益生性植物乳桿菌的溫度脅迫處理及其對(duì)發(fā)酵冰淇淋品質(zhì)和菌活性的影響

趙 雯，吳鳳玉，鄭 義，張 健，姜蕓云，趙 笑，楊貞耐

（北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室，北京工商大學(xué)，北京 100048）

益生菌冰淇淋是在冰淇淋原本美味的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步賦予產(chǎn)品良好的腸道益生特性，因此廣受歡迎，是冷飲市場(chǎng)近年研究與開發(fā)的熱點(diǎn)。益生菌冰淇淋自1970年在美國上市以來，其銷量占比已經(jīng)超過了冷飲市場(chǎng)總體的25%，而中國益生菌冰淇淋銷量預(yù)計(jì)將達(dá)到100億 元市場(chǎng)規(guī)模[1]。

冰淇淋配料種類豐富，可以為益生菌提供充足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)如乳蛋白、乳脂肪、乳糖、維生素等，并且具有較為溫和的pH值環(huán)境，因此被認(rèn)為是良好的益生菌傳遞載體[2]。然而，冰淇淋制作過程需要低溫凝凍，運(yùn)輸過程中不可避免的凍融循環(huán)以及長(zhǎng)時(shí)間低溫貯藏都會(huì)對(duì)菌體造成冷凍損傷[3]。低溫環(huán)境下，菌體對(duì)碳水化合物與氨基酸的利用能力下降，細(xì)胞膜的流動(dòng)性下降，膜相關(guān)功能受損，RNA形成穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)合成速率減緩，對(duì)冰淇淋中活菌數(shù)和菌活性的保持產(chǎn)生不利影響[4]。實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，冰淇淋經(jīng)凝凍過程和4 周低溫冷凍貯藏后，植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）YW11活菌數(shù)下降0.8～1.61 個(gè)數(shù)量級(jí)，耐酸和膽鹽的特性也隨之下降[5]。世界衛(wèi)生組織對(duì)益生菌產(chǎn)品的定義為食品中含有充足數(shù)量的活的微生物，經(jīng)過食品加工的各個(gè)過程，以及進(jìn)入人體腸道以后，仍能保持適當(dāng)?shù)幕罹鷶?shù)量和菌活性[6]。研究指出益生菌產(chǎn)品若想達(dá)到其預(yù)期的功能特性，益生菌活菌數(shù)在產(chǎn)品貨架期內(nèi)應(yīng)保持在106～107CFU/g范圍內(nèi)[7]。在巴西，法律規(guī)定，活菌數(shù)應(yīng)在108～109CFU/g范圍內(nèi)才可以在產(chǎn)品標(biāo)簽上標(biāo)注為含有益生菌食品[8]。因此如何保持菌株在冰淇淋產(chǎn)品生產(chǎn)加工及貯存過程中的活菌數(shù)和菌活性，成為目前亟待解決的問題。

多種策略應(yīng)用于如何保護(hù)菌株以緩解低溫脅迫對(duì)其體造成的傷害，如脅迫預(yù)處理、添加巧克力等保護(hù)因子、微膠囊包埋技術(shù)、優(yōu)化冰淇淋配料組成及產(chǎn)品加工工藝等[9-11]。其中脅迫預(yù)處理會(huì)誘使菌體進(jìn)化出特定的脅迫-敏感系統(tǒng)以及脅迫-防御機(jī)制，使得菌體可以耐受長(zhǎng)期不利的環(huán)境條件或突然的環(huán)境改變[12-13]。冷激蛋白（cold-shock protein，CSP）家族是微生物在低溫環(huán)境下誘導(dǎo)產(chǎn)生的一類重要分子伴侶家族，參與轉(zhuǎn)錄、翻譯、蛋白質(zhì)折疊等一系列過程[14]。進(jìn)一步研究表明，細(xì)菌在應(yīng)對(duì)高溫脅迫環(huán)境時(shí)，會(huì)誘導(dǎo)出與低溫脅迫相似的代謝通路與蛋白質(zhì)合成變化，產(chǎn)生交互保護(hù)作用而提高菌株的低溫耐受性[15]。巧克力中含有豐富的可可脂成分，可在菌體周圍形成保護(hù)層，進(jìn)而對(duì)外界脅迫環(huán)境起到緩沖作用，并且有助于益生菌在腸道中的靶向釋放[16]。Silva等[17]使用巧克力作為L(zhǎng). acidophilus LA3和Bifidobacterium animalis subsp. lactis BLC1的傳遞載體，其活菌數(shù)在4 ℃貯存120 d后沒有發(fā)生明顯變化。Kemsawased等[18]使用巧克力作為L(zhǎng). casei 01和L. acidophilus LA5的固定化載體，其活菌數(shù)在4 ℃貯存60 d后大于106CFU/g，并且具有較為良好的模擬腸道環(huán)境耐受性。

本研究利用1 株分離自西藏靈菇的益生性植物乳桿菌K25，將其加入到冰淇淋漿料中，發(fā)酵制備益生菌冰淇淋。前期實(shí)驗(yàn)表明，植物乳桿菌K25能夠提高衰老小鼠的抗氧化能力，降低小鼠血清膽固醇水平，抑制口腔變異鏈球菌；進(jìn)一步對(duì)K25菌株全基因組測(cè)序及蛋白質(zhì)組學(xué)的研究表明，該菌株具有與低溫耐受相關(guān)的基因及蛋白質(zhì)表達(dá)[19-20]；此外K25菌株具有良好的胃酸和膽鹽耐受性，適宜用于冰淇淋的發(fā)酵制作。本研究考察低溫和高溫脅迫預(yù)培養(yǎng)菌株及添加巧克力輔料的方法，對(duì)冰淇淋中益生性植物乳桿菌K25生物活性和腸道環(huán)境耐受性的保護(hù)作用，以及溫度脅迫預(yù)培養(yǎng)后的菌株對(duì)冰淇淋品質(zhì)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植物乳桿菌K25由吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供，菌株保存在含20%甘油的MRS培養(yǎng)基中，－80 ℃凍存。使用前接種于MRS液體培養(yǎng)基，37 ℃連續(xù)活化3 次。

大豆蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、葡萄糖、磷酸氫二鉀、乙酸鈉、檸檬酸鈉、硫酸鎂、硫酸錳、乙酸、瓊脂、吐溫8.0（均為分析純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；脫脂乳粉 新西蘭恒天然集團(tuán)有限公司；奶油雀巢股份有限公司；巧克力醬 費(fèi)列羅股份有限公司。

MRS瓊脂培養(yǎng)基：大豆蛋白胨10.0 g/L、牛肉膏10.0 g/L、酵母粉5.0 g/L、葡萄糖20.0 g/L、吐溫80 1.0 mL/L、磷酸氫二鉀2.0 g/L、乙酸鈉5.0 g/L、檸檬酸鈉5.0 g/L、硫酸鎂0.2 g/L、硫酸錳0.054 g/L、瓊脂15 g/L，蒸餾水1 000 mL，1 mol/L乙酸調(diào)pH值為6.5，121℃滅菌15 min。

1.2 儀器與設(shè)備

GJJ-0.03/100小型實(shí)驗(yàn)室均質(zhì)機(jī) 上海諾尼輕工機(jī)械有限公司；MLS-3750高壓蒸汽滅菌器 日本三洋公司；BQ7225軟質(zhì)冰淇淋機(jī) 黃石東貝制冷有限公司；DV-II黏度計(jì) 英國Brookf i eld公司。

1.3 方法

1.3.1 低溫及高溫脅迫預(yù)處理對(duì)植物乳桿菌K25低溫耐受性的影響

采用不同溫度條件對(duì)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的植物乳桿菌K25進(jìn)行脅迫預(yù)處理，具體方法參照Ergin等[21]，稍作改動(dòng)。分別采取低溫4、10、20 ℃和高溫45、50、55 ℃脅迫處理0.5、1.5、3、5、8、18、24 h。脅迫預(yù)處理后的菌株分為4 部分貯存。一部分于MRS固體培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)72 h測(cè)定初始活菌數(shù)，剩余3 部分則貯藏于－20 ℃，分別在1、15、30 d測(cè)定其活菌數(shù)變化。未經(jīng)處理的植物乳桿菌 K25（對(duì)照）采取相同方法測(cè)定其活菌數(shù)變化。

1.3.2 C-K25與H-K25制作巧克力冰淇淋

圖1 冰淇淋制作流程Fig.1 Flow chart of ice cream production process

分別選用低溫（cold adapted-K25，C-K25）和高溫（heat adapted-K25，H-K25）處理組中終活菌數(shù)最高的兩株菌用于冰淇淋制作，使用未經(jīng)處理的植物乳桿菌K25作對(duì)照組。冰淇淋具體制作方式如圖1所示。

1.3.3 冰淇淋理化性質(zhì)分析

1.3.3.1 滴定酸度和pH值

滴定酸度測(cè)定參照于志會(huì)等[22]方法，略作修改。取10 g冰淇淋漿料樣品，加入20 mL去離子水，充分混勻，加入2 滴酚酞指示劑，用濃度為0.1 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定。滴定酸度為1 g冰淇淋漿料消耗濃度為0.1 mol/L NaOH溶液的毫升數(shù)，消耗1 mL濃度為0.1 mol/L的NaOH溶液相當(dāng)于1 °T。pH值采用pH計(jì)測(cè)定。

1.3.3.2 膨脹率

分別稱取100 mL冰淇淋漿料質(zhì)量M1和冰淇淋成品質(zhì)量M2，測(cè)定其膨脹率，按照式（1）計(jì)算：

1.3.3.3 融化率

稱取25 g于－20 ℃貯存30 d冰淇淋成品，置于0.833 mm的不銹鋼篩網(wǎng)上，在溫度25 ℃、相對(duì)濕度75%的環(huán)境下靜置1 h，每隔10 min稱其融化質(zhì)量，按式（2）計(jì)算融化率：

1.3.3.4 黏度

采用布氏黏度儀測(cè)定老化后的冰淇淋漿料黏度。將－20 ℃冷凍的冰淇淋樣品于4 ℃緩慢解凍，用玻璃棒將冰淇淋樣品輕輕攪拌均勻（順時(shí)針和逆時(shí)針各攪拌10 圈），選用LV34轉(zhuǎn)子，測(cè)定條件為5 r/min，每隔5 s取一個(gè)測(cè)試值，測(cè)定時(shí)間范圍為0～120 s。

1.3.3.5 硬度

冰淇淋樣品在－20 ℃冰箱貯存48 h后，采用Texture Analyzer XT2質(zhì)構(gòu)儀進(jìn)行硬度測(cè)定，P/5 Cylinder stainless探頭，直徑0.5 cm，測(cè)定速率1 mm/s，刺入深度0.5 cm。

1.3.4 冰淇淋中植物乳桿菌K25活菌數(shù)的測(cè)定

采用平板涂布計(jì)數(shù)法測(cè)定冰淇淋冷藏期間的活菌數(shù)。取5 g冰淇淋樣品，45 mL無菌生理鹽水稀釋。取稀釋后的樣品溶液1 mL，梯度稀釋后，取適宜的稀釋液倍數(shù)接種于MRS固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)48 h，記錄各組冰淇淋樣品漿料－20 ℃貯存1、15、30、60 d后活菌數(shù)變化。

1.3.5 冰淇淋中植物乳桿菌K25模擬胃腸道耐受性實(shí)驗(yàn)

?。?0 ℃貯存30 d的冰淇淋樣品，測(cè)定植物乳桿菌K25在體外模擬胃腸道環(huán)境下的存活能力。植物乳桿菌K25對(duì)人工模擬胃液、腸液的耐受性測(cè)定方法參照Buriti等[23]方法，略作改動(dòng)。取冰淇淋樣品25 g，使用22 mL 0.05 g/L NaCl溶液稀釋后混合均勻制成樣品溶液。人工模擬胃液：取10 mL樣品溶液，0.5 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH 2.6～3.0，加入0.3 mL 3 mg/mL胃蛋白酶溶液，充分混勻后，37 ℃培養(yǎng)2 h，MRS固體培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h測(cè)定活菌數(shù)。人工模擬胰液：取10 mL樣品溶液，1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH 4.9～5.4。加入膽鹽與胰酶分別至終質(zhì)量濃度6、1 mg/mL，充分混勻后37 ℃培養(yǎng)2 h，MRS固體培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h測(cè)定活菌數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 16.0處理數(shù)據(jù)，圖表在Origin 7.5中生成，所有組別數(shù)據(jù)均測(cè)定3 次后取平均值，ANOVA進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溫度脅迫預(yù)處理對(duì)植物乳桿菌K25低溫耐受性的影響

圖2 不同溫度脅迫－20 ℃處理活菌數(shù)變化Fig.2 Change in viable counts of L. plantarum K25 during storage at -20 ℃

如圖2所示，所有組別的植物乳桿菌K25初始活菌數(shù)大致相同（108CFU/mL），低溫脅迫1.5～24 h范圍內(nèi)，植物乳桿菌K25初始活菌數(shù)均略有增長(zhǎng)，相反，熱處理超過8 h后檢測(cè)不到活菌數(shù)，表明植物乳桿菌K25不能耐受長(zhǎng)時(shí)間高溫環(huán)境。

植物乳桿菌K25在－20 ℃環(huán)境下貯存30 d后，其活菌數(shù)由最初的108CFU/mL降至104CFU/mL。圖2 A～C顯示，貯存1 d后，活菌數(shù)保持在1.12×107～1.2×108CFU/mL范圍內(nèi)，貯存30 d后，活菌數(shù)在1.5×104～1.10×106CFU/mL范圍內(nèi)，其中以貯存時(shí)間為15 d時(shí)，其活菌數(shù)下降幅度明顯。10 ℃-18 h、10 ℃-24 h組凍藏30 d后其活菌數(shù)分別為1.14×105CFU/mL和2.20×105CFU/mL，而4 ℃-18 h組終活菌數(shù)最高1.10×106CFU/mL，為對(duì)照組活菌數(shù)的12 倍。圖2D～F顯示，貯存1 d后，活菌數(shù)保持在1.24×108～8.0×108CFU/mL。4 5℃-0.5 h組在－2 0 ℃貯存3 0 d后其活菌數(shù)為5.4×105CFU/mL，而55 ℃-0.5 h組終活菌數(shù)最高，為1.35×106CFU/mL，為對(duì)照組活菌數(shù)的15 倍。Wouters等[24]研究表明，L. lactis MG1363在10 ℃預(yù)先處理4 h后，于－20 ℃環(huán)境下貯存24 h菌株存活率增加約100 倍。Walker等[25]研究指出L. johnsonii VPI 11088在55 ℃脅迫預(yù)處理30 min后在－20 ℃貯存7 d，其活菌數(shù)與對(duì)照組相比增加了20%。Shao Yuyu等[26]研究指出，亞致死溫度脅迫預(yù)處理誘導(dǎo)CSP編輯基因（cspA、cspB、cspC、cspD、cspE、cspF）過表達(dá)，該家族基因表達(dá)能夠提高菌株低溫耐受性。Komatsu等[27]則進(jìn)一步證明熱脅迫處理?xiàng)l件下誘導(dǎo)產(chǎn)生的熱激蛋白同樣可以增加細(xì)胞的冷凍耐受性，該蛋白可通過與大分子物質(zhì)疏水相互作用進(jìn)而增加其穩(wěn)定性以發(fā)揮保護(hù)作用。Kandil等[28]則認(rèn)為溫度預(yù)處理能夠提高菌株低溫耐受性主要源于不同溫度下酶構(gòu)象和活性的改變。

在所有溫度時(shí)間相互作用關(guān)系中，4 ℃-18 h與55 ℃-0.5 h脅迫預(yù)處理后植物乳桿菌K25在－20 ℃貯存30 d內(nèi)降幅最小、終活菌數(shù)最高，活菌數(shù)分別由8.16（lg（CFU/mL））降至5.96（lg（CFU/mL））、9.25（lg（CFU/mL））降至6.13（lg（CFU/mL）），分別降低2.2、3.12 個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)，對(duì)照組則由8.25 （lg（CFU/mL））降低至4.60（lg（CFU/mL）），降低3.65 個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)。4 ℃-18 h與55 ℃-0.5 h脅迫預(yù)處理后植物乳桿菌K25在－20 ℃貯存30 d后的活菌數(shù)與未經(jīng)處理的菌株相比分別提高了18.2%與10.4%，因此選用該2 種脅迫處理后的K25菌株用作冰淇淋的加工制作。

2.2 冰淇淋產(chǎn)品理化指標(biāo)分析

表1 冰淇淋理化性質(zhì)測(cè)定結(jié)果Table1 Physicochemical properties of ice cream fermented with cold-/heat- adapted L. plantarum K25

冰淇淋產(chǎn)品的酸度、膨脹率、融化率、黏度、硬度是影響產(chǎn)品口感與消費(fèi)者感官的主要理化因素[29]，本實(shí)驗(yàn)對(duì)冰淇淋產(chǎn)品理化指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果如表1所示。相同發(fā)酵時(shí)間內(nèi)，不同組別的冰淇淋pH值、滴定酸度、膨脹率和融化率變化分別在5.82～6.11、30～45 °T、19.46%～44.93%、13.17～19.00 g/min范圍內(nèi)。其中溫度脅迫處理后的K25發(fā)酵冰淇淋pH值較低，可能歸因?yàn)槊{迫處理影響了菌株的代謝通路，促進(jìn)菌體產(chǎn)酸[14]。而C-K25組發(fā)酵冰淇淋膨脹率較高（35.81%）且融化率較低（14.67 g/min），具有良好的冰淇淋理化特性。不同組別的冰淇淋在黏度與硬度變化分別在707～1 079 mPa·s和728～1 156 N范圍內(nèi)，差異較為顯著（P＜0.05）。經(jīng)脅迫處理后的植物乳桿菌K25發(fā)酵冰淇淋黏度、硬度均高于未處理組。不同組別理化性質(zhì)的差別可能歸因于脅迫環(huán)境下，菌株分泌過量的胞外多糖等代謝產(chǎn)物以保護(hù)菌體，這些代謝產(chǎn)物會(huì)對(duì)冰淇淋產(chǎn)品的黏度和硬度產(chǎn)生影響。Van Laere等[30]指出在亞致死高溫脅迫下，與胞外多糖合成相關(guān)的半乳糖酶活性明顯增強(qiáng)，進(jìn)而促進(jìn)胞外多糖的分泌。Nguten等[31]進(jìn)一步指出胞外多糖黏附在細(xì)胞表面，降低細(xì)胞表面凈電荷，進(jìn)而增加其對(duì)不良環(huán)境的耐受性。Dertli等[32]研究則表明，與不產(chǎn)胞外多糖的菌株相比，使用產(chǎn)胞外多糖的菌株發(fā)酵冰淇淋，產(chǎn)品具有更高的黏度。Ergin等[21]使用溫度脅迫預(yù)處理后的菌株發(fā)酵冰淇淋，其產(chǎn)品的黏度與硬度增加，將其解釋為產(chǎn)品中菌株活性增加引起的胞外多糖產(chǎn)量增加。

2.3 植物乳桿菌K25發(fā)酵冰淇淋的活菌數(shù)變化

表2 低溫和高溫脅迫處理后的植物乳桿菌K25發(fā)酵冰淇淋于－20 ℃貯存60 d后的活菌數(shù)變化Table2 Viable counts of cold-/heat- adapted L. plantarum K25 in ice cream during storage for 60 days at-20 ℃（lg（CFU/mL））

保持菌株在產(chǎn)品冷凍加工過程以及貨架期期間的活菌數(shù)和生物活性對(duì)冰淇淋產(chǎn)品的益生特性具有顯著意義。不同組別冰淇淋漿料及－20 ℃貯存60 d內(nèi)的活菌數(shù)變化如表2所示，植物乳桿菌K25發(fā)酵冰淇淋初始活菌數(shù)為8.48（lg（CFU/mL））。L. acidophilus、B. lactis Bb12、L. casei發(fā)酵冰淇淋的初始活菌數(shù)分別為7.36、7.45、6.49（lg（CFU/mL））[33-36]。結(jié)果表明，植物乳桿菌K25具有較為良好的冰淇淋基質(zhì)發(fā)酵特性，適宜作為冰淇淋的發(fā)酵菌株或輔助發(fā)酵劑以提高產(chǎn)品中的活菌數(shù)。硬化過程活菌數(shù)下降最為明顯，1 d后下降至7.52（lg（CFU/mL））（下降0.96 個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)）。Zhang Jian等[5]對(duì)植物乳桿菌YW11發(fā)酵冰淇淋從加工到貯存期間的活菌數(shù)變化情況進(jìn)行探討，結(jié)果表明硬化過程對(duì)活菌數(shù)影響最大。L. acidophilus La-5和B. animalis Bb-1在冰淇淋凝凍過程中，其活菌數(shù)同樣顯著降低[35]。而Leandro等[36]研究則指出冰淇淋硬化過程對(duì)L. delbrueckii UFV H2b20活菌數(shù)影響較小。Ferraz等[11]指出凝凍對(duì)活菌數(shù)的影響主要與冰淇淋產(chǎn)品的脂肪含量與膨脹率相關(guān)。

植物乳桿菌K25發(fā)酵冰淇淋，從漿料至60 d貯存過程中，其終活菌數(shù)為5.63（lg（CFU/mL）），平均活菌數(shù)為6.8 3（l g（C F U/m L）），活菌數(shù)下降2.8 5 個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)。其中 H-K 2 5 組發(fā)酵冰淇淋從漿料至6 0 d貯存過程中，終活菌數(shù)為7.2 6（l g（C F U/m L）），平均活菌數(shù)為7.7 9（l g（C F U/m L）），活菌數(shù)下降1.2 7 個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)。C-K 2 5發(fā)酵冰淇淋從漿料至貯存過程中，其終活菌數(shù)為7.3 2（l g（C F U/m L）），平均活菌數(shù)為7.8 9（l g（C F U/m L）），活菌數(shù)下降1.36 個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)。結(jié)果表明經(jīng)過高溫、低溫脅迫預(yù)處理后的菌株，在冰淇淋發(fā)酵及貯存期間，其終活菌數(shù)分別提高1.63、1.69 個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)。除對(duì)照組外，所有組別的冰淇淋活菌數(shù)在經(jīng)60 d貯存后，均高于106CFU/mL，滿足益生菌產(chǎn)品對(duì)活菌數(shù)的最基本要求。Arslan等[37]研究指出，通過分級(jí)冷凍的方式對(duì)菌株進(jìn)行預(yù)處理，在冰淇淋發(fā)酵、加工和貯存過程，菌體細(xì)胞對(duì)冷凍條件耐受性增強(qiáng)。Zhang Jian等[5]指出與直接添加菌株發(fā)酵冰淇淋的方式相比，添加冷凍干燥后的菌粉進(jìn)行冰淇淋制作，冰淇淋產(chǎn)品在發(fā)酵和貯存過程中活菌數(shù)保持較為穩(wěn)定。這一方面歸因于冷凍干燥過程添加的保護(hù)劑對(duì)菌株具有一定程度的保護(hù)作用，另一方面則歸因于冷凍條件改變菌株胞內(nèi)酶活性，使其能夠更好地適應(yīng)冷凍條件。有研究[21,38]采取低溫和高溫對(duì)L. acidulous進(jìn)行脅迫預(yù)處理，并使用脅迫后的菌株制作冰淇淋，結(jié)果表明冰淇淋在冷凍貯藏120 d后，脅迫處理后的菌株的菌活數(shù)明顯高于空白組。Chen Mingju等[39]表明熱脅迫、冷脅迫預(yù)處理均可以提高L. kef i ranofaciens M1的低溫耐受特性，并進(jìn)一步提高該菌株的腸道環(huán)境耐受性。

K25-巧組冰淇淋從漿料至60 d貯存過程中，其終活菌數(shù)為6.04（lg（CFU/g）），平均活菌數(shù)為7.04（lg（CFU/mL）），活菌數(shù)下降2.47 個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)。H-K25-巧組（添加巧克力）冰淇淋從漿料至60 d貯存過程中，其終活菌數(shù)為7.40（lg（CFU/mL）），平均活菌數(shù)為7.86（lg（CFU/mL）），活菌數(shù)下降1.16 個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)。C-K25-巧組（添加巧克力）冰淇淋從漿料至60 d貯存過程中，其終活菌數(shù)為7.56（lg（CFU/mL）），平均活菌數(shù)為7.97（lg（CFU/mL）），活菌數(shù)下降1.07 個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)。終活菌數(shù)與相應(yīng)的未添加巧克力組分別提高了0.41、0.26、0.24 個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)，表明巧克力的添加對(duì)菌株具有一定的保護(hù)作用。Possemiers等[40]使用巧克力作為L(zhǎng). helveticus CNCM I-1722和B. longum CNCM I-3470的微膠囊載體，制作益生菌冰淇淋，菌株在冷凍貯存期間活菌數(shù)穩(wěn)定性增加，經(jīng)體外模擬胃酸與膽汁消化后，活菌數(shù)分別保持91%和80%。Champagne等[41]將巧克力加入L. rhamnosus R0011和B. longum R0175微膠囊壁材中制作益生菌冰淇淋，低溫貯存24 周，其存活率高于未加巧克力的包埋組與未包埋組。2.4 耐酸耐膽鹽結(jié)果

表3 人工模擬胃酸和膽鹽環(huán)境對(duì)冰淇淋中不同溫度脅迫處理植物乳桿菌K25活菌數(shù)的影響Table3 Viable counts of cold-/heat-adapted L. plantarum K25 in ice cream during exposure to simulated gastric and bile salt solutions

圖3 冰淇淋－20 ℃貯存30 d后植物乳桿菌K25在人工模擬胃酸和膽鹽環(huán)境下的存活率Fig.3 Survival rates of cold-/heat-adapted L. plantarum K25 in ice cream during exposure to simulated gastric and bile salt solutions

腸道環(huán)境對(duì)菌株活性具有較為顯著的影響[36]，Zárate等[42]研究同時(shí)指出，體內(nèi)與體外實(shí)驗(yàn)對(duì)益生菌腸道耐受性影響具有較為相似的結(jié)果。模擬胃酸環(huán)境脅迫結(jié)果（表3和圖3）表明，6 組冰淇淋樣品中的植物乳桿菌K25存活率由大到小分別為C-K25-巧＞H-K25＞H-K25-巧＞K25-巧＞C-K25＞K25，其中C-K25-巧與K25冰淇淋中存活率分別為92.45%和85.19%。模擬膽鹽溶液脅迫結(jié)果表明，6 組冰淇淋樣品中的植物乳桿菌K25存活率由大到小分別為C-K25-巧＞H-K25-巧＞C-K25＞K25-巧＞K25＞H-K25，其C-K25-巧和H-K25冰淇淋中活菌數(shù)存活率分別為93.71%和90.48%。所有組別的菌株經(jīng)模擬胃腸道環(huán)境脅迫后，其活菌數(shù)并未有顯著改變（P＞0.05），表明脅迫預(yù)處理與巧克力的添加均對(duì)菌株存活具有良好的保護(hù)作用。Silva等[43]指出B. animalis subsp. lactis BLC1與B. animalis subsp. lactis BB-12在酸性環(huán)境下活菌數(shù)分別下降1.24、3 個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)，在膽鹽環(huán)境則分別下降3.82、4 個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)。Beley等[44]則指出膽鹽對(duì)菌株活性影響主要與損傷細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和（或）破壞細(xì)胞穩(wěn)定性相關(guān)。L. delbrueckii UFV H2b20發(fā)酵冰淇淋，在貯存30 d后，其菌株的模擬腸道環(huán)境耐受性結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)相似，研究同時(shí)指出菌株對(duì)膽鹽的耐受程度可能與其生物被膜形成相關(guān)[36]。Alamprese等[45]研究表明，市售冰淇淋在貨架期內(nèi)的凍融循環(huán)會(huì)對(duì)菌株被膜造成破壞，使得菌株在胃液環(huán)境中更容易遭受膽鹽脅迫。Bustos等[46]則進(jìn)一步指出，在人體胃腸道環(huán)境下，食物基質(zhì)可為菌株提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，菌株數(shù)量也有可能出現(xiàn)上升的現(xiàn)象。值得注意的是王輯等[19]前期實(shí)驗(yàn)表明植物乳桿菌K25具有較為良好的耐酸耐膽鹽特性。

3 結(jié) 論

本研究考察不同溫度對(duì)植物乳桿菌K25脅迫處理不同時(shí)間后對(duì)菌株低溫耐受性的影響。結(jié)果表明，經(jīng)4 ℃-18 h（C-K25）與55 ℃-0.5 h（H-K25）脅迫預(yù)處理后的菌株在－20 ℃貯存30 d后活菌數(shù)分別達(dá)到1.10×106、1.35×106CFU/mL，為對(duì)照組的12 倍和15 倍。選用該2 株菌株用作冰淇淋的制作，并且添加巧克力作為輔料。結(jié)果表明，使用脅迫處理后的菌株發(fā)酵降低冰淇淋產(chǎn)品酸度，顯著增加產(chǎn)品的黏度與硬度（P＜0.05），且低溫處理后的K25發(fā)酵對(duì)冰淇淋的膨脹率和融化率產(chǎn)生有益影響。產(chǎn)品于－20 ℃貯存60 d后，C-K25和H-K25活菌數(shù)與對(duì)照組相比分別提高1.63、1.69 個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)，而 C-K25-巧組活菌數(shù)最高，為7.56（lg（CFU/mL））。冰淇淋于－20 ℃貯存30 d后，對(duì)菌株進(jìn)行模擬胃腸道環(huán)境耐受性分析，結(jié)果表明所有組別的菌株均具有較為良好的腸道環(huán)境耐受性。本研究為如何提高植物乳桿菌的低溫耐受性以及冰淇淋產(chǎn)品中植物乳桿菌在貯存期間和人工模擬胃腸道環(huán)境下存活特性提供了研究思路和數(shù)據(jù)支撐，為實(shí)際生產(chǎn)中提高冰淇淋中益生菌的存活率提供一種有效的技術(shù)方法。