基于iTRAQ技術(shù)研究采后1-甲基環(huán)丙烯和乙烯利處理對(duì)茭白線粒體蛋白質(zhì)組變化的影響

羅海波，周 濤，孔曉雪，陶明煊，姜 麗，王利斌，王韋華，郁志芳,*

（1.南京師范大學(xué)金陵女子學(xué)院，江蘇 南京 210097；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095；3.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，江蘇 南京 210095）

衰老是導(dǎo)致茭白采后品質(zhì)快速下降的重要因素，嚴(yán)重影響其商品品質(zhì)和市場(chǎng)價(jià)值[1]。研究表明，抑制或延緩果蔬采后衰老可有效減少營(yíng)養(yǎng)成分消耗損失、風(fēng)味色澤改變及質(zhì)地軟化或木纖化，提高果蔬抗病菌能力，降低腐爛率，從而維持果蔬采后品質(zhì)和貯藏壽命[2]。因此，深入研究茭白采后衰老的生物學(xué)基礎(chǔ)，有助于為實(shí)踐中進(jìn)一步研發(fā)精準(zhǔn)的采后貯運(yùn)保鮮新技術(shù)提供理論支撐。

關(guān)于衰老的生物學(xué)基礎(chǔ)研究，自19世紀(jì)末應(yīng)用實(shí)驗(yàn)方法研究以來(lái)，科研人員曾先后提出過(guò)多種假說(shuō)，目前已知的果蔬采后衰老生物學(xué)基礎(chǔ)主要有營(yíng)養(yǎng)虧缺假說(shuō)、衰老基因調(diào)控學(xué)說(shuō)、激素調(diào)控學(xué)說(shuō)、自由基學(xué)說(shuō)、細(xì)胞凋亡理論、死亡因子、端粒學(xué)說(shuō)和差誤理論等，其中影響較為深遠(yuǎn)的主要是激素調(diào)控學(xué)說(shuō)、自由基學(xué)說(shuō)、細(xì)胞凋亡理論和衰老基因調(diào)控學(xué)說(shuō)[3-4]。目前，盡管這些學(xué)說(shuō)對(duì)衰老現(xiàn)象的解釋都有不同的理論和實(shí)驗(yàn)證據(jù)，但對(duì)采后衰老生物學(xué)基礎(chǔ)的清楚認(rèn)識(shí)遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，關(guān)于果蔬采后衰老生物學(xué)基礎(chǔ)的研究仍需繼續(xù)。

同位素標(biāo)記相對(duì)與絕對(duì)定量（isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ）技術(shù)是近幾年發(fā)展起來(lái)的一種高通量定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，與傳統(tǒng)雙向電泳和熒光差異雙向電泳技術(shù)相比，具有定量準(zhǔn)確、數(shù)據(jù)豐富、重復(fù)性好、分辨率高和自動(dòng)化程度高等優(yōu)勢(shì)，目前已廣泛應(yīng)用于動(dòng)物[5]、植物[6]、微生物[7]等材料的蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，結(jié)合生物信息學(xué)分析技術(shù)，獲悉了許多關(guān)于生長(zhǎng)發(fā)育、生物與非生物脅迫、細(xì)胞生理功能等相關(guān)分子機(jī)理和調(diào)控機(jī)制。因此，對(duì)茭白采后衰老期間線粒體蛋白質(zhì)表達(dá)譜進(jìn)行研究，能夠更加全面準(zhǔn)確地探明茭白采后衰老的生物學(xué)基礎(chǔ)。然而，應(yīng)用iTRAQ技術(shù)對(duì)茭白采后衰老期間線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)的研究鮮見報(bào)道。

乙烯利（e t h y l e n e，E T）是果蔬常用的催熟劑，可以促進(jìn)多種果蔬的成熟，1-甲基環(huán)丙烯（1-methyleyelopropene，1-MCP）可延緩果蔬采后衰老進(jìn)程，保持果蔬良好的品質(zhì)，二者在果蔬采后成熟衰老過(guò)程中均發(fā)揮重要生理作用[8]。本實(shí)驗(yàn)擬采用i T R A Q結(jié)合二維液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（two-dimensional liquid chromatographytandem mass spectrometry，2D-LC-MS/MS）技術(shù)對(duì)茭白采后常溫貯藏期間以及ET和1-MCP處理后線粒體蛋白質(zhì)表達(dá)譜進(jìn)行比較，篩選差異表達(dá)蛋白并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，探索茭白采后衰老的生物學(xué)基礎(chǔ)，以期為茭白貯運(yùn)保鮮新技術(shù)的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)用茭白于6月下旬采自安徽大別山露天種植田，當(dāng)天運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，充分散去田間熱后，挑選無(wú)感官異常、形態(tài)大小一致的茭白，自來(lái)水清洗，室溫下晾干。

ET、1-甲基環(huán)丙烯、蔗糖、甘露醇、聚乙烯吡烙烷酮、乙二胺四乙酸、L-半胱氨酸、牛血清白蛋白、Percoll、iTRAQ8 plex試劑盒（AB SCIEX）、Tris-HCl（pH 6.8、pH 8.5、pH 8.8）、溴酚藍(lán)、Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒 南京壽德試驗(yàn)器材有限公司；尿素、硫脲、二硫蘇糖醇、3-（3-（膽酰胺丙基）二甲氨基）丙磺酸內(nèi)鹽、碘乙酰胺、IPG Buffer、甲酸、甲酸銨美國(guó)通用電氣公司；十二烷基硫酸鈉、三羧基氨基甲烷、甘氨酸、三氯乙酸、過(guò)硫酸銨、碳酸鈉、N,N,N’,N’-四甲基二乙胺 Amresco公司；三乙基碳酸氫銨緩沖液（triethylammonium bicarbonate buffer，TEAB）、蛋白酶抑制劑 美國(guó)Sigma公司；胰蛋白酶（Trypsin Gold）上海普洛麥格生物產(chǎn)品有限公司。其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SPX-320智能生化培養(yǎng)箱 寧波江南儀器廠；KQ-300DB超聲波清洗機(jī) 昆山市超聲儀器有限公司；FRESCO 17微量高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Thermo電子公司；AJ-30i高速冷凍離心機(jī)、OptimaL-100XP超速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Beckman公司；TGL-16M高速冷凍離心機(jī) 南京馳遠(yuǎn)生物科技有限公司；5810/5810R冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；ImageScanner掃描儀 美國(guó)Healthcare公司；FS-900N超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 上海生析超聲儀器有限公司；1200液相色譜儀 美國(guó)Agilent公司；Eksigent nanoLC-Ultra? 2D系統(tǒng)、TripleTOF 5600系統(tǒng)、Protein Pilot 5.0軟件 美國(guó)AB SCIEX公司。

1.3 方法

1.3.1 ET和1-MCP處理

將晾干的茭白分為3 組，每組取3 kg進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，第一組在1 000 μL/L ET溶液中浸泡30 min后密封19.5 h，第二組在10 μL/L 1-MCP環(huán)境中密封20 h，第三組（對(duì)照）直接密封20 h，實(shí)驗(yàn)設(shè)3 次重復(fù)，用高密度聚乙烯塑料袋敞口包裝，置25 ℃下貯藏0、3 d和6 d，取樣提取純化線粒體。

1.3.2 線粒體提取與純化

參照杜傳來(lái)等[9]的方法提取純化茭白線粒體，每個(gè)樣品進(jìn)行3 次生物學(xué)重復(fù)，純化后的線粒體置于－70 ℃冰箱備用。

1.3.3 茭白線粒體蛋白iTRAQ分析

茭白線粒體蛋白iTRAQ分析委托上海鹿明生物科技有限公司進(jìn)行。

1.3.4 蛋白定性和定量

質(zhì)譜分析原始數(shù)據(jù)為.wiff文件，采用專用的Proteinpilot軟件打開進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)處理采用含Paragon algorithm算法的Protein Pilot Software v. 5.0進(jìn)行，檢索的數(shù)據(jù)庫(kù)為水稻數(shù)據(jù)庫(kù)，數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)源于Uniprot。采用Cutoff Applied＞0.05、Global FDR from Fit≤1%且Peptide≥2為可信蛋白評(píng)判鑒定標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.5 差異表達(dá)蛋白篩選

采用Excel軟件進(jìn)行差異表達(dá)蛋白篩選，以對(duì)照組貯藏0 d為比較基準(zhǔn)，組間蛋白變化倍數(shù)大于2.0或小于0.5，且P＜0.05為差異蛋白，將同一在任意比較組中為差異蛋白的蛋白均列出。

1.3.6 生物信息學(xué)分析

采用DAVID生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)（http://david.abcc.ncifcrf.gov/）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.genome.jp/kegg/mapper.html）對(duì)差異蛋白進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）分類注釋和功能分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 茭白線粒體蛋白質(zhì)譜鑒定結(jié)果

茭白線粒體iTRAQ定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析共獲得1 908 個(gè)可信蛋白，以每組貯藏0 d（CK0d）為相對(duì)定量參考標(biāo)準(zhǔn)，采用組間表達(dá)量變化倍數(shù)大于2.0 倍且重復(fù)組數(shù)據(jù)差異顯著性檢驗(yàn)滿足P＜0.05的蛋白進(jìn)行差異表達(dá)蛋白篩選，共獲得315 個(gè)差異表達(dá)蛋白（6 個(gè)比較組相同的差異蛋白僅統(tǒng)計(jì)1 次），詳細(xì)信息結(jié)果見表1。茭白貯藏期間差異表達(dá)蛋白數(shù)量顯著增多，對(duì)照組貯藏3 d和6 d后差異表達(dá)蛋白數(shù)量分別為79、121 個(gè)，其中上調(diào)表達(dá)差異蛋白分別為70、91 個(gè)，表明這些蛋白可能與茭白采后衰老密切相關(guān)。ET處理顯著提高了差異表達(dá)蛋白數(shù)量，貯藏3 d和6 d后分別為116、165 個(gè)，與對(duì)照組相比，ET處理組貯藏3 d后上調(diào)和下調(diào)差異表達(dá)蛋白分別增加了3、34 個(gè)，貯藏6 d后分別增加了44、0 個(gè)，這些增加的差異表達(dá)蛋白可能與ET促進(jìn)茭白采后衰老有關(guān)。1-MCP處理也顯著提高了差異表達(dá)蛋白數(shù)量，貯藏3 d和6 d后分別為117、131 個(gè)；但與對(duì)照組相比，1-MCP處理組貯藏3 d和6 d后上調(diào)差異表達(dá)蛋白分別減少了40、6 個(gè)，下調(diào)差異表達(dá)蛋白分別增加了78、16 個(gè)，暗示1-MCP處理可能抑制了衰老相關(guān)蛋白的上調(diào)表達(dá)，從而延緩衰老。

表1 ET和1-MCP處理對(duì)茭白25 ℃貯藏期間線粒體蛋白表達(dá)譜的影響Table1 Effects of ethylene and 1-MCP on mitochondrial protein pro fi le in Z. latifolia during storage at 25 ℃

2.2 差異表達(dá)蛋白的生物信息學(xué)分析

圖1 差異表達(dá)蛋白的GO分類注釋Fig.1 GO annotation of the differentially expressed proteins

將篩選獲得的差異表達(dá)蛋白進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路分析，結(jié)果見圖1、2。圖1A、D顯示，茭白采后貯藏期間差異表達(dá)蛋白參與的生物學(xué)過(guò)程主要集中在單有機(jī)物代謝、單有機(jī)物生物合成、小分子代謝、有機(jī)酸代謝、細(xì)胞氨基酸生物合成、羧酸代謝及含堿基小分子代謝過(guò)程；參與的分子功能主要集中于催化活性、輔因子結(jié)合、裂解酶活性、磷酸吡哆醛結(jié)合、轉(zhuǎn)移酶活性及氧化還原酶活性。ET處理后有機(jī)氮化合物代謝、核苷酸代謝、含堿基小分子代謝和蛋白質(zhì)折疊等生物學(xué)過(guò)程相關(guān)蛋白顯著富集，涉及分子功能主要包括氫離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性、4鐵/4硫簇結(jié)合、離子結(jié)合和陰離子結(jié)合等（圖1B、E）。1-MCP處理后有機(jī)氮化合物代謝、羧酸代謝、含氧酸代謝、有機(jī)氮化合物生物合成、含堿基小分子代謝和核苷酸代謝等過(guò)程相關(guān)蛋白顯著富集，涉及分子功能主要包括陰離子結(jié)合、過(guò)渡金屬離子結(jié)合、氧化還原酶活性、輔酶結(jié)合和碳氧裂解酶活性等（圖1C、F）。以上結(jié)果表明，茭白采后衰老響應(yīng)差異表達(dá)蛋白具有多種分子功能，它們參與多類生物學(xué)過(guò)程，且主要集中在核苷酸代謝、有機(jī)酸代謝及含堿基小分子代謝等方面，ET和1-MCP處理顯著促進(jìn)/抑制了部分生物學(xué)過(guò)程同時(shí)誘導(dǎo)了其他生物學(xué)過(guò)程，這些代謝過(guò)程可能在茭白采后衰老調(diào)控中發(fā)揮重要作用。

圖2 差異表達(dá)蛋白質(zhì)顯著富集的KEGG通路Fig.2 The KEGG pathways for the most signif i cant enrichment of the differentially expressed proteins

圖2 A、D顯示，茭白采后常溫貯藏期間代謝途徑、次生代謝產(chǎn)物生物合成、氨基酸生物合成與代謝相關(guān)蛋白顯著富集。ET和1-MCP處理對(duì)茭白采后貯藏期間KEGG通路有顯著調(diào)控作用。與對(duì)照組相比，ET處理組貯藏3 d后氧化磷酸化和甘氨酸/絲氨酸/蘇氨酸代謝相關(guān)蛋白顯著富集（圖2B），貯藏6 d后磷酸戊糖途徑、丙氨酸/天冬氨酸/谷氨酸代謝、丙氨酸/天冬氨酸/谷氨酸代謝相關(guān)蛋白顯著富集（圖2E）。1-MCP處理組貯藏3 d后三羧酸循環(huán)、丙氨酸/天冬氨酸/谷氨酸代謝、纈氨酸/亮氨酸/異亮氨酸降解途徑相關(guān)蛋白顯著富集（圖2 C），貯藏6 d后磷酸戊糖途徑、C 5支鏈二元酸代謝、纈氨酸/亮氨酸/異亮氨酸降解、丙氨酸/天冬氨酸/谷氨酸代謝途徑相關(guān)蛋白顯著富集（圖2F）。以上結(jié)果表明，ET和1-MCP處理顯著誘導(dǎo)了茭白采后貯藏期間KEGG通路相關(guān)蛋白的改變，這些通路可能與ET和1-MCP調(diào)控茭白采后衰老有密切聯(lián)系。

2.3 差異表達(dá)蛋白的生物學(xué)功能分析

蔬菜采后失去了養(yǎng)分供應(yīng)來(lái)源，同化作用基本停止，異化作用占主導(dǎo)地位，成為利用自身營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行生命活動(dòng)的獨(dú)立個(gè)體。呼吸作用是蔬菜采后貯藏過(guò)程中最主要的生理代謝活動(dòng)，是在多種復(fù)雜酶系統(tǒng)參與下經(jīng)過(guò)許多中間反應(yīng)步驟進(jìn)行的生物氧化還原過(guò)程，同時(shí)直接聯(lián)系著其他各種生理生化代謝，從而制約著蔬菜品質(zhì)變化、抗病能力和貯藏壽命[10]。植物呼吸作用在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)和線粒體中進(jìn)行，且線粒體是細(xì)胞進(jìn)行有氧呼吸的主要場(chǎng)所[10]。本實(shí)驗(yàn)采用iTRAQ標(biāo)記結(jié)合2D-LC-MS/MS技術(shù)，以貯藏0 d（CK0d）為相對(duì)定量參考標(biāo)準(zhǔn)，研究比較了茭白采后常溫貯藏期間及ET和1-MCP處理后線粒體蛋白質(zhì)表達(dá)譜差異，發(fā)現(xiàn)6 個(gè)處理組在常溫貯藏期間共有315 個(gè)蛋白（附表，未列出）表達(dá)量變化倍數(shù)在2.0 倍以上且重復(fù)組數(shù)據(jù)差異顯著（P＜0.05），這些差異蛋白廣泛參與呼吸代謝及其伴隨的物質(zhì)代謝、能量代謝、活性氧代謝、細(xì)胞程序性死亡（programmed cell death，PCD）和細(xì)胞結(jié)構(gòu)降解等生物學(xué)過(guò)程，與前面生物信息學(xué)分析結(jié)果基本一致。

蔬菜呼吸代謝的底物主要是單糖，淀粉和蔗糖代謝可水解為單糖。本實(shí)驗(yàn)中，7 個(gè)差異表達(dá)蛋白參與淀粉和蔗糖代謝，分別為4-α-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶DPE1、α-1,4葡聚糖磷酸化酶、蔗糖合酶1、蔗糖合酶7、β-葡萄糖苷酶6、β-葡萄糖苷酶26及Os03g0278000蛋白。4-α-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶可催化1,4-α-D-葡聚糖轉(zhuǎn)移合成多糖、糖蛋白或糖脂的可逆反應(yīng)[11]；α-1,4葡聚糖磷酸化酶能夠可逆催化麥芽寡糖、淀粉或糖原轉(zhuǎn)化為1-磷酸葡萄糖的磷酸化反應(yīng)[12]；蔗糖合酶是廣泛存在于植物中的一種糖基轉(zhuǎn)移酶，能催化蔗糖的分解及合成反應(yīng)[13]；β-葡萄糖苷酶是糖苷水解酶大家族中的一大類酶，能夠水解結(jié)合于末端非還原性的β-D-葡萄糖苷鍵，同時(shí)釋放出β-D-葡萄糖和相應(yīng)的配基[14]。茭白常溫貯藏期間4-α-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶、α-1,4葡聚糖磷酸化酶、β-葡萄糖苷酶6、β-葡萄糖苷酶26和蔗糖合酶7表達(dá)量均顯著上調(diào)表達(dá)，蔗糖合酶1和Os03g0278000蛋白顯著下調(diào)表達(dá)。ET處理促進(jìn)了貯藏6 d時(shí)4-α-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶、α-1,4葡聚糖磷酸化酶、β-葡萄糖苷酶6和β-葡萄糖苷酶26上調(diào)表達(dá)，1-MCP處理抑制了貯藏3 d時(shí)4-α-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶、α-1,4葡聚糖磷酸化酶、β-葡萄糖苷酶6，但促進(jìn)了β-葡萄糖苷酶26和蔗糖合酶7上調(diào)表達(dá)。以上結(jié)果表明，茭白采后常溫貯藏期間淀粉和蔗糖水解加速，1-MCP處理對(duì)茭白采后淀粉和蔗糖水解有一定延緩作用，ET處理則相反。

蔬菜呼吸代謝途徑有多種，主要包括糖酵解、發(fā)酵途徑、三羧酸循環(huán)、磷酸戊糖途徑和乙醛酸循環(huán)途徑[10]。本實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)鑒定有4 個(gè)蛋白與糖酵解有關(guān)，包括果糖激酶-2、磷酸丙糖異構(gòu)酶、丙酮酸激酶和丙酮酸脫羧酶；11 個(gè)蛋白與三羧酸循環(huán)有關(guān)，包括丙酮酸脫氫酶E1組成亞基α-1、檸檬酸合酶、2 個(gè)異檸檬酸脫氫酶亞基、異檸檬酸脫氫酶、2 個(gè)順烏頭酸酶、二氫硫辛酸脫氫酶、3 個(gè)蘋果酸脫氫酶；10 個(gè)蛋白與磷酸戊糖途徑有關(guān)，包括2 個(gè)6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶、果糖二磷酸醛縮酶、葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶、葡萄糖-6-磷酸/磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)、Os01g0926300、Os05g0524400、Os06g0133800、Os07g0176900和Os08g0154300蛋白；未發(fā)現(xiàn)發(fā)酵途徑相關(guān)差異表達(dá)蛋白。對(duì)上述呼吸代謝途徑相關(guān)差異表達(dá)蛋白進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，茭白采后貯藏期間3 個(gè)糖酵解相關(guān)蛋白顯著下調(diào)表達(dá)，1 個(gè)上調(diào)表達(dá)，三羧酸循環(huán)相關(guān)蛋白均有上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)，但僅有蘋果酸脫氫酶達(dá)到2.0 倍以上差異，而磷酸戊糖途徑相關(guān)蛋白均顯著上調(diào)表達(dá)；ET處理顯著促進(jìn)了貯藏第3天時(shí)糖酵解途徑相關(guān)蛋白下調(diào)表達(dá)趨勢(shì)，貯藏6 d時(shí)與對(duì)照組無(wú)顯著差異，同時(shí)提高了整個(gè)貯藏期間三羧酸循環(huán)、磷酸戊糖途徑相關(guān)蛋白上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)；1-MCP處理顯著促進(jìn)了整個(gè)貯藏期間糖酵解相關(guān)蛋白下調(diào)表達(dá)趨勢(shì)，同時(shí)抑制了三羧酸循環(huán)和磷酸戊糖途徑相關(guān)蛋白的上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)。這一結(jié)果與ET和1-MCP處理對(duì)茭白采后貯藏期間呼吸強(qiáng)度的影響結(jié)果一致。而有研究表明，合成代謝中多處需要呼吸作用產(chǎn)生的ATP供能，糖酵解和三羧酸循環(huán)是植物獲得生命活動(dòng)所需能量的主要途徑，盡管磷酸戊糖途徑的一些中間產(chǎn)物是許多重要有機(jī)物質(zhì)（核酸、芳香族氨基酸等）生物合成的底物，但其提供的能量遠(yuǎn)比三羧酸循環(huán)少得多[15]。由此推測(cè)，茭白采后貯藏期間糖酵解減弱，三羧酸循環(huán)和磷酸戊糖途徑增強(qiáng)導(dǎo)致的能量狀態(tài)改變可能與茭白采后衰老有密切聯(lián)系。

呼吸代謝過(guò)程中糖酵解、三羧酸循環(huán)和磷酸戊糖途徑等脫下的氫被NAD＋或黃素腺嘌呤二核苷酸（flavin adenine dinucleotide，F(xiàn)DA）所接受，它們進(jìn)一步經(jīng)呼吸電子傳遞鏈傳遞給O2生成H2O，同時(shí)偶聯(lián)ADP和Pi進(jìn)行氧化磷酸化生成ATP[16]。本實(shí)驗(yàn)中，19 個(gè)蛋白與呼吸電子傳遞鏈和氧化磷酸化有關(guān)，分別為NADH脫氫酶、電子轉(zhuǎn)移黃素蛋白α亞基、電子轉(zhuǎn)移黃素蛋白β亞基、NADH泛醌氧化還原酶23 kDa亞基、NADH泛醌氧化還原酶75 kDa亞基、黃素蛋白亞基琥珀酸脫氫酶、琥珀酸脫氫酶鐵硫亞基1、NADH-細(xì)胞色素b5還原酶、細(xì)胞色素c、ATP合酶、ATP合酶α亞基、ATP合酶β亞基、ATP合酶γ鏈、無(wú)機(jī)焦磷酸酶、Os02g0816800、Os04g0656100、Os07g0645400、Os08g0478200和Os12g0638700蛋白。茭白采后常溫貯藏期間僅5 個(gè)差異蛋白（黃素蛋白β亞基、ATP合酶α亞基、無(wú)機(jī)焦磷酸酶、Os04g0656100和Os12g0638700蛋白）上調(diào)表達(dá)，其余蛋白均下調(diào)表達(dá)或與貯藏第0天無(wú)顯著差異；ET處理顯著促進(jìn)了貯藏第3天多數(shù)呼吸電子傳遞鏈和氧化磷酸化相關(guān)蛋白下調(diào)表達(dá)，貯藏第6天抑制作用減弱，其中ATP合酶α亞基和無(wú)機(jī)焦磷酸酶表達(dá)量顯著高于對(duì)照組；1-MCP處理延緩了多數(shù)呼吸電子傳遞鏈和氧化磷酸化相關(guān)蛋白下調(diào)表達(dá)。以上結(jié)果表明，茭白采后常溫貯藏期間呼吸電子傳遞和氧化磷酸化減弱，能量供應(yīng)顯著減少，ET處理雖然促進(jìn)了糖酵解和三羧酸循環(huán)，但減弱了氧化磷酸化，從而導(dǎo)致能量虧損，而1-MCP處理有利于維持較高的能量水平。

呼吸電子傳遞鏈在進(jìn)行電子傳遞過(guò)程中，大部分的電子經(jīng)過(guò)末端氧化酶如細(xì)胞色素氧化酶和交替氧化酶?jìng)鹘oO2生成H2O，但也會(huì)有少量電子“漏出”直接與O2結(jié)合形成·、H2O2和·OH等活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）[17]。在正常生命活動(dòng)中，這些ROS可及時(shí)被細(xì)胞內(nèi)酶類抗氧化系統(tǒng)和非酶類抗氧化系統(tǒng)清除并維持在一定的水平[18]。本實(shí)驗(yàn)中，6 個(gè)蛋白與酶類抗氧化系統(tǒng)有關(guān)，分別為[Cu-Zn]超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、[Mn]SOD、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）同工酶B、過(guò)氧化物還原酶-2F、2 個(gè)過(guò)氧化物酶（peroxidase，POD）；4 個(gè)蛋白與非酶類抗氧化系統(tǒng)有關(guān)，分別為L(zhǎng)-半乳糖酸-1,4-內(nèi)酯脫氫酶1、谷胱甘肽還原酶、2-半胱氨酸過(guò)氧化物還原酶BAS1和硫轉(zhuǎn)移酶。酶類抗氧化系統(tǒng)中，茭白采后常溫貯藏期間[Cu-Zn]SOD、[Mn]SOD、CAT同工酶B均顯著上調(diào)表達(dá)，2個(gè)過(guò)氧化物酶在貯藏第3天上調(diào)表達(dá)，貯藏6 d時(shí)下調(diào)表達(dá)，過(guò)氧化物還原酶-2F的表達(dá)在整個(gè)貯藏期間變化不大；ET和1-MCP處理在貯藏第3天均顯著抑制了[Cu-Zn]SOD、[Mn]SOD、CAT同工酶B上調(diào)表達(dá)，但促進(jìn)了2 個(gè)POD上調(diào)表達(dá)，貯藏6 d時(shí)ET處理組出現(xiàn)相反的調(diào)控作用，這可能是ROS積累的重要原因；1-MCP處理顯著促進(jìn)了整個(gè)貯藏期間[Cu-Zn]SOD和2個(gè)POD上調(diào)表達(dá)，提高了ROS清除能力。非酶類抗氧化系統(tǒng)中，谷胱甘肽還原酶、2-半胱氨酸過(guò)氧化物還原酶BAS1和硫轉(zhuǎn)移酶上調(diào)表達(dá)，L-半乳糖酸-1,4-內(nèi)酯脫氫酶1下調(diào)表達(dá)。ET處理顯著抑制了貯藏3 d時(shí)L-半乳糖酸-1,4-內(nèi)酯脫氫酶1、谷胱甘肽還原酶、硫轉(zhuǎn)移酶表達(dá)，促進(jìn)了2-半胱氨酸過(guò)氧化物還原酶BAS1上調(diào)表達(dá)。上述ROS清除酶類的上調(diào)表達(dá)可能暗示線粒體受到ROS的氧化脅迫程度提高，ET和1-MCP處理對(duì)ROS代謝有調(diào)控作用。

研究表明，線粒體ROS代謝狀態(tài)可能在PCD中占據(jù)重要地位[19]。徐建興[20]進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，10－9mol/L水平的ROS促進(jìn)細(xì)胞增殖，10－6mol/L水平的ROS引起PCD，10－3mol/L水平的ROS引起細(xì)胞的損傷死亡，表明ROS代謝狀態(tài)與PCD存在緊密聯(lián)系。目前關(guān)于植物線粒體內(nèi)ROS的正常水平尚不清楚，但當(dāng)ROS水平超出自身清除系統(tǒng)所及范圍時(shí)會(huì)使線粒體處于氧化脅迫狀態(tài)，引起線粒體呼吸鏈酶活性下降和膜脂過(guò)氧化水平增強(qiáng)以及DNA損傷，這將使呼吸電子傳遞鏈不通暢而導(dǎo)致漏電程度增高，造成ROS積累增多和呼吸鏈進(jìn)一步受損，如此惡性循環(huán)使線粒體的ROS代謝狀態(tài)不斷惡化，進(jìn)而激活PCD甚至導(dǎo)致細(xì)胞壞死[21]。本實(shí)驗(yàn)中，盡管沒(méi)有直接證據(jù)證明ROS積累造成線粒體DNA損傷，但經(jīng)鑒定有5 個(gè)差異表達(dá)蛋白（組蛋白H2A、H2A.1、H2A.6、H2B.10和H4）與遺傳物質(zhì)的載體染色質(zhì)相關(guān)。線粒體與原核細(xì)胞相似，沒(méi)有染色體，只有染色質(zhì)[22]。染色質(zhì)是間期細(xì)胞核內(nèi)由DNA、組蛋白、非組蛋白及少量RNA組成的線性復(fù)合結(jié)構(gòu)，是間期細(xì)胞遺傳物質(zhì)的載體和存在形式[23]。茭白采后常溫貯藏期間5 個(gè)組蛋白均顯著下調(diào)表達(dá)，1-MCP處理抑制了5 個(gè)組蛋白下調(diào)表達(dá)趨勢(shì)，ET處理有相反的結(jié)果，暗示1-MCP處理可能通過(guò)降低ROS脅迫而減輕DNA損傷。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)1 個(gè)蛋白（膜聯(lián)蛋白V）與PCD有關(guān)。膜聯(lián)蛋白V是一種檢測(cè)PCD的試劑，尤其在PCD早期檢測(cè)中靈敏度較高[24]。茭白采后常溫貯藏期間膜聯(lián)蛋白V顯著上調(diào)表達(dá)，貯藏3 d和6 d時(shí)分別為貯藏0 d的4.1305 倍和4.9659 倍，表明茭白采后貯藏期間PCD顯著升高。1-MCP/ET處理顯著抑制/促進(jìn)了膜聯(lián)蛋白V上調(diào)表達(dá)，推測(cè)1-MCP處理可能維持了較好的ROS代謝狀態(tài)和能量供應(yīng)水平，減輕了DNA損傷程度，從而抑制茭白采后貯藏期間PCD，延緩衰老。

呼吸代謝在提供生命活動(dòng)所需能量的同時(shí)，還會(huì)產(chǎn)生許多中間產(chǎn)物，其中有些十分活躍，是進(jìn)一步合成其他有機(jī)物如蛋白質(zhì)、氨基酸、脂肪、核酸以及次生代謝產(chǎn)物的物質(zhì)基礎(chǔ)，并廣泛參與相應(yīng)的生理過(guò)程[10]。本實(shí)驗(yàn)中，與蛋白質(zhì)代謝、氨基酸代謝、脂類代謝、核酸代謝、有機(jī)酸代謝及次生代謝相關(guān)的差異表達(dá)蛋白分別有36、58、15、8、13 個(gè)和14 個(gè)。對(duì)上述代謝相關(guān)蛋白的差異表達(dá)趨勢(shì)分析發(fā)現(xiàn)，茭白采后常溫貯藏期間23 個(gè)蛋白質(zhì)合成相關(guān)蛋白中僅有6 個(gè)上調(diào)表達(dá)，而13 個(gè)蛋白降解相關(guān)蛋白中有11 個(gè)上調(diào)表達(dá)；氨基酸代謝相關(guān)差異表達(dá)蛋白涉及20 種氨基酸的合成和鳥氨酸循環(huán)，多數(shù)氨基酸合成相關(guān)蛋白在貯藏期間上調(diào)表達(dá)，鳥氨酸循環(huán)相關(guān)蛋白均顯著上調(diào)表達(dá)；脂類代謝相關(guān)蛋白中3 個(gè)甘油酯代謝、2 個(gè)脂肪水解、1 個(gè)脂肪酸氧化、6 個(gè)脂肪酸生物合成、2 個(gè)鞘脂代謝相關(guān)蛋白均上調(diào)表達(dá)，1 個(gè)磷脂代謝相關(guān)蛋白下調(diào)表達(dá)；核酸代謝相關(guān)蛋白中7 個(gè)上調(diào)表達(dá)，1 個(gè)下調(diào)表達(dá)；有機(jī)酸代謝相關(guān)蛋白中10 個(gè)蛋白上調(diào)表達(dá)，3 個(gè)蛋白與貯藏0 d無(wú)顯著差異；次生代謝相關(guān)蛋白中13 個(gè)上調(diào)表達(dá)，1 個(gè)下調(diào)表達(dá)。以上結(jié)果表明，茭白采后常溫貯藏期間蛋白質(zhì)合成減弱而降解增強(qiáng)，氨基酸合成和鳥氨酸循環(huán)顯著提高，脂肪合成和脂質(zhì)氧化反應(yīng)均加速，核酸、有機(jī)酸及次生代謝也顯著加快，這可能與茭白采后貯藏期間物質(zhì)分解消耗增多，需要更多地合成相應(yīng)物質(zhì)以維持正常的生理功能有關(guān)。1-MCP處理對(duì)上述物質(zhì)代謝相關(guān)蛋白表達(dá)有顯著的抑制作用，ET處理有促進(jìn)作用，表明1-MCP處理有利于延緩物質(zhì)分解消耗。

需要特別指出的是，1-MCP處理在貯藏第3天對(duì)絕大多數(shù)物質(zhì)代謝相關(guān)蛋白的上調(diào)/下調(diào)表達(dá)有抑制作用，但顯著促進(jìn)了次生代謝相關(guān)蛋白細(xì)胞色素P450 74A2和脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）上調(diào)表達(dá)。細(xì)胞色素P450 74A2編碼丙二烯氧合酶，該酶可以轉(zhuǎn)化由LOX催化衍生的脂肪酸氫過(guò)氧化物成不穩(wěn)定的重要脂類中間體丙二烯氧化物，再經(jīng)丙二烯氧化物環(huán)化酶、12-氧-植物二烯酸還原酶等催化生成茉莉酸[25]。茉莉酸類是植物傷反應(yīng)中的重要信號(hào)分子，在植物防御機(jī)制中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[25]。那么這是否暗示1-MCP處理提高了茭白采后對(duì)外界不良環(huán)境的防御能力而延緩衰老，還有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

呼吸代謝中間產(chǎn)物與植物細(xì)胞壁物質(zhì)的合成與也有緊密聯(lián)系，細(xì)胞衰老過(guò)程中伴隨著細(xì)胞壁化學(xué)組成的變化[26]。本實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)鑒定有3 個(gè)蛋白與纖維素合成有關(guān)，3 個(gè)蛋白與木質(zhì)素合成有關(guān)。茭白采后常溫貯藏期間3 個(gè)纖維素合成相關(guān)蛋白（纖維素合成酶催化亞基1[UDP]、纖維素合成酶催化亞基5[UDP]、纖維素合成酶催化亞基8[UDP]）均顯著下調(diào)表達(dá)，而3 個(gè)木質(zhì)素合成相關(guān)蛋白（3-磷酸莽草酸1-羧乙烯基轉(zhuǎn)移酶、脫氫奎尼酸脫水酶、肉桂酸-4-羥化酶）均顯著上調(diào)表達(dá)，1-MCP處理對(duì)纖維素合成相關(guān)蛋白無(wú)顯著影響，但抑制了木質(zhì)素合成相關(guān)蛋白上調(diào)表達(dá)，表明茭白采后木質(zhì)化是其衰老的一個(gè)重要特征。這一結(jié)果與前期研究中發(fā)現(xiàn)茭白貯藏過(guò)程中酚類物質(zhì)和木質(zhì)素含量顯著上升的結(jié)果一致。

茭白采后常溫貯藏期間可能與衰老相關(guān)的其他差異表達(dá)蛋白中，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白10 個(gè)，脅迫響應(yīng)與防御相關(guān)蛋白20 個(gè)，內(nèi)吞作用相關(guān)蛋白8 個(gè)，吞噬體和輔助因子相關(guān)蛋白各3 個(gè)，磷酸肌醇代謝、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)、同源重組、蛋白質(zhì)互作、外膜結(jié)構(gòu)維持和線粒體分裂相關(guān)蛋白各1 個(gè)。

細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是細(xì)胞外因子通過(guò)與受體（膜受體或核受體）結(jié)合，引發(fā)細(xì)胞內(nèi)一系列生化反應(yīng)及蛋白間相互作用，從而影響細(xì)胞生物學(xué)功能的過(guò)程[27]。研究表明，蛋白激酶和蛋白磷酸酶催化的蛋白質(zhì)磷酸化與去磷酸化在生物體細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中扮演重要角色，涉及如光合作用、糖代謝、細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育及基因表達(dá)等幾乎所有的生理及病理過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)6 個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白（磷脂酰肌醇磷脂酶C、EF手型鈣結(jié)合蛋白、類受體蛋白激酶1、MAP3K類蛋白、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶、2C類蛋白磷酸酶41）顯著上調(diào)表達(dá)。一般認(rèn)為，植物對(duì)外界刺激的反應(yīng)主要是通過(guò)細(xì)胞質(zhì)中Ca2＋濃度的瞬間變化來(lái)傳遞的[28]，磷脂酰肌醇磷脂酶C可誘發(fā)Ca2＋從胞內(nèi)儲(chǔ)庫(kù)中釋放出來(lái)，瞬間增加細(xì)胞質(zhì)中Ca2＋濃度[29]，EF手型鈣結(jié)合蛋白通過(guò)與Ca2＋結(jié)合成為激活態(tài)，在體內(nèi)參與多種生物學(xué)功能[30]。植物類受體蛋白激酶1屬于蛋白激酶的一個(gè)亞家族，通過(guò)胞外結(jié)構(gòu)域識(shí)別病原信號(hào)分子，發(fā)生磷酸化或去磷酸化反應(yīng)而開啟或關(guān)閉下游靶蛋白，將胞外信號(hào)轉(zhuǎn)換為胞質(zhì)信號(hào)[31]。MAP3K類蛋白和2C類蛋白磷酸酶41均是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶[32]。絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶幾乎參與所有生理及病理等逆境脅迫響應(yīng)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程[32]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)水稻抗白葉枯病基因Xa21[33]、番茄抗假單孢菌基因Pto[34]和玉米抗葉銹病基因Lr10[35]等抗病基因都編碼受體樣蛋白激酶，并含有絲氨酸/蘇氨酸類蛋白激酶結(jié)構(gòu)域。以上6 個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白顯著上調(diào)表達(dá)暗示鈣信號(hào)途徑可能是茭白采后衰老響應(yīng)的重要途徑，茭白常溫貯藏期間受到的生物性脅迫顯著增加，造成茭白自身防御能力下降，9 個(gè)脅迫響應(yīng)與防御相關(guān)蛋白的顯著上調(diào)表達(dá)進(jìn)一步予以證實(shí)。1-MCP處理顯著抑制了上述6 個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白上調(diào)表達(dá)，表明1-MCP處理提高了茭白對(duì)外界不良環(huán)境的防御能力而使脅迫響應(yīng)減弱。

圖3 茭白采后衰老可能的信號(hào)通路Fig.3 Possible signaling pathways involved in postharvest senescence of Zizania latifolia

與此同時(shí)，4 個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白（GTP結(jié)合蛋白R(shí)ab6、線粒體Rho GTP酶、腺苷酸環(huán)化酶相關(guān)蛋白、C2結(jié)構(gòu)域蛋白）下調(diào)表達(dá)。G蛋白普遍存在于真核生物細(xì)胞中，其中植物細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)G蛋白主要有3 類：異三聚體G蛋白、小G蛋白和幾種特殊的GTP結(jié)合蛋白[36]，而小G蛋白又包括5 個(gè)亞家族，即Ras、Rho、Rab、Arf和Ran，每個(gè)亞家族在細(xì)胞中起著不同的調(diào)控作用[37]。研究表明，Rho家族成員可能參與絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和肌動(dòng)蛋白重組過(guò)程調(diào)控，Rab家族參與膜轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程[38]。腺苷酸環(huán)化酶可催化ATP分解生成3’,5’-環(huán)磷酸腺苷（cAMP）和焦磷酸（ppi），是cAMP跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)體系中的重要效應(yīng)器[39]。C2結(jié)構(gòu)域蛋白大多定位于細(xì)胞膜系統(tǒng)，可能參與了逆境信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑或膜轉(zhuǎn)運(yùn)[40]。本實(shí)驗(yàn)中，GTP結(jié)合蛋白R(shí)ab6和Rho GTP酶均隸屬于小G蛋白R(shí)as超家族，且激活型G蛋白（Gs）可介導(dǎo)受體與腺苷酸環(huán)化酶之間的相互作用，從而激活腺苷酸環(huán)化酶，調(diào)節(jié)胞內(nèi)第二信使cAMP水平，將細(xì)胞外信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞內(nèi)信號(hào)[41]。本實(shí)驗(yàn)中上述4 個(gè)蛋白均下調(diào)表達(dá)，這一結(jié)果與王韋華等[1]在研究完整茭白常溫貯藏期間總蛋白表達(dá)譜差異時(shí)發(fā)現(xiàn)Ras相關(guān)小G蛋白和C2結(jié)構(gòu)域蛋白下調(diào)表達(dá)結(jié)果一致，但與鮮切茭白貯藏期間顯著上調(diào)表達(dá)相反，表明cAMP信號(hào)途徑與傷脅迫響應(yīng)密切相關(guān)但對(duì)衰老的響應(yīng)并不明顯。

綜合上述分析，參考Cell Signaling Technology, Inc.（https://www.cellsignal.com/contents/ research/science/science）所提供的已知信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)通路，推測(cè)茭白采后衰老過(guò)程中可能通過(guò)ROS激活Ca2＋/MAPKs、細(xì)胞色素c和茉莉酸等信號(hào)參與茭白采后衰老調(diào)控，其可能的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路見圖3。

內(nèi)吞作用、吞噬體、輔助因子相關(guān)蛋白、磷酸肌醇代謝、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)、同源重組及蛋白質(zhì)互作等相關(guān)蛋白中僅有類MDR ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、發(fā)夾結(jié)構(gòu)1結(jié)合蛋白和Os05g0303000蛋白顯著上調(diào)表達(dá)，其余蛋白均顯著下調(diào)表達(dá)，但這些蛋白與茭白采后衰老的確切關(guān)系尚不清楚，還有待進(jìn)一步深入研究。

此外，39 個(gè)差異表達(dá)蛋白經(jīng)鑒定既沒(méi)有確切的名稱，也沒(méi)有相應(yīng)的KEGG通路，其中22 個(gè)蛋白在茭白采后常溫貯藏期間上調(diào)表達(dá)，17 個(gè)蛋白下調(diào)表達(dá)，ET處理對(duì)少數(shù)蛋白的表達(dá)趨勢(shì)有促進(jìn)作用，1-MCP對(duì)多數(shù)蛋白的表達(dá)趨勢(shì)有抑制作用，表明它們可能與茭白采后衰老存在一定聯(lián)系。

3 結(jié) 論

應(yīng)用iTRAQ技術(shù)共鑒定獲得茭白線粒體蛋白質(zhì)1 908 個(gè)，以貯藏第0天（CK0d）為相對(duì)定量參考標(biāo)準(zhǔn)，茭白貯藏期間及ET和1-MCP處理茭白線粒體表現(xiàn)2.0 倍以上顯著差異（P＜0.05）的蛋白質(zhì)共計(jì)315 個(gè)。

代謝途徑、次生代謝產(chǎn)物生物合成、氨基酸生物合成與代謝、核苷酸代謝、含堿基小分子代謝途徑等可能與茭白采后衰老有關(guān)，三羧酸循環(huán)、氧化磷酸化、磷酸戊糖途徑、C5支鏈酸代謝及氨基酸代謝途徑可能在茭白采后衰老過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

茭白采后碳水化合物水解加速，磷酸戊糖途徑加強(qiáng)而糖酵解途徑和氧化磷酸化減弱，導(dǎo)致能量合成減少同時(shí)形成氧化脅迫，這可能激活Ca2＋/MAPKs、細(xì)胞色素c和茉莉酸等信號(hào)途徑，造成初級(jí)代謝紊亂和次級(jí)代謝產(chǎn)物（如木質(zhì)素）積累，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡或細(xì)胞壞死，最終加速衰老。

茭白采后衰老過(guò)程中可能通過(guò)ROS積累激活Ca2＋/MAPKs、細(xì)胞色素c和茉莉酸等信號(hào)進(jìn)行調(diào)控，而cAMP信號(hào)途徑與傷脅迫響應(yīng)密切相關(guān)但對(duì)衰老的響應(yīng)并不明顯，茉莉酸信號(hào)和磷酸肌醇信號(hào)可能協(xié)同鈣信號(hào)在茭白采后衰老過(guò)程中發(fā)揮作用。

然而，以上差異表達(dá)蛋白的生物學(xué)功能及其相互作用仍待進(jìn)一步驗(yàn)證，相關(guān)通路與茭白采后衰老的確切關(guān)系還需深入研究。