陳慧勤，崔 婷

(1.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床教學(xué)辦，江蘇蘇州215006;2.北京聯(lián)合大學(xué)圖書館，北京100101)

多菌靈(Carbendazim，MBC)是一種廣譜苯并咪唑類抗真菌農(nóng)藥，對真菌引起的病害如灰霉病、白粉病等有著較好的防治效果，因此廣泛應(yīng)用于果蔬等植物病蟲害的防控［1－3］。然而，多菌靈化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，在環(huán)境中的半衰期較長，容易在果蔬表面造成嚴重的殘留［4－6］。且農(nóng)用多菌靈可濕性粉劑、懸浮劑等在果蔬表面附著力較強，難以實現(xiàn)較徹底的清洗［7］。多菌靈可引起人類多個器官的病變及細胞內(nèi)DNA的突變，因此果蔬表面多菌靈殘留對人體健康造成極大危害［8－9］。尋找多菌靈降解的有效方案成為解決該問題的關(guān)鍵。

可降解多菌靈的細菌已有較多報道。目前篩選到的多菌靈降解菌集中在紅球菌、羅爾斯通氏菌、芽孢桿菌等幾種［10－12］，其中部分菌種可利用多菌靈為唯一碳源生長。然而微生物法降解多菌靈時間消耗較長且活體微生物制劑穩(wěn)定性較差，難以實現(xiàn)果蔬表面多菌靈的快速降解。相比之下，從可降解多菌靈的微生物中篩選其水解酶成為較理想的選擇。水解酶是一大類酶的總稱，可用于多種化學(xué)鍵的催化斷裂，如脂肪酸水解、蛋白水解等。多菌靈的第一步水解是其C－N單鍵的斷裂，催化該化學(xué)鍵斷裂的水解酶僅有部分報道，從諾卡氏菌、副球菌等中克隆出的水解酶均屬于水解酶中降解非肽C－N鍵的亞類(EC3.5)［13－14］。該類酶屬于酰胺水解酶，用于多種氨基酸的酶法合成，具有較高的催化活性和催化效率［15］?；诖朔N水解酶的專一性、有效性等指標，可將該酶使用于果蔬表面多菌靈殘留的分解。

本研究擬從自然界中篩選高效多菌靈降解菌，并設(shè)計簡并引物從降解菌中擴增其多菌靈水解酶基因。將水解酶基因在大腸桿菌BL21中過表達后進行蛋白純化，并將純化后的蛋白作為酶制劑對黃瓜、草莓等表面多菌靈殘留的降解劑，用于日常生活中的果蔬農(nóng)殘清洗。

圖1 多菌靈及其降解產(chǎn)物2－氨基苯并咪唑結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structure formula of carbendazim and its degradation product 2－aminobenzimidazole

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

多菌靈可濕性粉劑 四川國光農(nóng)化股份有限公司;多菌靈標準品 Sigma公司;實驗所需各類試劑 北京化工廠;土壤樣品 北京市平谷區(qū)桃樹基地多菌靈使用區(qū)域采集;DNA合成及測序 北京華大基因;多菌靈篩選培養(yǎng)基成分為:多菌靈0.5 g/L，磷酸氫二鉀0.3 g/L，磷酸二氫鉀0.6 g/L，硫酸銨2 g/L，硫酸鎂0.2 g/L，碳酸鈣0.1 g/L，瓊脂粉15 g/L;LB培養(yǎng)基成分為:氯化鈉10 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，固體培養(yǎng)基中加入瓊脂粉15 g/L;His標簽蛋白純化試劑盒 碧云天生物科技有限公司;SDSPAGE所用上樣緩沖液 北京全新拓達科技有限公司;用于實驗的新鮮果蔬 均購自京東超市商城，購買當天即進行實驗。

LC－20液相色譜儀、LCMS－8030液相色譜－質(zhì)譜連用儀 日本島津公司;754N紫外可見光分光光度計 上海奧普樂公司;DYCZ－24DN電泳儀 北京六一儀器廠;TGL－10B離心機 上海安亭公司;DHG－9070A培養(yǎng)箱及干燥箱 上海一恒儀器廠;Scienzt－IID超聲細胞破碎儀 寧波新芝生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種分離及鑒定

1.2.1.1 菌種的分離 取多菌靈污染的土壤樣品0.5 g置于離心管中，使用無菌水吸打混勻后靜置，取上清液涂布至多菌靈篩選培養(yǎng)基平板，倒置于37℃培養(yǎng)箱中恒溫48 h后，將長出的菌落轉(zhuǎn)移至新多菌靈篩選培養(yǎng)基傳代，將連續(xù)3代在只含多菌靈的培養(yǎng)基上長出的單菌落挑出至LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)并保存。

1.2.1.2 菌種的鑒定 菌種的鑒定使用16S DNA比對法。參照參考文獻［16］，使用通用引物27F和1492R進行菌落PCR擴增，電泳確認后送至華大基因進行測序鑒定。系統(tǒng)發(fā)育樹使用MEGA5.0軟件繪制。

1.2.1.3 多菌靈降解實驗 多菌靈降解實驗所用培養(yǎng)基與篩選培養(yǎng)基所用無機鹽相同，唯一碳源多菌靈的初始濃度設(shè)定為30 mg/L(前期實驗結(jié)果)。將單菌落接種于4 mL的LB液體培養(yǎng)基中，并于37℃200 r/min條件下培養(yǎng)12 h，測定菌液OD600。調(diào)整其稀釋倍數(shù)，使得0.1 g干重菌體細胞轉(zhuǎn)接至裝液量為100 mL的250 mL三角瓶中于37℃200 r/min條件下培養(yǎng)。每24 h取一定量的菌液進行后續(xù)生物量及多菌靈含量的測定。生物量參照文獻采用比色法測定［17］，將一定量的菌液經(jīng)過12000 r/min離心10 min取上清液，對菌液中多菌靈含量通過HPLC測定。

1.2.2 基因克隆、蛋白表達及純化

1.2.2.1 水解酶基因的克隆 將篩選出可降解多菌靈的菌種挑出至1 mL無菌水中混勻，進行基因組DNA提取。以提取后的基因組DNA為模板，設(shè)計簡并引物 F:5'－CGCGGATCCATGGANCTCANTGAN CAGNATGC;3'－ R:5'－ CCCAAGCTTTCNTGCTGNCA GNCTGANCCTGT 3'－，使用梯度 PCR進行擴增。PCR程序為94℃、3 min，94 ℃、1 min，退火 40 s，72℃、1 min，30個循環(huán);72℃、10 min，16℃保存。退火溫度梯度為47、50、53、56、59、62、65 ℃。基因擴增后使用Bam HI和Hind III酶切位點切割基因和p ET－28a質(zhì)粒，切膠回收后16℃連接過夜。將重組質(zhì)粒與E.coli BL21感受態(tài)細胞混合后42℃熱擊90 s，加入1 mL的LB培養(yǎng)基，并涂布至含有30 mg/L的卡那霉素LB固體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h后鑒定重組子。

1.2.2.2 蛋白的表達 將重組菌在含有卡那霉素(30 mg/L)及含0.05 mmol/L Isopropylβ－DThiogalactoside(IPTG)的 LB培養(yǎng)基中37℃200 r/min誘導(dǎo)表達 12 h后，取出 200 uL菌液12000 r/min離心10 min去上清，沉淀中加入蛋白電泳上樣緩沖液后，沸水浴10 min，再次12000 r/min離心10 min后，使用上清液進行SDS－PAGE。SDSPAGE采用12%聚丙烯酰胺凝膠，上樣量20 uL，恒壓120 V。電泳結(jié)束后使用20 mmol/L的考馬斯亮藍G250常溫染色2 h，換無菌去離子水脫色12 h。

1.2.2.3 蛋白的純化 將重組菌接種在20 mL的LB液體培養(yǎng)基中，37℃下 200 r/min培養(yǎng) 12 h。12000 r/min離心10 min去上清后，使用 pH7.0的50 mmol/L磷酸鉀緩沖液重懸細胞，進行細胞超聲破碎(80 W，工作3 s，停2 s，100次)。蛋白純化使用碧云天蛋白純化試劑盒進行，將破碎液過鎳柱后，使用試劑盒中W1洗滌液洗掉未吸附蛋白，再用試劑盒中D1洗脫液將目標蛋白洗脫。酶活測定時使用細胞破碎液10 uL或純化后蛋白1 ug加入至含有1 mmol/L多菌靈溶液中，測定其在37℃培養(yǎng)箱中靜置10 min后多菌靈殘留，計算其消耗量。酶活定義為1 h內(nèi)消耗1μmol/L多菌靈所需要的酶量。

1.2.3 果蔬表面農(nóng)殘降解 以土豆為例，將新鮮的土豆表面洗凈，浸泡在含有10 mg/L的多菌靈溶液中5 min后取出。將土豆平均分組，其中實驗組和對照組分別設(shè)置30個樣品用于平行實驗。自然晾干后分別取每組三個樣品置于不同托盤中，將純化后的水解酶KY－1配制為1 mg/L的水劑，以相等劑量噴灑于多菌靈浸泡后的土豆表面，對照組以相等體積的無菌水噴灑，噴灑后對照組和實驗組分別置于30℃培養(yǎng)箱測定果蔬表面多菌靈降解。每隔24 h取出三個實驗組和三個對照組的樣品，分別浸泡在200 mL無菌水中10 min，取上清液過0.22 um微孔濾膜檢測多菌靈含量。以初始晾干后果蔬表面多菌靈含量為100%，計算多菌靈降解率。

式中，M0為初始晾干后果蔬表面多菌靈峰面積;Mi為每次取樣時測得該時間點果蔬表面多菌靈峰面積。

黃瓜、西紅柿和草莓以相同的實驗方法測定。

1.2.4 檢測方法 多菌靈液相檢測使用島津LC－20液相色譜紫外檢測器，C18色譜柱，柱溫30℃，流動相為30%的甲醇水溶液，磷酸濃度0.05%，檢測波長280 nm。質(zhì)譜采用ESI電離源，毛細管電壓3.0 k V，錐孔電壓30 V，離子源溫度100℃，脫溶劑溫度400℃，錐孔氣流量50 L/h，脫溶劑氣流量700 L/h，液質(zhì)檢測掃描質(zhì)量范圍m/z:50～300。標準曲線為多菌靈標準溶液檢測后以含量－峰面積繪制，標準溶液多菌靈濃度為 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/L，標準曲線為 y=103730x，x 為多菌靈濃度，y 為峰面積，R2=0.9991。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗中每個樣品重復(fù)3次測定，實驗結(jié)果采用Origin 8.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 多菌靈降解菌的篩選與鑒定

經(jīng)過連續(xù)篩選，最終得到一株可利用多菌靈為唯一碳源生長的細菌，經(jīng)過16S rRNA序列鑒定及序列比對，確認該菌種為產(chǎn)酸克雷伯菌 Klebsiella oxytoca，命名為K.oxytoca KO－1。該菌種的16S rRNA擴增結(jié)果如圖2中所示，在第1泳道中約1500 bp位置出現(xiàn)了清晰的條帶。如圖3中所示，發(fā)育樹分析表明，K.oxytoca KO－1與產(chǎn)酸克雷伯菌親緣關(guān)系較為接近，但仍與已知菌種存在一定差異，為目前尚未被篩選鑒定過的新菌種。

圖2 K.oxytoca KO－1菌16SDNA的PCR電泳圖Fig.2 PCR amplification of 16SDNA of K.oxytoca KO－1.注:M:DNA Marker DL5000;1:16SDNA of K.oxytoca KO－1。

圖3 K.oxytoca KO－1的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of K.oxytoca KO－1

2.2 多菌靈降解

將所篩選K.oxytoca KO－1接入液體多菌靈培養(yǎng)基，所測得多菌靈降解及生物量如圖4中所示。由圖4中可以看出，30 mg/L多菌靈在液體培養(yǎng)基中第7 d被完全消耗，平均降解速率為4.29 mg/L·d。與張桂山等［11，16］結(jié)果相比，K.oxytoca KO－1 在液體培養(yǎng)基中對多菌靈降解速度較快。K.oxytoca KO－1的生長在第3 d到達平穩(wěn)期，細胞最高吸光度值為0.16。本實驗中未加入除多菌靈外的有機物，因此K.oxytoca KO－1的生長受到了限制［18］。其次，多菌靈為殺菌劑，其對K.oxytoca KO－1的生長也產(chǎn)生了一定的抑制作用。該數(shù)據(jù)也說明，使用微生物法除去多菌靈，存在降解菌生長易受多菌靈影響等問題。

圖4 多菌靈降解及K.oxytoca KO－1的OD600吸光度值Fig.4 Carbendazim degradation and OD600 of K.oxytoca KO－1

2.3 水解酶編碼基因的克隆

根據(jù)K.oxytoca中的多個水解酶基因序列比對并設(shè)計簡并引物，梯度PCR擴增其水解酶基因，擴增結(jié)果如圖5中所示。由圖5中可知，水解酶基因在退火溫度為50～59℃區(qū)間內(nèi)時被成功擴增出。經(jīng)測序鑒定，該基因大小為837 bp，命名為ky1。序列比對后確認該基因與來自K.oxytoca M1中的水解酶基因HR38_01345有約99%的同源性，堿基存在7處差別，具體見表1。

圖5 ky1基因的PCR擴增Fig.5 PCR amplification of ky1注:M:DNA Marker DL5000;1～7:退火溫度47、50、53、56、59、62、65 ℃時的 PCR 產(chǎn)物。

表1 ky1與HR38_01345的堿基差別Table 1 The DNA sequence differencesbetween ky1 and HR38_01345

2.4 ky－1的表達純化及催化產(chǎn)物檢測

將ky1基因使用Bam HI和Hind III酶切位點連接入表達載體p ET－28a后轉(zhuǎn)入BL21中，IPTG誘導(dǎo)表達。實驗SDS－PAGE結(jié)果如圖6中所示。在1泳道，成功表達出大小為28 kDa的KY－1，而對照組相應(yīng)位置沒有條帶出現(xiàn)，證明表達成功。使用鎳柱純化蛋白后，可見到3泳道中清晰的條帶，成功得到了KY－1純化蛋白。酶活實驗顯示，未純化及純化后的KY－1比活力達到0.16和36.8 U/mg。純化后的KY－1比未純化的大腸桿菌細胞破碎液催化多菌靈的能力有了大幅度的提高，證明純化后的KY－1有著較強的清除多菌靈的潛力。對KY－1酶催化產(chǎn)物檢測，檢測結(jié)果如圖7中所示。質(zhì)譜圖中m/z為192.10和134.20為多菌靈及其降解產(chǎn)物2－氨基苯并咪唑［13］。液質(zhì)結(jié)果顯示，KY－1成功將多菌靈分解。

圖6 KY－1的SDS－PAGE分析Fig.6 SDS－PAGE analysis of KY－1注:M:蛋白標尺;1:E.coli(pET－28a－ky1)粗蛋白;2:E.coli(pET－28a)粗蛋白;3:純化后的 KY－1。

圖7 液質(zhì)分析多菌靈代謝產(chǎn)物Fig.7 HLPC－MSanalysis of carbendazim degradation product注:m/z192和134分別為多菌靈及其代謝產(chǎn)物2－氨基苯并咪唑。

Pandey等［13］從諾卡氏菌種克隆出可水解多菌靈的酯酶MheI，編碼基因長度為729 bp，Km和Kcat值分別 為 6.1 μmol/L 和 170 min－1。 Hang 等［19］從Hansschlegelia zhihuaiae S113中克隆并表達出SulE，可用于多菌靈降解，但未對酶活進行測定。Lei等［20］從Microbacterium sp.djl－6F克隆出mehI基因，表達蛋白 Km和 Kcat值分別為6.69 μmol/L 和160.88 min－1，并對其進行了突變。相比之下，KY－1的Km和Kcat值分別為6.26μmol/L和168 min－1，催化效率與上述報道較為接近。本實驗中的蛋白KY－1可通過E.coli表達系統(tǒng)大量獲得，且酶催化活性較高，是工業(yè)級酶制劑生產(chǎn)的較好選擇。

2.5 去除果蔬農(nóng)殘

將純化后的KY－1制備為酶制劑后，分別噴灑于多菌靈污染的西紅柿、黃瓜、土豆及草莓的表面，用于檢測多菌靈的降解。由圖8中可知，多菌靈在果蔬表面有自然降解的發(fā)生，其中西紅柿表面降解較快，而草莓表面降解較慢，推測原因為西紅柿表面褶皺越少，噴灑蒸餾水對其多菌靈洗脫較為有利。噴灑KY－1酶制劑后，各種果蔬表面多菌靈殘留均有較為明顯的下降，噴灑酶制劑6 d后，西紅柿、黃瓜、土豆及草莓表面多菌靈剩余分別為70.2%、65.2%、62.1%和57.2%。同時，相比于各自對照組的多菌靈殘留量，多菌靈降解最多的為草莓，減少量為37.3%;降解最少的為西紅柿，減少量為10.5%。由以上數(shù)據(jù)可以看出，表面褶皺越多的果蔬，其多菌靈自然降解越慢。而加入KY－1后，表面褶皺多的果蔬，多菌靈得到了較快的降解。造成該現(xiàn)象可能的原因為，表面褶皺給酶催化多菌靈降解提供了更多的比表面積，促進了酶解反應(yīng)的進行。

圖8 KY－1酶制劑清除果蔬表面多菌靈Fig.8 Degradation of carbendazim residue on surface of fruits by KY－1注:A:西紅柿;B:黃瓜;C:土豆;D:草莓。

3 結(jié)論

本實驗從土壤中篩選出了一株高效降解多菌靈的產(chǎn)酸克雷伯菌 KY－1，并從其基因組中克隆出837 bp的水解酶基因ky1。將ky1在E.coli中表達純化后，液質(zhì)檢測其表達產(chǎn)物KY－1成功將多菌靈降解為2－氨基苯并咪唑。使用KY－1酶制劑對果蔬表面多菌靈進行降解，成功減少了西紅柿、黃瓜、土豆及草莓表面的多菌靈殘留，最高減少了37.3%。本研究成功使用酶法對果蔬表面農(nóng)殘進行了降解去除。果蔬表面的農(nóng)藥殘留是在其生長及儲存階段噴灑但未被降解及清洗掉的部分農(nóng)藥，其中部分農(nóng)藥殘留因水溶性較小而難以清洗。使用微生物法可降解部分農(nóng)藥殘留，但其降解速度較慢，難以滿足市場化的應(yīng)用需求。相比之下本研究中所制備的KY－1可快速有效實現(xiàn)果蔬表面多菌靈的降解，且其生產(chǎn)成本較低，是未來果蔬清洗添加劑的選擇之一。