不同基因分型乳腺癌中Caspase-3、XIAP、Smac表達(dá)情況及與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

王振威 肖 剛 劉 威 李小江 趙永魁

乳腺癌具有高度異質(zhì)性特點(diǎn)，不同基因型乳腺癌患者治療反應(yīng)不盡相同[1]。研究表明[2]，細(xì)胞凋亡異常與腫瘤發(fā)生發(fā)展存在密切關(guān)系。天冬氨酸酶3(Caspase-3)[3]、X連鎖凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein,XIAP)[4]、第二個(gè)線粒體衍生半胱氨酸蛋白酶激動(dòng)劑(Second mitochondrial activator of caspase,Smac)[5]是細(xì)胞凋亡過(guò)程中重要調(diào)控因子，三者在乳腺癌組織中表達(dá)缺乏細(xì)致性研究。本研究旨在探討Caspase-3、XIAP、Smac在不同基因分型乳腺癌中表達(dá)情況，及其與乳腺癌臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

選取2015年2月至2017年2月于我院行手術(shù)切除治療的73例乳腺癌患者為研究對(duì)象，所有受試者術(shù)前均未接受任何放化療及內(nèi)分泌治療，年齡27～73歲，平均年齡(51.43±6.27)歲，根據(jù)國(guó)際乳腺癌共識(shí)(2013年)[6]進(jìn)行基因分型，其中Luminal A型30例，Luminal B型12例，HER-2過(guò)表達(dá)型9例，BLBC型22例，高分化21例，低分化52例，TNM分期Ⅰ期21例，Ⅱ期34例，Ⅲ期18例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者26例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者47例。

同期取20例癌旁正常乳腺組織(距癌灶邊緣4 cm以上)作為對(duì)照組，本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，且標(biāo)本采集符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》。

1.2 主要試劑

免疫組織化學(xué)(streptavidin-perosidase,SP)試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine,DAB)顯色試劑盒，購(gòu)自于北京中杉金橋技術(shù)公司；Caspase-3、XIAP、Smac兔抗人單克隆抗體、PBS緩沖液，購(gòu)自于上海天呈生物用品超市。

1.3 方法

乳腺組織標(biāo)本離體后，立即使用液氮速凍，于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。?biāo)本經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋，制作4 μm石蠟切片，采用SP方法，DAB顯色，應(yīng)用SP試劑盒檢測(cè)石蠟切片中Caspase-3、XIAP、Smac表達(dá)情況，陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照，PBS緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照，具體操作嚴(yán)格按照使用說(shuō)明進(jìn)行。

結(jié)果判定：以細(xì)胞膜/細(xì)胞質(zhì)/細(xì)胞核內(nèi)染色呈現(xiàn)棕黃色顆粒者為陽(yáng)性表達(dá)。陽(yáng)性細(xì)胞所占比例評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：≤5%為0分；6%～25%為1分；26%～50%為2分；51%～75%為3分；>75%為4分。染色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)色為0分；淡黃色為1分；棕黃色為2分；棕褐色為3分。由二位病理醫(yī)師雙盲閱片，以細(xì)胞染色強(qiáng)度與陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比評(píng)分乘積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以<1分為陰性(-)；≥1分為陽(yáng)性(+)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，兩組計(jì)數(shù)資料比較采用卡方檢驗(yàn)，不同基因分型中Caspase-3、XIAP、Smac蛋白表達(dá)水平比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)中Kruskal-Wallis H秩和檢驗(yàn)，三者表達(dá)與乳腺癌組織病理參數(shù)之間關(guān)系采用Mann-whitney U秩和檢驗(yàn)，Caspase-3、XIAP、Smac蛋白表達(dá)之間相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)性分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組Caspase-3、XIAP、Smac蛋白表達(dá)水平比較

乳腺癌組織中Caspase-3蛋白陽(yáng)性信號(hào)主要定位于細(xì)胞質(zhì)或者細(xì)胞核。Caspase-3蛋白在乳腺癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率為39.73%，明顯低于癌旁正常乳腺組織陽(yáng)性表達(dá)率90.00%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。具體結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 兩組Caspase-3蛋白表達(dá)比較/例

乳腺癌組織中XIAP蛋白陽(yáng)性信號(hào)主要定位于細(xì)胞質(zhì)。乳腺癌組織中XIAP蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為86.30%，明顯高于癌旁正常乳腺組織XIAP蛋白陽(yáng)性表達(dá)率(40.00%)(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 兩組XIAP蛋白表達(dá)比較/例

乳腺癌組織中Smac蛋白陽(yáng)性信號(hào)主要定位于細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜。乳腺癌組織中Smac蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為31.51%，明顯低于癌旁正常乳腺組織Caspase-3蛋白陽(yáng)性表達(dá)率95.00%(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 兩組Smac蛋白表達(dá)比較/例

2.2 不同基因分型乳腺癌組織中Caspase-3、XIAP、Smac蛋白表達(dá)水平比較

Caspase-3、XIAP、Smac蛋白表達(dá)在Luminal A型、HER-2過(guò)表達(dá)型、BLBC型之間兩兩比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。具體結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 不同基因分型乳腺癌組織中Caspase-3、XIAP、Smac蛋白表達(dá)水平比較結(jié)果(例，%)

2.3 Caspase-3、XIAP、Smac表達(dá)與乳腺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

Caspase-3、XIAP、Smac蛋白表達(dá)與乳腺癌患者年齡、腫瘤大小、絕經(jīng)情況無(wú)關(guān)(P>0.05)，與TNM分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)。具體結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 Caspase-3、XIAP、Smac表達(dá)與乳腺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系(例，%)

2.4 乳腺癌組織中Caspase-3、XIAP、Smac表達(dá)相關(guān)性分析

Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示，乳腺癌組織中Caspase-3與XIAP蛋白表達(dá)呈明顯負(fù)相關(guān)(γ=-0.796,P<0.01)，與Smac蛋白表達(dá)呈明顯正相關(guān)(γ=0.803,P<0.01)，XIAP與Smac蛋白表達(dá)呈明顯負(fù)相關(guān)(γ=-0.712,P<0.01)。

3 討論

乳腺癌是臨床上女性最為常見(jiàn)的惡性腫瘤，全球范圍內(nèi)發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)，給女性身體健康及生命安全造成了巨大威脅[7]。研究表明[8]，不同基因分型乳腺癌疾病進(jìn)程、流行病學(xué)危險(xiǎn)因素、治療反應(yīng)等不盡相同。目前臨床根據(jù)PR、ER、HER-2、TNM分期、組織分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等腫瘤指標(biāo)指導(dǎo)患者治療，但尋找更為精確的新型分子標(biāo)志物，為乳腺癌患者設(shè)計(jì)新型治療方式，提高患者臨床療效，仍然是目前乳腺癌臨床研究的重大難點(diǎn)及熱點(diǎn)。

Caspase-3是1種重要半胱氨酸蛋白酶，處于機(jī)體細(xì)胞凋亡核心位置，其高表達(dá)水平可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，是機(jī)體中重要的死亡蛋白[9]。細(xì)胞凋亡途徑中，各種起始因子最終在Caspase-3會(huì)合，引發(fā)細(xì)胞結(jié)構(gòu)水解，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡發(fā)生，Caspase-3作為細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)的必經(jīng)之路，是細(xì)胞凋亡的1個(gè)關(guān)鍵調(diào)控點(diǎn)。研究表明[10]，Caspase-3在肝癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌等多種惡性腫瘤中異常低表達(dá)，說(shuō)明其活性抑制導(dǎo)致機(jī)體細(xì)胞凋亡發(fā)生障礙，細(xì)胞增殖與凋亡動(dòng)態(tài)平衡失調(diào)，誘發(fā)腫瘤發(fā)生及發(fā)展。楊勝利等[11]研究結(jié)果顯示，Caspase-3蛋白在原發(fā)性浸潤(rùn)性乳腺癌組織中呈異常低表達(dá)，Caspase-3參與原發(fā)性浸潤(rùn)性乳腺癌發(fā)生及發(fā)展過(guò)程，且與患者預(yù)后密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，乳腺癌組織中Caspase-3蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為39.73%，明顯低于癌旁正常乳腺組織Caspase-3蛋白陽(yáng)性表達(dá)率90.00%，與上述研究結(jié)果相一致。隨后本研究對(duì)不同基因型中Caspase-3蛋白表達(dá)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)研究，結(jié)果顯示，Caspase-3蛋白表達(dá)在Luminal A型、HER-2過(guò)表達(dá)型、BLBC型之間兩兩比較差異顯著，提示Caspase-3蛋白表達(dá)與乳腺癌基因分型有關(guān)，肖剛等[12]研究支持本研究結(jié)果。

XIAP作為1種凋亡抑制蛋白，在機(jī)體多種正常組織中均有表達(dá)，且在肝癌[13]、乳腺癌等[14]多種惡性腫瘤中顯著高表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，乳腺癌組織中XIAP蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為86.30%，明顯高于癌旁正常乳腺組織XIAP蛋白陽(yáng)性表達(dá)率40.00%，提示XIAP在乳腺癌組織中呈明顯高表達(dá)，參與乳腺癌發(fā)生發(fā)展，與閆紅等研究結(jié)果一致。XIAP在HER-2過(guò)表達(dá)型、BLBC型乳腺癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率高達(dá)100%，提示XIAP表達(dá)與乳腺癌基因分型密切相關(guān)，主要分布在HER-2過(guò)表達(dá)型、BLBC型乳腺癌組織中。Moraes等[15]研究結(jié)果顯示，XIAP在乳腺癌中明顯高表達(dá)，且與乳腺癌患者預(yù)后及耐藥性有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，XIAP與乳腺癌患者年齡、腫瘤大小、絕經(jīng)情況無(wú)關(guān)，與TNM分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，與上述觀點(diǎn)一致。Smac蛋白是Caspase家族線粒體激活因子，作為一種促凋亡蛋白在細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要作用[16]。XIAP與Smac之間存在相互關(guān)系，是細(xì)胞凋亡過(guò)程中重要調(diào)控點(diǎn)之一，正常狀態(tài)下二者處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，一旦平衡打破，則誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或者凋亡抵抗發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，乳腺癌組織中Smac蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為31.51%，明顯低于癌旁正常乳腺組織蛋白陽(yáng)性表達(dá)率95.00%，且Smac蛋白表達(dá)與乳腺癌基因分型存在密切關(guān)系，推測(cè)XIAP高表達(dá)及Smac低表達(dá)，從而抑制Caspase表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致腫瘤惡性程度增高，發(fā)生轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)。Caspase-3、XIAP、Smac蛋白表達(dá)與乳腺癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，推測(cè)三者有望成為早期診斷、評(píng)估乳腺癌惡性程度及預(yù)測(cè)預(yù)后的參考指標(biāo)，具有較高臨床價(jià)值。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，Caspase-3、Smac蛋白在乳腺癌組織中明顯低表達(dá)，XIAP蛋白呈明顯高表達(dá)，三者與乳腺癌基因分型、發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本研究仍存在樣本量較少，僅從組織學(xué)水平檢測(cè)三者水平等不足之處，乳腺癌中Caspase-3、XIAP、Smac表達(dá)所涉及的具體信號(hào)通路，后續(xù)實(shí)驗(yàn)將進(jìn)一步充分闡明。