自然發(fā)酵錦州小菜中乳酸菌的分離篩選

劉 境，孫慧君,2，李 默，解夢汐，烏日娜，武俊瑞,

（1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽 110866；2.遼寧省農(nóng)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，遼寧 沈陽 110000）

自然發(fā)酵錦州小菜是以黃瓜、青椒、小茄子、蒜等10 種新鮮蔬菜配制優(yōu)質(zhì)蝦油在自然條件下腌制而成的，首先將腌制蔬菜洗凈、淋干后，裝入缸中，再向其中加入蝦油、食鹽、湯汁經(jīng)過腌制3～6 h后，洗凈鹽鹵再加入蝦油腌制7 d而成。小菜具有獨(dú)特的風(fēng)味特征，是錦州的特色美食之一[1-2]。曲玲童等[3]從錦州腌漬小菜中篩選出28 株耐鹽乳酸菌，并對其在不同鹽濃度條件下菌種產(chǎn)酸能力進(jìn)行分析，得到1 株高產(chǎn)耐鹽乳酸菌菌株L7。孫慧君等[4]利用變性梯度凝膠電泳方法從10 份采自不同地區(qū)的傳統(tǒng)發(fā)酵錦州小菜的樣品中鑒定出8 種微生物，其中細(xì)菌屬5 種，真菌屬3 種，證實(shí)自然發(fā)酵錦州小菜含有豐富的乳酸菌資源，是挖掘乳酸菌的寶庫[5-6]。目前普遍認(rèn)為，小菜在腌制過程中最主要的發(fā)酵作用是乳酸菌引起的乳酸發(fā)酵，乳酸的產(chǎn)生不僅降低發(fā)酵蔬菜的酸度，抑制雜菌的生長，而且樣品會形成自身獨(dú)特的風(fēng)味特征[7]。

本實(shí)驗(yàn)對27 份自然發(fā)酵錦州小菜的總酸含量、氨基酸態(tài)氮含量、亞硝酸鹽含量、NaCl含量及菌落總數(shù)進(jìn)行測定，由于發(fā)酵的地點(diǎn)、條件和工藝的不同，導(dǎo)致不同樣品間的成分含量存在差異[6]。氨基酸態(tài)氮又稱為氨基氮，是醬油中的重要組成成分，是醬油調(diào)味品鮮味的主要來源，為發(fā)酵小菜呈現(xiàn)鮮味特征。有些乳酸菌在發(fā)酵過程中可以降低亞硝酸鹽、NaCl和總酸含量，提高產(chǎn)品的營養(yǎng)質(zhì)量和風(fēng)味質(zhì)量，從而發(fā)現(xiàn)樣品風(fēng)味特征變化與小菜發(fā)酵過程中微生物之間的關(guān)系[8-10]。選擇7 份在樣品風(fēng)味特征中具有代表性的自然發(fā)酵錦州小菜進(jìn)行乳酸菌分離篩選，采用16S rDNA序列對比分析，進(jìn)行菌種的鑒定，探究自然發(fā)酵錦州小菜中乳酸菌的構(gòu)成[11-16]。將自然發(fā)酵錦州小菜中成分含量的變化與發(fā)酵期間微生物多樣性聯(lián)系起來有助于合適發(fā)酵劑的選擇，并為工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選取常見的錦州自然發(fā)酵制作的特色小菜作為研究材料，樣品于同一日上午采集于遼寧錦州市內(nèi)3 區(qū)的5 個地點(diǎn)，次日上午采集沈陽皇姑區(qū)早市樣品，共計6 個地點(diǎn)。共采集27 份自然發(fā)酵小菜，每份樣品平行采集3 次。

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨 10 g、無水乙酸鈉3 g、K2HPO42 g、MgSO4·7H2O 0.575 g、MnSO4·H2O 0.25 g、葡萄糖20 g、檸檬酸三鈉2.42 g、酵母粉4 g、牛肉浸膏8 g、吐溫80 1 g、瓊脂（半固體）1.75 g、瓊脂（固體）20 g。不添加瓊脂為MRS液體培養(yǎng)基。試劑均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

20 mg/mL蛋白酶K、dNTP、loading buffer、Marker 2000、溴化乙錠染色液、Taq DNA聚合酶沈陽森宇生物技術(shù)有限公司；正向引物2 7 F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）、反向引物1495R（5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’） 上海派森諾生物技術(shù)有限公司；瓊脂糖 北京沃比森公司；十六烷基三甲基溴化銨（cetyltrimethylammonium ammonium bromide，CTAB）法提取細(xì)菌DNA試劑、含量測定所用試劑（均為分析純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SH2100 pH計 奧豪斯儀器（常州）有限公司；電熱恒溫水浴鍋、電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；ZHJH-C1112C無菌操作臺 北京瑞爾欣德科技有限公司；KDN-04A凱氏定氮儀 浙江托普儀器有限公司；GMSX-280手提式壓力蒸汽滅菌鍋 北京永光明醫(yī)療儀器有限公司；TGL-168高速臺式離心機(jī)、微量紫外分光光度計、New Brunswick超低溫冰箱德國Eppendorf公司； 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增儀、凝膠成像系統(tǒng) 美國伯樂公司；DYY-6C電泳儀 北京六一儀器廠；真空冷凍干燥機(jī) 美國基因有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的采集

從自然發(fā)酵錦州小菜6 個地點(diǎn)采集的27 份不同樣品采集情況見表1。

表1 樣品采集Table1 Details of naturally fermented pickle samples collected in this study

1.3.2 總酸含量測定

取樣品搗碎后，稱取20 g樣品置于250 mL容量瓶中，加入50 mL H2O混合均勻后補(bǔ)全溶液。用3 層濾布去除小菜固體。量取50 mL濾液于錐形瓶中，加入2 滴酚酞指示劑，用0.1 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至紅色終點(diǎn)，結(jié)果取3 次平均值[17]。

1.3.3 氨基酸態(tài)氮含量測定

稱取搗碎樣品0.5 g，加入50 mL H2O，混勻后，移入100 mL容量瓶中，加水至刻線搖勻，棄去初濾液。量取20 mL樣品稀釋液倒入200 mL燒杯中，加入60 mL H2O，再用0.05 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至pH 8.2。向其中加入10 mL 36%的甲醛試劑，混勻后再用NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.05 mol/L）繼續(xù)滴定，此溶液pH 9.2時終止滴定[18]。

1.3.4 亞硝酸鹽含量測定

樣品經(jīng)預(yù)處理后，吸取40 mL濾液于50 mL帶塞比色管中，另取0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.50、2.00、2.50 mL亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)使用液分別置于50 mL帶塞比色管中。于標(biāo)準(zhǔn)管與試樣管中分別加入2 mL 4 g/L對氨基苯磺酸溶液，混勻，靜置3～5 min后分別加入1 mL 2 g/L鹽酸萘乙二胺溶液，加水至刻線，混勻，靜置15 min，用2 cm比色皿，在538 nm波長處測定吸光度，以標(biāo)準(zhǔn)液調(diào)零。每個樣品測3 次數(shù)值，計算平均值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[19]。

1.3.5 NaCl含量測定

稱取搗碎樣品5.0 g，置于150 mL燒杯中加入80 mL H2O，煮沸30 min，待冷卻后移至100 mL容量瓶中，定容，濾紙過濾，留濾液備用。吸取5 mL濾液，置于100 mL錐形瓶中，滴加1 mL鉻酸鉀溶液。用AgNO3標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，滴定至橙紅色為滴定終點(diǎn)，用5 mL H2O作為空白對照，結(jié)果取3 次平均值[20]。

1.3.6 菌落總數(shù)測定

稱取25 g小菜置于225 mL滅菌的生理鹽水中，振蕩混勻，進(jìn)行10 倍系列梯度稀釋。選擇2～3 個適宜稀釋度的勻液，分別取1 mL勻液涂平板，每個稀釋梯度做3 個平行實(shí)驗(yàn)，取平均值[21]。

1.3.7 乳酸菌分離篩選

1.3.7.1 乳酸菌的分離純化

取1 mL自然發(fā)酵錦州小菜發(fā)酵液置于10 倍系列梯度稀釋的滅菌生理鹽水中，將5～8 個梯度稀釋液接種到含有2%碳酸鈣的MRS固體培養(yǎng)基中，在37 ℃厭氧條件下培養(yǎng)48 h，挑選有鈣圈的菌落，劃線進(jìn)行分離純化出單菌落，經(jīng)革蘭氏染色后進(jìn)行鏡檢觀察，將革蘭氏陽性菌進(jìn)行甘油保藏。同時進(jìn)行過氧化氫酶生理生化實(shí)驗(yàn)，確認(rèn)純菌種，過氧化氫酶陰性的無芽孢桿菌為乳酸菌[22-26]。

1.3.7.2 16S rDNA序列分析

利用CTAB法提取細(xì)菌基因組乳酸菌疑似菌株的DNA，采用16S rDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。正向引物為27F（對應(yīng)于Escherichia coil 8～27位堿基）：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；反向引物為1495R（對應(yīng)于E. coil 1 495～1 515位堿基）：5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’，由上海派森諾生物技術(shù)有限公司合成。1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測，若PCR擴(kuò)增成功，約在1 500 bp處可見到明亮條帶，測序由上海派森諾生物技術(shù)有限公司完成[27-29]。

1.3.7.3 16S rDNA序列同源性分析

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送到上海派森諾生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序，將測序結(jié)果輸入GenBank數(shù)據(jù)庫中，與數(shù)據(jù)庫中已測出的基因序列進(jìn)行BLAST同源性比對分析。以16S rDNA的序列同源性大于99%為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行種屬歸類[30]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2003和SPSS軟件進(jìn)行各指標(biāo)數(shù)據(jù)的分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 成分含量測定

2.1.1 樣品總酸含量分析

表2 自然發(fā)酵錦州小菜理化品質(zhì)檢驗(yàn)結(jié)果Table2 Chemical and microbial measurements of naturally fermented Jinzhou pickle

如表2所示，在27 份樣品中CS3的總酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，為（1.400±0.117）%，樣品SY1的總酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低，為（0.041±0.001）%，各樣品之間的差值較大，極差為1.359%。根據(jù)商務(wù)部標(biāo)準(zhǔn)SB/T 10439—2007《醬腌菜》中的鹽水漬菜和農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)NY/T 437—2000《綠色食品醬腌菜》中的發(fā)酵性咸菜相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)不大于1.0%或不大于1.5%[31-32]，即樣品符合標(biāo)準(zhǔn)要求。根據(jù)27 份樣品的采集地點(diǎn)進(jìn)行差異性分析，樣品DRF2、DRF4、DRF5和DRF7之間差異不顯著（P＞0.05），樣品DRF2、DRF5和DRF6之間差異不顯著（P＞0.05），其他樣品之間差異顯著（P＜0.05），這與發(fā)酵環(huán)境（溫度、時間、pH值）有關(guān)，在發(fā)酵過程中優(yōu)勢菌群和微生物的變化不同，生產(chǎn)出不同風(fēng)味質(zhì)量的發(fā)酵小菜。

2.1.2 樣品氨基酸態(tài)氮含量分析

如表2所示，采用甲醛滴定法對自然發(fā)酵錦州小菜中含有的氨基酸態(tài)氮進(jìn)行檢測，含量范圍在1.00～81.48 mg/100 g，極差為80.48 mg/100 g。樣品ZS2氨基酸態(tài)氮含量最高，為81.48 mg/100 g，樣品DRF3氨基酸態(tài)氮含量最低，為1.00 mg/100 g。這可能由于黃瓜在腌制的過程中添加了紅油調(diào)味品，使得樣品DRF7的氨基酸態(tài)氮含量大大增加。根據(jù)27 份樣品的采集地點(diǎn)進(jìn)行差異性分析，發(fā)現(xiàn)各樣品之間差異顯著（P＜0.05）。樣品ZSXY、ZS5、DRF4氨基酸態(tài)氮的含量為21.28、24.36、27.58 mg/100 g，說明蝦油中含有的鮮味物質(zhì)成分較高，是蝦油以及蝦油黃瓜類小菜味道鮮美的主要原因，并且賦予其較高的氨基酸態(tài)氮含量。

2.1.3 樣品亞硝酸鹽含量分析

如表2所示，根據(jù)27 份樣品的采集地點(diǎn)進(jìn)行差異性分析，發(fā)現(xiàn)各樣品之間差異顯著（P＜0.05）。SY6-1樣品的亞硝酸鹽含量最高，為（17.184±0.043）mg/kg，ZS1樣品的亞硝酸鹽含量最低，為（0.347±0.002）mg/kg。Z S 4、Z S 5樣品的亞硝酸鹽含量較高，分別為（9.370±0.003）、（5.552±0.009） mg/kg。因?yàn)閆S4、ZS5樣品具有較長的發(fā)酵腌制時間，亞硝酸鹽的含量隨著發(fā)酵時間的延長而升高。

與總酸含量相比，總酸含量較高的JL4、DRF1、JL1所含的亞硝酸鹽含量較低。由此可知，酸對亞硝酸鹽具有一定的清除能力。根據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織及世界衛(wèi)生組織中委員會建議每日攝取亞硝酸鹽的量要小于0.07 mg/kg，并將標(biāo)準(zhǔn)人體質(zhì)量按60 kg計，每人每日攝入亞硝酸鹽量最多為4.2 mg/kg。這就需要生產(chǎn)者嚴(yán)格控制食品加工工藝，防止亞硝酸鹽含量的超標(biāo)，確保質(zhì)量符合食品規(guī)范要求[33-34]。

2.1.4 樣品NaCl含量分析

采用亞硝酸銀方法對27 份自然發(fā)酵錦州小菜的NaCl含量進(jìn)行測定，由表2可知，其數(shù)值范圍在1.037%～25.74%之間，ZSXY的NaCl含量比較高，ZSXY（蝦油黃瓜）經(jīng)過鮮蝦腌制而成，所有NaCl含量比較高，SY6-2、HL2、HL3的NaCl含量較其他小菜的NaCl含量較高。其余的小菜NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)均在2.044%～8.974%之間。采用SPSS軟件根據(jù)27 份樣品的采集地點(diǎn)進(jìn)行差異分析，各樣品之間差異顯著（P＜0.05）。

2.1.5 樣品菌落總數(shù)分析

按GB/T 4789.2—2010《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測定》方法，如表2所示，自然發(fā)酵小菜本身存在微生物活動，因此，國家對于醬腌菜中的細(xì)菌總數(shù)并未做出嚴(yán)格的衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)。對27 份自然發(fā)酵的錦州小菜進(jìn)行菌落計數(shù)，并根據(jù)樣品的不同采集地點(diǎn)進(jìn)行差異性分析，各樣品之間差異顯著（P＜0.05）。DRF1、DRF7、CS1、JL3、ZS1菌落數(shù)均在104CFU/g，其他幾種樣品菌落數(shù)均在105～106CFU/g之間，與樣品DRF1、DRF7、CS1、JL3和ZS1相比差異顯著（P＜0.05）。在腌制過程中添加食醋可以抑制有害細(xì)菌的滋生，從而確保醬腌菜的質(zhì)量狀況較好。菌落數(shù)在105～106CFU/g之間有可能是露天腌制的小菜，導(dǎo)致其菌落數(shù)增加。

2.2 乳酸的分離與鑒定

2.2.1 乳酸菌的分離和初步鑒定

根據(jù)乳酸菌的形態(tài)學(xué)特征，從7 份樣品（DRF2、CS1、HL1、JL3、SY1、ZSXY和ZS1）中分離出24 株乳酸菌，經(jīng)過革蘭氏染色和過氧化氫酶陰性反應(yīng)，24 株菌均為革蘭氏陽性菌株，過氧化氫酶為陰性。初步分離出10 株桿菌和14株球菌為乳酸菌疑似菌株。部分乳酸菌菌株的鏡檢結(jié)果如圖1所示。

圖1 乳酸菌部分菌株鏡檢結(jié)果（×100）Fig.1 Microscopic images of selected isolates from seven pickle samples ( × 100)

2.2.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果

以分離菌株提取的基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用1%瓊脂糖凝膠泳對其進(jìn)行檢測。若所擴(kuò)增的產(chǎn)物在1 500 bp左右處有明顯條帶，說明PCR擴(kuò)增成功，可以進(jìn)行變性梯度凝膠電泳。乳酸菌疑似菌的DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的結(jié)果如圖2所示。

圖2 PCR產(chǎn)物檢測電泳圖Fig.2 Electrophoresis of PCR amplified 16S rDNA sequence

2.2.3 乳酸菌16S rDNA同源性比對結(jié)果

表3 16S rDNA同源性比對結(jié)果Table3 Homology analysis of lactic acid bacteria by 16S rDNA sequence

根據(jù)表3序列比對結(jié)果可知，乳桿菌屬（Lactobacillus）的菌株為：ZSXY1-1和SY1-3為干酪乳桿菌（L. casei），CS1-2和HL1-4為彎曲乳桿菌（L. curvatus），ZS1-1為類植物乳桿菌（L.paraplantarum），ZS1-3、HL1-1和CS1-1為植物乳桿菌（L. plantarum），CS1-4和HL1-3為戊糖乳桿菌（L.pentosus）；腸球菌屬（Enterococcus）的菌株為：HL1-2為Enterococcus sp. Y12，ZS1-2為Enterococcus sp. M7，DRF2-2為糞鏈球菌（E. lactis），ZSXY1-2、JL3-1和SY1-1為屎腸球菌（E. faecium），SY1-2和JL3-2為明串珠菌（L. lactis）；鏈球菌屬（Streptococcus）的菌株：JL3-3和CS1-3為Streptococcus sp.；氣球菌屬（Aerococcus）的菌株為：DRF2-4為Aerococcus sp.；魏斯氏菌屬（Weissella）的菌株為：DRF2-3為微小魏斯氏菌（W. minor）；DRF2-1和SY1-4為綠色魏斯氏菌屬（W. viridescens）。

3 討論與結(jié)論

由于實(shí)驗(yàn)采集的樣品發(fā)酵液來自不同的地點(diǎn)、條件和工藝，因此導(dǎo)致成分含量和乳酸菌構(gòu)成產(chǎn)生差異。對27 份樣品的理化指標(biāo)根據(jù)采樣地點(diǎn)的不同進(jìn)行差異顯著性分析，發(fā)酵液當(dāng)中亞硝酸鹽含量、NaCl含量和氨基酸態(tài)氮含量出現(xiàn)顯著差異（P＜0.05），然而部分樣品總酸含量和菌落總數(shù)并沒有明顯的差異（P＞0.05），但多數(shù)存在顯著差異（P＜0.05）。從7 份在樣品風(fēng)味特征中具有代表性的自然發(fā)酵錦州小菜進(jìn)行乳酸菌分離篩選，DRF2和SY1兩種樣品的總酸含量較低，發(fā)現(xiàn)樣品中均有W. viridescens的存在，能夠起到降酸作用。CS1、HL1和ZS1三種樣品的亞硝酸含量較低，其中ZS1樣品的亞硝酸含量較HL1和CS2低，原因是ZS1樣品中的L. plantarum能夠發(fā)酵產(chǎn)酸、醛、酯類物質(zhì)，小菜經(jīng)過一段時間發(fā)酵后，碳水化物和蛋白質(zhì)發(fā)生水解，有利于人體的消化吸收，其酸類物質(zhì)及代謝產(chǎn)物會抑制亞硝酸鹽含量的生成。DRF2樣品中含有W. minor，研究表明，在8% NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)時生長較快，在其他NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)的條件下生長可能會受到抑制，尤其在10% NaCl條件下W. minor會受到明顯的抑制作用。

自然發(fā)酵性食品中蘊(yùn)藏著豐富的乳酸菌資源，國內(nèi)外學(xué)者從自然發(fā)酵性蔬菜制品中分離出不同種類的乳酸菌資源，證明乳酸菌是自然發(fā)酵蔬菜制品中的優(yōu)勢菌群，在發(fā)酵過程中起著至關(guān)重要的作用。錦州小菜是東北遼寧省發(fā)酵性食品的代表。在自然發(fā)酵錦州小菜中分離篩選出的乳酸菌中發(fā)現(xiàn)，乳桿菌屬（Lactobacillus）數(shù)量明顯多于魏斯氏菌屬（Weissella），泡菜等發(fā)酵食品中的魏斯氏菌（Weissella）在發(fā)酵初期為優(yōu)勢菌種，在發(fā)酵后期被乳酸桿菌（Lactobacillus）代替。對7 份自然發(fā)酵小菜樣品進(jìn)行乳酸菌分離，共分離出24 株乳酸菌。其中不但分離出L. casei、E. faecium、L. curvatus、L. pentosus、Streptococcus sp.、Enterococcus sp.、L. lactis、Aerococcus sp.等常見的乳酸菌，同時還有W. viridescens、W. minor，這是其他文獻(xiàn)鮮有報道的。

通過本研究可知，自然發(fā)酵的錦州小菜中蘊(yùn)含豐富的乳酸菌資源，與其他的泡菜等發(fā)酵性食品相比，自然發(fā)酵的錦州小菜有獨(dú)特的乳酸菌種類、組成，并且具有區(qū)域性發(fā)酵食品的代表特點(diǎn)。從錦州小菜中分離篩選出優(yōu)勢乳酸菌進(jìn)行純種發(fā)酵，為自然發(fā)酵錦州小菜的工藝改進(jìn)及產(chǎn)品的研發(fā)提供參考，也為探究自然發(fā)酵錦州小菜的風(fēng)味特征與微生物之間的聯(lián)系和工業(yè)化生產(chǎn)提供了參考。