龍兆博 張 苗 司婷婷 張 進 秦 娟

甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)是臨床上比較常見的內分泌腫瘤，也是目前發(fā)病率上升最快的實體性腫瘤之一[1-2]。當前由于各種因素的影響，PTC在我國的發(fā)病人數(shù)逐年增加。隨著醫(yī)學技術的提高，PTC患者5年生存率已經(jīng)超過了60%，但是加強早期預防與診斷依然是改善PTC預后的重要方法。PTC的病理診斷主要依賴于其復雜的乳頭狀結構和典型的核特征，但是部分良性甲狀腺病變也可以伴有與PTC的真乳頭，但是診斷效果不佳[3-4]。當前PTC的病因尚不十分清楚，其中經(jīng)歷了多步驟、多階段、多因素、多基因變異參與的復雜的生物學演變過程[5-6]。近年來，隨著分子遺傳學的研究與不斷發(fā)展的分子生物學、免疫學技術相結合，越來越深入于對PTC在分子水平致病機制的研究[7]。研究顯示多個癌基因的異常激活和編碼蛋白的過度表達以及抑癌基因的缺失、突變失活導致細胞增殖失控而惡性轉化，可能是PTC發(fā)生的分子生物學基礎[8-10]。當前已有一些特異性較強的應用于甲狀腺良惡性疾病鑒別診斷的分子標記物，包括半乳糖凝集素3(Galectin-3)、細胞角蛋白19(Gytokeratin-19)等[11-13]。甲狀腺乳頭狀癌細針穿刺涂片能提高甲狀腺癌診斷的靈敏度和特異度，當前在一些地區(qū)已經(jīng)推廣使用[14-15]。本文具體探討了甲狀腺乳頭狀癌細針穿刺涂片中Galectin-3、Cytokeratin-19的表達及其臨床意義，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料

2016年1月到2017年1月選擇我院收治的甲狀腺組織樣本120例，其中正常甲狀腺組織90例(對照組)，PTC組織30例(觀察組)。納入標準：所有患者的臨床病例資料完整；術前未接受化療、放療、內分泌治療等任何治療的患者；年齡在20～80歲之間；研究得到醫(yī)院倫理委員會的批準。排除標準：雙側原發(fā)性PTC；PTC外其他所有類型惡性腫瘤；臨床資料不明確且病理科無完整切片或石蠟檔案；妊娠與哺乳期婦女。對照組中男性20例，女性70例；年齡最小28歲，最大57歲，平均年齡(48.33±3.11)歲；平均體重指數(shù)為(23.11±2.94)kg/m2。觀察組中男性18例，女性12例；年齡最小29歲，最大58歲，平均(49.11±2.87)歲；平均體重指數(shù)為(23.98±1.82)kg/m2；病理分期：Ⅰ期16例，Ⅱ期10例，Ⅲ期4例；分化程度：低分化18例，中分化6例，高分化6例；淋巴結轉移：無轉移20例，有轉移10例。2組的性別、年齡、體重指數(shù)對比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

1.2 細針穿刺涂片方法

取患者舒適的體位，利用超聲顯示甲狀腺內的目標病灶，確定進針部位和路徑，并用記號筆標記穿刺點。常規(guī)消毒穿刺部位，局部浸潤麻醉穿刺點。使用帶有6-7號針頭的注射器進針入目標病灶內，扭轉針尖切割緣并上下提插，不要讓標本進到注射器內。拔出穿刺針，將吸取的組織均勻涂片，并用95%乙醇固定。

1.3 免疫組化檢測

免疫組化染色試劑盒購自于福建邁新生物技術有限公司，DAB(3，3-二氨基聯(lián)苯胺Tris緩沖液)顯色試劑盒購自福建邁新生物技術有限公司。采用Envision二步法檢測Galectin-3、Cytokeratin-19蛋白的表達情況，鼠抗人Galectin-3、Cytokeratin-193單克隆抗體都購自博士德生物有限公司。以已知的陽性對照染色片為陽性對照，PBS代替一抗為陰性對照。選擇經(jīng)HE染色證實的甲狀腺組織石蠟塊，3 μm石蠟切片，放置于載玻片，60 ℃烤片4 h；二甲苯脫蠟2次，酒精梯度脫水后進行水洗；修復抗原，蒸餾水沖洗，5 min×3次；3% H2O2溶液處理15 min，PBS沖洗，5 min×3次；一抗常溫孵育1 h，PBS沖洗，5 min×3次；二抗25 ℃孵育15 min，PBS沖洗，5 min×3次；DAB室溫下3～5 min顯色，蘇木精復染細胞核1～2 min，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，鏡下觀察。每張切片由兩位病理專家獨立閱片共同協(xié)商出判斷結果。

1.4 臨床資料調查

調查了所有患者的性別、病案號、年齡、體重指數(shù)、聯(lián)系電話、病理分期、分化程度、淋巴結轉移等情況。同時詳細記錄了2組的組織標本中免疫組織化學染色Galectin-3、Cytokeratin-19的表達情況。

1.5 統(tǒng)計學方法

應用SPSS20.00 for windows軟件包進行統(tǒng)計學分析Galectin-3、Cytokeratin-19蛋白在組織中的表達情況及其與臨床病理參數(shù)之間的關系，采用χ2法或Fisher精確概率法進行統(tǒng)計學檢驗，計量數(shù)據(jù)對比采用t檢驗分析，相關性分析采用 Spearman 等級相關分析，影響因素分析采用多因素非條件logistic回歸分析，以P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Galectin-3、Cytokeratin-19在甲狀腺組織中的表達對比

Galectin-3、Cytokeratin-19在對照組的陽性表達率為15.6%和4.4%，在觀察組中的陽性表達率為80.0%和90.0%，觀察組都高于對照組(P<0.05)。見表1。

表1 Galectin-3、Cytokeratin-19在甲狀腺組織中的陽性表達對比(例，%)

2.2 Galectin-3、Cytokeratin-19在PTC組織中表達與臨床特征的相關性

Galectin-3、Cytokeratin-19在PTC組織中的陽性表達率與PTC的病理分期、分化程度、淋巴結轉移明顯相關(P<0.05)。Spearman 等級相關分析顯示PTC的Galectin-3、Cytokeratin-19的陽性表達呈明顯相關性(γ=0.607，P<0.05)。見表2。

表2 Galectin-3、Cytokeratin-19在PTC組織中表達與臨床特征的相關性(例，%)

2.3 影響因素分析

在觀察組中，以Galectin-3、Cytokeratin-19陽性表達作為因變量，以調查的臨床資料作為自變量，多因素非條件logistic回歸分析顯示PTC組織病理分期、分化程度、淋巴結轉移都為影響Galectin-3、Cytokeratin-19陽性表達的獨立危險因素(P<0.05)，見表3。

表3 影響PTC組織Galectin-3、Cytokeratin-19陽性表達的主要因素(n=30)

3 討論

PTC是一種高度遺傳特異性的惡性腫瘤。早期PTC的預后較好，但晚期預后較差，特別是其發(fā)生轉移時，很難被徹底根治[16]。近年來，通過對PTC相關基因進行分析，可以為預測PTC的預后提供有力的而可靠的證據(jù)。癌基因激活和抑癌基因失活均可導致正常組織發(fā)生癌變，通過單個抑癌基因或癌基因的檢測分析有助于分析腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[17]。不過目前多數(shù)研究僅局限于單一指標，然而從生物學角度看，各指標之間可能存在著極其復雜的關系[18-19]。

細針穿刺涂片因操作簡便、經(jīng)濟、快速、安全、實用等特征，現(xiàn)已被廣泛應用于臨床并已成為甲狀腺結節(jié)術前診斷的常見檢查手段之一[20]。Galectin-3是由氨基酸末端區(qū)和羧基末端糖類識別區(qū)組成的多肽，可存在于細胞質、細胞核、細胞表面中，屬凝集素蛋白家族成員。有研究表明Galectin-3診斷甲狀腺結節(jié)良惡性的敏感性大于80%，特異性大于90%[21]。Cytokeratin-19是一類低分子量角蛋白，可表達于許多上皮組織中，Cytokeratin-19可高表達于PTC，陽性率在80%以上[22]。本研究顯示Galectin-3、Cytokeratin-19在對照組的陽性表達率為15.6%和4.4%，在觀察組中的陽性表達率為80.0%和90.0%，觀察組都高于對照組(P<0.05)，表明隨著甲狀腺組織的惡化，Galectin-3、Cytokeratin-19蛋白相對表達量越來越高。病理類型、臨床分期相同的PTC患者，采用相同的治療方案卻得到不同的預后，為此需要積極建立更加有效的PTC判定診斷方法，從而指導PTC的臨床工作[23]。Galectin-3、Cytokeratin-19可參與多項生物功能，包括細胞凋亡、腫瘤發(fā)展、細胞粘合、細胞周期調節(jié)等。Galectin-3、Cytokeratin-19高表達導致細胞凋亡程序受阻，導致細胞向惡性發(fā)展，而抑制其表達可以使發(fā)生轉化的細胞正常[24]。本研究顯示Galectin-3、Cytokeratin-19在PTC組織中的陽性表達率與PTC的病理分期、分化程度、淋巴結轉移明顯相關(P<0.05)；Spearman 等級相關分析顯示PTC的Galectin-3、Cytokeratin-19的陽性表達呈明顯相關性(γ=0.607，P<0.05)。也有研究表明有Galectin-3、Cytokeratin-19高表達的腫瘤更具有侵襲性，與PTC患者的腫瘤大小、淋巴結轉移呈顯著正相關[25]。而如果腫瘤組織分裂旺盛，處于細胞周期活躍期的細胞相對較多，是Galectin-3、Cytokeratin-19表達增高所致[26]。

隨著遺傳學損傷的不斷積累，更多的抑癌基因失活而大量的癌基因被激活后，在外界環(huán)境的雙重作用下，導致PTC的發(fā)生[27-28]。本研究多因素非條件logistic回歸分析顯示PTC組織病理分期、分化程度、淋巴結轉移都為影響Galectin-3、Cytokeratin-19陽性表達的獨立危險因素(P<0.05)。當前臨床上也出現(xiàn)了評估Galectin-3、Cytokeratin-19鑒別濾泡狀腫瘤良惡性的診斷價值的大型前瞻性研究，利用穿刺涂片組織標本進行Galectin-3、Cytokeratin-19檢測，進一步提升了其臨床可信度[29-30]。

總之，Galectin-3、Cytokeratin-19在PTC組織中呈現(xiàn)高表達狀態(tài)，與組織的病理分期、分化程度、淋巴結轉移明顯相關，可作為判斷PTC患者病情的重要指標，有很好的應用價值。