周永軍，張輝，牛中奇

1.咸陽師范學(xué)院物理與電子工程學(xué)院，陜西咸陽712000；2.西安電子科技大學(xué)電子工程學(xué)院，陜西西安710071

前言

極低頻（Extremely Low Frequency,ELF）電磁環(huán)境是指頻率在3～1 000 Hz的交變電磁場環(huán)境［1］。隨著工業(yè)化、信息化技術(shù)的快速發(fā)展及其產(chǎn)品的廣泛使用，人類無時無刻不暴露在ELF電磁環(huán)境中且暴露的ELF電磁功率密度也越來越大。早在1975年就有環(huán)境科學(xué)家預(yù)言，人類生存環(huán)境空間電磁能量密度將每年增加7%～14%，照此速度，2125年人類生存環(huán)境空間電磁能量密度是1975年的700倍［2］。毫無疑問，ELF電磁環(huán)境污染將是今后人類所面臨且必須應(yīng)對的問題之一。

自1979年Wertheimer等［3］首次報道大電流配電站附近ELF電磁暴露感應(yīng)強度高低與兒童癌癥發(fā)病幾率相關(guān)以來，ELF電磁暴露對健康影響問題受到了越來越多的關(guān)注［4-6］。目前，雖然ELF電磁暴露生物效應(yīng)研究已從流行病學(xué)調(diào)查逐步深入到細(xì)胞及分子水平，但對ELF電磁暴露生物學(xué)效應(yīng)，如量效關(guān)系、效應(yīng)閾值、致傷機理等方面仍缺乏令人信服的結(jié)論。因此，繼續(xù)深入開展ELF電磁暴露生物學(xué)效應(yīng)研究仍具有十分重要的意義。

眾所周知，細(xì)胞是生物體形態(tài)結(jié)構(gòu)和生命活動的基本單位，細(xì)胞無論是在培養(yǎng)中或在肌體內(nèi)，其行為的基本規(guī)律是一樣的，加之實驗過程在某種程度上是在可控環(huán)境中進行且基于細(xì)胞的機理分析研究對象又相對清晰，所以建立在細(xì)胞基礎(chǔ)上的實驗研究、機理分析仍然是探索ELF電磁生物學(xué)效應(yīng)的重要手段。

細(xì)胞內(nèi)自由鈣離子作為維持細(xì)胞正常新陳代謝和生理機能的第二信使，控制著細(xì)胞的許多生理、生化過程，而ELF電磁環(huán)境是包含人類在內(nèi)整個生物界生存和發(fā)展的一個重要環(huán)境因素。有研究表明，胞間信號分子（如胰島素）和胞內(nèi)第二信使（自由鈣離子）等是電磁場與細(xì)胞相互作用的重要場所［7-9］。所以，研究ELF電磁暴露對細(xì)胞內(nèi)自由鈣離子跨膜遷移的影響及機理無疑對開展ELF電磁暴露的防護、合理開發(fā)利用從而促進人類健康發(fā)展具有重要意義?；诖耍匀梭w肝癌細(xì)胞為研究對象，實驗研究ELF電磁暴露對鈣離子跨膜遷移的影響，在注重細(xì)胞膜離子通道物理、生物特性基礎(chǔ)上探討ELF電磁暴露對鈣離子跨膜遷移影響的機理。

1 實驗

1.1 實驗試劑、設(shè)備和方法

1.1.1 試劑 （1）M1640培養(yǎng)基（Gibco Brc公司），小牛血清（杭州四季青生物工程材料研究所），F(xiàn)luo-3（美國BIO-RAD產(chǎn)品），二甲基亞砜（DMSO），胰蛋白酶（華美生物工程公司）；（2）Hank's液［10］（用國產(chǎn)分析純和超純水配制）：NaCl 8.00 g/L；KCl 0.40 g/L；MgSO4·7H2O 0.20 g/L；Na2HPO4·12H2O 0.12 g/L；KH2PO40.06 g/L；CaCl20.14 g/L；NaHCO30.35 g/L。

1.1.2 儀器設(shè)備

（1）實驗系統(tǒng)設(shè)備：YB1561功率信號函數(shù)發(fā)生器（江蘇揚中電子儀器廠）；YB2172交流毫伏表（江蘇揚中電子儀器廠）；V-252示波器，電磁暴露小室（西安電子科技大學(xué)電子工程學(xué)院）；SWK-1溫度控制儀；MC數(shù)字溫度計；50 Ω匹配負(fù)載；（2）LSCM激光掃描共聚焦顯微鏡。

1.2 細(xì)胞樣品制備與熒光負(fù)載

1.2.1 細(xì)胞樣品制備 將對數(shù)生長期人體肝癌細(xì)胞株（7721）經(jīng)胰蛋白酶制成單層懸液，并用苔盼藍染液計數(shù)檢驗細(xì)胞成活率，當(dāng)成活率達95%以上時，將該單層懸液接種于特制的50 mm培養(yǎng)皿（培養(yǎng)皿下底部中央開一個直經(jīng)約為10 mm小孔，從下方粘貼一個蓋玻片）底部的載玻片上，加入1640培養(yǎng)液（含10%小牛血清）置于含5%二氧化碳，溫度37℃培養(yǎng)箱中孵育24 h。

1.2.2 熒光負(fù)載 將一支50μg的Fluo-3熒光探針加入到50μL的二甲基亞砜中，待熒光探針溶化后將其均勻分裝在10個小瓶并存儲于-20℃環(huán)境，取一小瓶并將其注入500μL Hank's液后搖勻用于細(xì)胞熒光負(fù)載。細(xì)胞熒光負(fù)載時首先在24～35℃避光條件下用純Hank's液（pH值為7.0±0.1）洗滌樣本細(xì)胞2～3次，再將洗滌后的樣本細(xì)胞同上述制備的含有Fluo-3的Hank's液一起孵育30 min（待細(xì)胞內(nèi)聚集足夠高濃度的熒光探針），再用純Hank's液沖洗細(xì)胞樣本多次以便徹底洗掉細(xì)胞外熒光探針，至此制備完成細(xì)胞樣品熒光負(fù)載。

1.3 實驗系統(tǒng)搭建及數(shù)據(jù)獲得

1.3.1 實驗系統(tǒng)搭建 為了觀察ELF電磁暴露對鈣離子跨膜遷移的影響，需將熒光負(fù)載后的細(xì)胞樣品置于ELF電磁環(huán)境中暴露一定時間，同時考慮實驗盡可能不污染環(huán)境及屏蔽外來電磁的干擾。本文采用第1.1.2節(jié)中所示儀器搭建實驗系統(tǒng)的原理圖如圖1所示，其中溫控設(shè)備一方面是為了滿足生物樣品的生理需求，另一方面是確保實驗產(chǎn)生的非熱生物效應(yīng)不因溫度原因而淹沒。整個實驗過程溫度保持在（35.0±0.2）℃，磁場強度為1.78×10-7T。

1.3.2 實驗數(shù)據(jù)獲得 待細(xì)胞樣品熒光負(fù)載后即刻用激光共聚焦掃描顯微鏡對細(xì)胞樣品胞漿中的熒光強度和本底熒光強度（培養(yǎng)皿內(nèi)細(xì)胞外培養(yǎng)基中殘留的熒光強度）進行測量，被測細(xì)胞胞漿內(nèi)熒光強度減去本底熒光強度便是對照組樣品熒光強度數(shù)據(jù)，然后即刻將樣品置入預(yù)設(shè)ELF電磁參數(shù)暴露小室內(nèi)暴露20 min，再用激光共聚焦掃描顯微鏡樣品細(xì)胞胞漿內(nèi)熒光強度和本底熒光強度進行檢測，被測細(xì)胞胞漿內(nèi)熒光強度減去本底熒光強度便是暴露組樣品熒光強度數(shù)據(jù)。在足夠多樣本上獲得對照組和暴露組數(shù)據(jù)后，將暴露組和對照組數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理便得到實驗數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

樣品細(xì)胞經(jīng)ELF電磁暴露前后鈣離子跨膜遷移量統(tǒng)計如表1所示。從表1所列7組數(shù)據(jù)可以看出，f=16 Hz且EP=53 V m、f=45 Hz且EP=53 V m以及f=16 Hz且EP=80 V m的ELF電磁暴露可使暴露組樣品鈣離子遷移量顯著高于對照組（P＜0.001，P＜0.005,P＜0.001）；而f=32 Hz且EP=53 V m、f=60 Hz且EP=53 V m、f=16 Hz且EP=26 V m以及f=16 Hz且EP=87 V m的ELF電磁暴露未使暴露組樣品鈣離子遷移量顯著高于對照組（P＞0.10,P＞0.05,P＞0.01,P＞0.10）。

表1 ELF電磁暴露對鈣離子跨膜遷移的影響Tab.1 Effects of ELF electromagnetic exposure on calcium ion transmembrane migration

3 討論

當(dāng)暴露組數(shù)據(jù)與對照組數(shù)據(jù)存在顯著性差異時，才認(rèn)為該組ELF電磁暴露可顯著影響鈣離子跨膜遷移率，否則認(rèn)為該組ELF電磁暴露未影響細(xì)胞內(nèi)自由鈣離子跨膜遷移率。

從實驗結(jié)果可知并非實驗所用ELF電磁暴露均能顯著影響鈣離子跨膜遷移，另外由于ELF電磁暴露攜帶能量很低（幾乎淹沒于分子的熱運動），鈣離子是如何獲得ELF電磁暴露所提供的能量實現(xiàn)跨膜遷移？科研工作者雖已從不同角度提出多種理論進行闡釋，但至今仍缺乏令人信服的結(jié)論［11］。

有研究表明細(xì)胞內(nèi)、外離子遷移是通過跨接在細(xì)胞膜兩端由α-螺旋蛋白質(zhì)分子構(gòu)成的離子通道來完成，而離子通道存在一定勢壘，且其勢壘呈現(xiàn)出兩端較高，中間沿軸線呈周期性分布的特點［12］。對于本文而言，影響鈣離子跨膜遷移的因子只有ELF電磁環(huán)境，由于其攜帶的能量很低（幾乎淹沒于分子的熱運動），那么細(xì)胞內(nèi)帶電粒子是如何克服離子通道內(nèi)勢壘阻礙產(chǎn)生顯著遷移？有研究表明細(xì)胞里的各種“細(xì)胞器”均包裹在由磷脂形成的雙分子膜里，它既非液體、亦非固體，而更接近液體晶體［13］；生物組織是以細(xì)胞為基元吸收電磁能量的［14-15］；細(xì)胞膜是ELF電磁作用的初始靶點［16］。當(dāng)作用于介質(zhì)的外部場強達107V/m量級時，介質(zhì)就會表現(xiàn)出明顯的非線性特征［17］。對跨接在細(xì)胞膜兩端由α-螺旋蛋白質(zhì)分子構(gòu)成的離子通道而言，其內(nèi)部場強卻已達到這個數(shù)量級（這是因為正常新陳代謝細(xì)胞膜內(nèi)外存在102mV靜息膜電位，而細(xì)胞膜厚度為10 nm量級），因此細(xì)胞膜離子通道的非線性極化特性就不容忽視。細(xì)胞膜離子通道的非線性特性可使入射電磁能量聚焦在一定區(qū)域內(nèi)，從而使該區(qū)域的帶電粒子獲得遠大于入射電磁能量的能量，從而實現(xiàn)跨越一個或多個勢壘做軸向運動，當(dāng)在運動后的位置上再次獲得能量時，便可再次跨越一個或多個勢壘，此過程周而復(fù)始直至離子穿出離子通道。但是根據(jù)表1看到，并非所有高于某個閾值的電磁能量都可引起生物學(xué)效應(yīng)，這又是什么原因？離子通道內(nèi)沿軸線周期性勢壘分布意味著帶電粒子要沿著軸向運動所需能量是某一基本能量單元的整數(shù)倍，而這個基本能量單元W0與勢壘高度U的關(guān)系為：

其中，q為帶電粒子的電量，U為周期性分布勢壘的振幅。如果要能夠跨越一個或幾個勢壘，則帶電粒子所獲得的能量就應(yīng)為基本能量單元的一倍或幾倍，即：

這就要求為帶電粒子提供能量的聚焦于局部區(qū)域電磁場能量應(yīng)是以勢壘高度為基本能量單元的整數(shù)倍。在離子通道自身聚焦特性確定條件下，聚焦于局部電磁能量與入射電磁能量有確定性關(guān)系，而電磁場能量又與電場強度平方成正比例，故要求入射電磁場電場強度也要滿足一定比例關(guān)系時（即具有量子化特征）才能顯著影響帶電粒子跨膜遷移（即只有特定電場強度的ELF電磁暴露才能顯著影響帶電粒子跨膜遷移）。

另外從表1還可看出要產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)，除了電場強度滿足上述條件外，入射電磁場頻率也要滿足一定要求。由于細(xì)胞膜離子通道具有單向通透性，因此在ELF電磁的一個周期內(nèi)，只有半個周期電場方向是沿場方向才能對帶電粒子施加沿場方向運動的力促使其跨膜遷移。故帶電粒子沿場方向跨越一個勢壘所用時間τ與ELF電磁周期T間必須滿足以下關(guān)系：

其中，n為半個周期內(nèi)跨越勢壘個數(shù)。式（3）表明只有ELF電磁半個周期正好等于跨越一個勢壘所需時間τ的整數(shù)倍時，才有助于帶電粒子跨越整數(shù)倍個勢壘。這意味ELF電磁的周期也需滿足一定的要求，由于頻率和周期成倒數(shù)關(guān)系［即f=1T(ω=2πT)］，結(jié)合式（3）可得：

式（4）表明：（1）能使帶電粒子跨越勢壘的ELF電磁頻率是一組離散的特定頻率；（2）該組離散頻率中有一閾值fc，其它頻率是該閾值的整數(shù)倍。這與實驗結(jié)果相一致（f=16 Hz、f=45 Hz能促進離子跨膜遷移，而f=60 Hz不可以）。

本文研究ELF電磁暴露對鈣離子跨膜遷移的影響，并在注重細(xì)胞膜離子通道物理、生物特性基礎(chǔ)上探討ELF電磁暴露對鈣離子跨膜遷移的影響機理，這可為ELF電磁暴露風(fēng)險評估及其合理開發(fā)利用提供具有一定參考價值的實驗數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。