gè)氨基酸。被認(rèn)為能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、抑制腫瘤細(xì)胞凋亡；并能通過(guò)上調(diào)(VEGF)/(VPF)削弱機(jī)體屏障，促進(jìn)腫瘤內(nèi)新生血管生長(zhǎng)，從而增加惡性腫瘤的侵襲力[9]。GRB7(為最近發(fā)現(xiàn)的一類編碼的多域的接頭蛋白,含有535個(gè)氨基酸殘基,有3種功能區(qū)域分別為富含脯氨酸的功能區(qū)N端、中間的GM區(qū)和位于C末端的SH2結(jié)構(gòu)域[10]。人體內(nèi)Grb7在胰腺中高表達(dá)，認(rèn)為Grb7廣泛參與表皮生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體和胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等各種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，研究發(fā)現(xiàn)在很多腫瘤組織中，尤其是在侵襲的乳腺癌中GRB7蛋白處于高表達(dá)狀態(tài)，其蛋白域相互作用及功能特異性有希望成為乳腺癌新的化療靶點(diǎn)[11]。

本研究通過(guò)免疫組化方法測(cè)定110例HER2和GRB7蛋白表達(dá)狀態(tài)，并應(yīng)用FISH檢測(cè)HER2 基因擴(kuò)增的情況并初步探討兩者之間的關(guān)系。發(fā)現(xiàn)HER2免疫組化2+、3+陽(yáng)性表達(dá)率占所有乳腺癌檢查的50.9%，而GRB7免疫組化2+、3+陽(yáng)性表達(dá)率占所有乳腺癌檢查的48.2%，雖然HER2與GRB7在腫瘤細(xì)胞中的定位存在著一定的差異，但兩者間顯著陽(yáng)性表達(dá)率相近，通過(guò)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)γ=0.83，提示兩者在免疫組化表達(dá)存在這明顯的正相關(guān)，GRB7蛋白的表達(dá)可能依賴HER2的擴(kuò)增與表達(dá)。有研究表明乳腺癌細(xì)胞在表皮生長(zhǎng)因子的刺激下，與表皮生長(zhǎng)因子受體結(jié)合的GRB7絡(luò)氨酸被鱗酸化，并成為Ras-GTP酶的結(jié)合點(diǎn)，進(jìn)而激活下游的ERK相關(guān)的信號(hào)通路，從而刺激腫瘤生長(zhǎng)[2]。110例乳腺癌病理FISH檢測(cè)結(jié)果顯示基因擴(kuò)增的共計(jì)36例，其基因擴(kuò)增多見于HER2免疫組化2+、3+陽(yáng)性病例。通過(guò)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)γ=0.78，證實(shí)免疫組化及FISH檢測(cè)結(jié)果存在強(qiáng)相關(guān)性，這與目前大多數(shù)學(xué)者已發(fā)表的研究結(jié)果類似，進(jìn)一步明確HER2蛋白和基因的關(guān)系；本次研究通過(guò)初步探討HER2與GRB7在乳腺癌中表達(dá)的關(guān)系，印證了乳腺癌HER2蛋白與基因擴(kuò)增的一致性，且蛋白的表達(dá)依賴HER2的擴(kuò)增與表達(dá)。同時(shí)顯示HER2與GRB7在乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)存在強(qiáng)相關(guān)性，提示GRB7在乳腺癌浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，如抑制腫瘤細(xì)胞中GRB7的高表達(dá)，或許可以提高HER2抑制劑的抑制效果，GRB7可能會(huì)成為1個(gè)重要的靶分子，有效抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移、延長(zhǎng)患者生命。

但本研究有一定局限性，GRB7的基因擴(kuò)增未能完成，因有研究表面乳腺癌細(xì)胞內(nèi)的GRB7基因與mRNA轉(zhuǎn)錄水平及基因的拷貝數(shù)密切相關(guān)，進(jìn)而促進(jìn)癌細(xì)胞蛋白表達(dá)[8]。這將是我們接下來(lái)的研究方向，明確GRB7蛋白的作用，構(gòu)建出GRB7參與細(xì)胞信號(hào)完整通路，為腫瘤的靶向治療提供新的方向。