酒酒球菌（Oenococcus oeni）耐酸突變株蘋果酸-乳酸發(fā)酵能力分析

謝昉書，文向圓，劉樹文,2,3,

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.陜西省葡萄與葡萄酒工程技術(shù)研究中心，陜西 楊凌 712100；3.陜西省合陽(yáng)葡萄試驗(yàn)示范站，陜西 渭南 715300）

蘋果酸-乳酸發(fā)酵可以降低葡萄酒的酸度和色度，增加細(xì)菌學(xué)穩(wěn)定性及改善葡萄酒的香氣，因此，它是釀造優(yōu)質(zhì)葡萄酒的必需工藝環(huán)節(jié)[1]。在乙醇發(fā)酵結(jié)束之后葡萄酒的生境極其惡劣和復(fù)雜，低pH值、高乙醇體積分?jǐn)?shù)和高SO2等均會(huì)抑制乳酸菌的生長(zhǎng)和代謝，而酒酒球菌可以適應(yīng)這種環(huán)境[2]，因此，它成為蘋果酸-乳酸發(fā)酵過(guò)程中重要的菌種[3-5]。

在蘋果酸-乳酸發(fā)酵過(guò)程中，酒酒球菌可以將葡萄酒中具有酸澀感的L-蘋果酸分解為L(zhǎng)-乳酸，使葡萄酒更加柔和圓潤(rùn)。Bronwen等[6]研究發(fā)現(xiàn)，低pH值和高乙醇含量對(duì)植物乳桿菌的降酸能力起到抑制作用。葡萄酒的香氣是衡量葡萄酒品質(zhì)最為重要的指標(biāo)之一[7]。萜烯類化合物具有濃郁的香味，是構(gòu)成葡萄酒香氣的主要物質(zhì)，其主要以無(wú)味的糖苷結(jié)合態(tài)存在于葡萄酒中[6,8]。糖苷酶可以酶解香氣前體物質(zhì)以增加葡萄酒香氣的復(fù)雜性，其中β-葡萄糖苷酶是改善葡萄酒香氣的關(guān)鍵酶[9]。乳酸菌特別是酒酒球菌具有較高的β-葡萄糖苷酶活性，可以促進(jìn)香氣前體物的分解，對(duì)增加葡萄酒香氣復(fù)雜性具有重要意義[10-13]。酒酒球菌對(duì)葡萄酒感官品質(zhì)的影響具有菌株差異性[14-15]，低pH值、高乙醇體積分?jǐn)?shù)、高SO2環(huán)境都會(huì)對(duì)酒酒球菌的糖苷酶活性產(chǎn)生影響。因此，酒酒球菌在葡萄酒生境中的抗脅迫能力及糖苷酶的活性，直接影響蘋果酸-乳酸發(fā)酵的啟動(dòng)、完成及葡萄酒的感官品質(zhì)[16]。目前研究多是針對(duì)脅迫環(huán)境對(duì)酒酒球菌的降酸能力或β-葡萄糖苷酶活性的影響，但從酒酒球菌的生長(zhǎng)能力、降酸能力和β-葡萄糖苷酶活性3 個(gè)方面評(píng)價(jià)其蘋果酸-乳酸發(fā)酵能力的研究鮮少報(bào)道。

本研究通過(guò)分析單因素脅迫環(huán)境（pH值、乙醇體積分?jǐn)?shù)和L-蘋果酸）、復(fù)合因素脅迫環(huán)境和模擬酒環(huán)境對(duì)耐酸突變菌株[17]的生長(zhǎng)能力、降酸能力和β-葡萄糖苷酶活性的影響，旨在全面評(píng)價(jià)耐酸突變菌株蘋果酸-乳酸發(fā)酵的能力，為耐酸突變菌株成為商業(yè)發(fā)酵劑提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

酒酒球菌SX-1b[18]、商業(yè)菌株31-DH[19]保藏于西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院；陳其玲等[17]對(duì)SX-1b進(jìn)行離子注入誘變，經(jīng)過(guò)分離純化后篩選出的耐酸突變菌株b1。

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑

ATB液體培養(yǎng)基（1 L）：葡萄糖10 g，蛋白胨10 g，酵母浸粉5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g， MnSO4·4H2O 0.05 g，鹽酸半胱氨酸 0.5 g，番茄汁250 mL，pH 4.8。

模擬酒培養(yǎng)基（1 L）：無(wú)水乙醇100 mL（培養(yǎng)基乙醇體積分?jǐn)?shù)10%），葡萄汁10 g，L-蘋果酸3 g，D-葡萄糖2 g，D-果糖2 g，CaCl20.13 g，KCl 0.45 g，(NH4)2SO41 g，CH3COONa 2 g，KH2PO40.6 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，MnSO40.05 g，酵母浸粉4 g， pH 3.4。110 ℃滅菌10 min，待模擬酒培養(yǎng)基溫度降至常溫水平再添加100 mL無(wú)水乙醇。

對(duì)硝基苯酚-β-D-葡萄糖苷（p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside，p-NPG） 美國(guó)Sigma公司；L-蘋果酸檢測(cè)試劑盒 愛爾蘭Megazyme公司；其他均為分析純?cè)噭?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-1超凈工作臺(tái) 中國(guó)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；SX-500高壓蒸汽滅菌鍋 日本Tomy公司；SHP-250生化培養(yǎng)箱 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；Cary60紫外分光光度計(jì) 安捷倫科技（中國(guó)）有限公司；Orion Star A111 pH計(jì) 美國(guó)Thermo Scientif i c公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的生長(zhǎng)能力

1.3.1.1 菌株生長(zhǎng)曲線繪制

將菌株于ATB液體培養(yǎng)基中26 ℃靜置培養(yǎng)，活化2 次后以4%的接種量接種于單因素脅迫培養(yǎng)基中培養(yǎng)，繪制菌株生長(zhǎng)曲線。

1.3.1.2 菌株生長(zhǎng)量的測(cè)定

將菌株于ATB液體培養(yǎng)基中26 ℃靜置培養(yǎng)，活化2 次后以4%接種量接種于正交條件的培養(yǎng)基中，測(cè)定OD600nm，在26 ℃靜置培養(yǎng)120 h后再次測(cè)定OD600nm，以兩次測(cè)定的差值（ΔOD600nm）衡量實(shí)驗(yàn)菌株的生長(zhǎng)。

1.3.2 L-蘋果酸含量的測(cè)定

按照L-蘋果酸檢測(cè)試劑盒的方法進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3 β-葡萄糖苷酶樣品制備及活性測(cè)定

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期（OD600nm=1.0）菌液各1 mL，9 000 r/min離心10 min收集菌體，加入0.85% NaCl溶液洗滌2 次，并懸浮于0.5 mL 0.85% NaCl溶液。

β-葡萄糖苷酶活力測(cè)定參照Barbagallo等[20]的方法并略作修改。反應(yīng)體系（3 mL）：在上述的懸浮液中加入0.5 mL的檸檬酸磷酸緩沖液和p-NPG混合液（pH 5.0，p-NPG濃度5 mmol/L），于37 ℃反應(yīng)1 h，立即加入2 mL的1.0 mol/L Na2CO3溶液終止反應(yīng)。10 000 r/min離心20 min，取上清液并使用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀測(cè)定400 nm波長(zhǎng)處的吸光度?？瞻讟悠肥鞘褂?.85% NaCl緩沖溶液代替菌懸浮液，其他處理與樣品相同。菌體干質(zhì)量的計(jì)算如下式所示：

式中：A600nm為菌液在600 nm波長(zhǎng)處的吸光度；2.616 8為固定系數(shù)。

β-葡萄糖苷酶活力定義為以p-NPG為底物，每克菌體（干質(zhì)量）每分鐘水解該底物生成對(duì)硝基苯酚（p-nitrophenol，p-NP）的量（μmol/（g·min））。標(biāo)準(zhǔn)曲線由不同濃度（10～60 μmol/L）p-NP溶液在400 nm波長(zhǎng)處比色獲得?；貧w方程為y=0.008 6x+0.002 7，R2=0.999 4，線性關(guān)系良好，滿足實(shí)驗(yàn)需求。

1.3.4 單因素脅迫環(huán)境對(duì)菌株抗脅迫能力的影響

1.3.4.1 pH值的影響

將3 g/L的L-蘋果酸添加到ATB液體培養(yǎng)基，并將培養(yǎng)基的pH值分別調(diào)節(jié)為3.0、3.2、3.4、3.6和3.8。以4%接種量接種于不同pH值的液體培養(yǎng)基中，測(cè)定生長(zhǎng)曲線、L-蘋果酸含量及β-葡萄糖苷酶活性。

1.3.4.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響

將3 g/L的L-蘋果酸添加到ATB液體培養(yǎng)基，并使培養(yǎng)基的乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為8%、10%、12%和14%，pH值為4.8，以4%接種量接種于含有不同乙醇體積分?jǐn)?shù)的液體培養(yǎng)基中，測(cè)定生長(zhǎng)曲線、L-蘋果酸含量及β-葡萄糖苷酶活性。乙醇體積分?jǐn)?shù)8%接近葡萄酒最低值7%，葡萄酒乙醇體積分?jǐn)?shù)一般為10%～14%。

1.3.4.3 L-蘋果酸的影響

將1、2、3、4 g/L的L-蘋果酸分別添加到ATB液體培養(yǎng)基，pH值為4.8，以4%接種量接種于含有不同L-蘋果酸質(zhì)量濃度的液體培養(yǎng)基中，測(cè)定生長(zhǎng)曲線、L-蘋果酸含量及β-葡萄糖苷酶活性。

1.3.5 復(fù)合因素脅迫環(huán)境對(duì)菌株抗脅迫能力的影響

葡萄酒的高酸和高乙醇體積分?jǐn)?shù)環(huán)境對(duì)酒酒球菌的生長(zhǎng)和蘋果酸-乳酸發(fā)酵具抑制作用，L-蘋果酸是葡萄酒中重要的有機(jī)酸，對(duì)酒酒球菌的生長(zhǎng)和降酸能力具有影響，因此，選擇pH值、乙醇體積分?jǐn)?shù)和L-蘋果酸作為正交試驗(yàn)因素，采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定正交試驗(yàn)因素影響程度及最優(yōu)組合。

1.3.6 模擬酒環(huán)境下菌株的蘋果酸-乳酸發(fā)酵能力

按照1.1.2節(jié)配制模擬酒培養(yǎng)基，并使模擬酒培養(yǎng)基的乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為10%、12%和14%，pH值為3.4，以4%接種量接種于模擬酒中，培養(yǎng)到一定時(shí)期，按照1.3.3節(jié)方法測(cè)定β-葡萄糖苷酶活性，并且每天按照1.3.2節(jié)方法測(cè)定L-蘋果酸的含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 20.0分析軟件（上海卡貝信息技術(shù)有限公司）對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素脅迫環(huán)境對(duì)菌株抗脅迫能力的影響

2.1.1 pH值對(duì)菌株抗脅迫能力的影響

2.1.1.1 pH值對(duì)菌株生長(zhǎng)能力的影響

圖1 菌株SX-1b（a）、耐酸突變株b1（b）和商業(yè)菌株31-DH（c）在不同pH值條件下的生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curves of SX-1b (a), b1 (b) and 31-DH (c) under different pH values

由圖1可知，菌株SX-1b、b1和31-DH在穩(wěn)定期的生長(zhǎng)量隨著pH值降低而降低，當(dāng)pH值為3.0時(shí)，b1的生長(zhǎng)量高于SX-1b和31-DH。在不同pH值條件下菌株的生長(zhǎng)曲線可為之后L-蘋果酸降解速率的測(cè)定提供時(shí)間依據(jù)。結(jié)果表明，pH值對(duì)菌株的生長(zhǎng)具有抑制作用。但菌株b1在低pH值（3.0）下具有較強(qiáng)的生長(zhǎng)能力。Tourdot-Maréchal等[21]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)pH值為3.2時(shí)，酒酒球菌的生長(zhǎng)受到嚴(yán)重抑制。葡萄酒的pH值一般為3.0～3.4，酒酒球菌能否在葡萄酒的高酸環(huán)境中生長(zhǎng)繁殖對(duì)蘋果酸-乳酸發(fā)酵的啟動(dòng)具有重要意義。經(jīng)過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，低pH值將會(huì)引起酒酒球菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和成分的變化，使菌株的生長(zhǎng)受到抑制[22-23]，但陳其玲等[17]采用離子注入誘變，分離純化后獲得的菌株b1表現(xiàn)出良好的抗酸脅迫能力，這有可能是離子注入誘變使與細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)有關(guān)的基因發(fā)生突變。

2.1.1.2 pH值對(duì)菌株L-蘋果酸降解速率的影響

圖2 pH值對(duì)L-蘋果酸降解速率的影響Fig.2 Effect of pH on the degradation rate of L-malic acid

將菌株接種于不同培養(yǎng)基培養(yǎng)120 h，測(cè)定L-蘋果酸含量。當(dāng)菌株的培養(yǎng)時(shí)間相同時(shí)，菌株的L-蘋果酸降解量越高則其L-蘋果酸降解速率越高。因此，以菌株在120 h時(shí)蘋果酸的降解量表示L-蘋果酸降解速率。由圖2可知，菌株SX-1b、b1和31-DH的L-蘋果酸降解量隨著pH值降低而降低，即低pH值對(duì)菌株L-蘋果酸降解速率具有抑制作用。當(dāng)pH值為3.0時(shí)，b1保持較高的蘋果酸降解量，為1.978 6 g/L，是SX-1b的1.34 倍，是31-DH的1.18 倍。

蘋果酸乳酸酶是蘋果酸-乳酸發(fā)酵過(guò)程中的關(guān)鍵酶[24]，因此，其活性將會(huì)影響菌株L-蘋果酸降解速率。研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于發(fā)酵速率較快的菌株，其蘋果酸乳酸酶基因（mleA）的轉(zhuǎn)錄水平較高[25]。經(jīng)過(guò)離子注入誘變，SX-1b的mleA可能發(fā)生突變，從而影響蘋果酸乳酸酶活性和mleA的表達(dá)。

2.1.1.3 pH值對(duì)菌株β-葡萄糖苷酶活性的影響

圖3 pH值對(duì)β-葡萄糖苷酶活性的影響Fig.3 Effect of pH on β-glycosidase activity

以p-NPG為底物，在37 ℃條件下反應(yīng)1 h，測(cè)定菌株SX-1b、b1和31-DH的β-葡萄糖苷酶活性。由圖3可知，在不同pH值條件下，菌株SX-1b、b1和31-DH均具有β-葡萄糖苷酶活性，且β-葡萄糖苷酶活性具有菌株差異性，這與之前的研究結(jié)果基本一致[26-27]。菌株β-葡萄糖苷酶活性隨著pH值降低而降低。當(dāng)pH 3.0時(shí)，SX-1b和31-DH的β-葡萄糖苷酶活性受到強(qiáng)抑制作用，但b1受到的抑制作用較小，β-葡萄糖苷酶活性為8.610 0 μmol/（g·min），是SX-1b的6.64 倍，是31-DH的1.62 倍，這與陳其玲等[17]的研究基本一致。當(dāng)pH 3.8時(shí)，SX-1b保持較高的β-葡萄糖苷酶活性。

大部分酒酒球菌β-葡萄糖苷酶的最適pH值為5.0[28]，當(dāng)pH值降到3.5時(shí)，β-葡萄糖苷酶活性急劇降低[20]，且Michlmayr等[29]研究發(fā)現(xiàn)，在葡萄酒pH值（3.0～4.0）條件下，短乳桿菌β-葡萄糖苷酶活性很低，由此可知低pH值對(duì)菌株的β-葡萄糖苷酶具有抑制作用[20]。與楊芮等[28]研究結(jié)果相比較，菌株b1在低pH值條件下保持較高的β-葡萄糖苷酶活性。

2.1.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)菌株抗脅迫能力的影響

2.1.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)菌株生長(zhǎng)能力的影響

圖4 菌株SX-1b（a）、耐酸突變株b1（b）和商業(yè)菌株31-DH（c）在不同乙醇體積分?jǐn)?shù)下的生長(zhǎng)曲線Fig.4 Growth curves of SX-1b (a), b1 (b) and 31-DH (c) at different alcohol concentrations

由圖4可知，菌株SX-1b、b1和31-DH在穩(wěn)定期的生長(zhǎng)量隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增加而降低，即乙醇對(duì)各菌株的生長(zhǎng)均具有強(qiáng)抑制作用。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為14%時(shí)，在穩(wěn)定期生長(zhǎng)量最高的為菌株b1。

2.1.2.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)菌株L-蘋果酸降解速率的影響

圖5 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)L-蘋果酸降解速率的影響Fig.5 Effect of alcohol concentration on the degradation rate of L-malic acid

由圖5可知，菌株SX-1b、b1和31-DH的L-蘋果酸降解量隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增加而降低，即乙醇對(duì)菌株L-蘋果酸降解速率具有抑制作用。但b1的L-蘋果酸降解量均高于其余菌株。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為14% 時(shí)，菌株b1的L-蘋果酸降解量為1.717 7 g/L，分別是SX-1b和31-DH的1.36 倍和1.05 倍。

Miller等[30]研究發(fā)現(xiàn)，乙醇對(duì)植物乳桿菌mleA的表達(dá)具有抑制作用。Wang等[24]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)大于4% 時(shí)，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，酒酒球菌SD-2a的蘋果酸乳酸酶活性顯著降低。經(jīng)過(guò)離子注入誘變，SX-1b的mleA發(fā)生突變，可能提高了菌株mleA的表達(dá)和蘋果酸乳酸酶的活性。

2.1.2.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)菌株β-葡萄糖苷酶活性的影響

圖6 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)β-葡萄糖苷酶活性的影響Fig.6 Effect of alcohol concentration on β-glycosidase activity

由圖6可知，菌株SX-1b、b1和31-DH的β-葡萄糖苷酶活性隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增加顯著降低，這與之前的研究結(jié)果一致[20]。葡萄酒的乙醇體積分?jǐn)?shù)一般為12%～14%，在該條件下，菌株b1保持較高的β-葡萄糖苷酶活性。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為14%時(shí)，β-葡萄糖苷酶活性最高的為菌株b1（1.597 5 μmol/（g·min）），分別是SX-1b和31-DH的1.09 倍和1.07 倍。

2.1.3 L-蘋果酸對(duì)菌株抗脅迫能力的影響

2.1.3.1 L-蘋果酸對(duì)菌株生長(zhǎng)能力的影響

圖7 菌株SX-1b（a）、耐酸突變株b1（b）和商業(yè)菌株31-DH（c）在不同L-蘋果酸質(zhì)量濃度下的生長(zhǎng)曲線Fig.7 Growth curves of SX-1b (a), b1 (b) and 31-DH (c) under different concentrations of L-malic acid

由圖7可知，菌株SX-1b、b1和31-DH在穩(wěn)定期的生長(zhǎng)量隨著L-蘋果酸質(zhì)量濃度增加而降低。當(dāng)L-蘋果酸質(zhì)量濃度為3 g/L時(shí)，菌株b1在穩(wěn)定期的生長(zhǎng)量高于SX-1b和31-DH。

2.1.3.2 L-蘋果酸對(duì)菌株L-蘋果酸降解速率的影響

圖8 L-蘋果酸質(zhì)量濃度對(duì)L-蘋果酸降解速率的影響Fig.8 Effect of L-malic acid concentration of on the degradation rate of L-malic acid

由圖8可知，菌株SX-1b、b1和31-DH的L-蘋果酸降解量隨著L-蘋果酸質(zhì)量濃度增加而增加，即L-蘋果酸對(duì)菌株的L-蘋果酸降解速率具有促進(jìn)作用。葡萄酒中L-蘋果酸質(zhì)量濃度一般為3 g/L，在此質(zhì)量濃度下，L-蘋果酸降解量最高的為菌株b1（2.846 9 g/L），分別是SX-1b和31-DH的1.19 倍和1.12 倍。

2.1.3.3 L-蘋果酸對(duì)菌株β-葡萄糖苷酶活性的影響

圖9 L-蘋果酸質(zhì)量濃度對(duì)β-葡萄糖苷酶活性的影響Fig.9 Effect of L-malic acid concentration on β-glycosidase activity

由圖9可知，菌株SX-1b、b1和31-DH的β-葡萄糖苷酶活性隨著L-蘋果酸質(zhì)量濃度增加而降低。L-蘋果酸對(duì)SX-1b和31-DH的β-葡萄糖苷酶活性抑制作用較強(qiáng)，對(duì)b1的β-葡萄糖苷酶活性抑制作用較小。當(dāng)L-蘋果酸質(zhì)量濃度小于3 g/L時(shí)，菌株SX-1b和31-DH的β-葡萄糖苷酶活性較高，當(dāng)L-蘋果酸質(zhì)量濃度大于3 g/L時(shí)，菌株b1表現(xiàn)出較高的β-葡萄糖苷酶活性。當(dāng)L-蘋果酸質(zhì)量濃度為3 g/L時(shí)，菌株b1的β-葡萄糖苷酶活性高于其余菌株，為6.823 8 μmol/（g·min），分別是SX-1b和31-DH的1.16 倍和1.06 倍。

2.2 復(fù)合因素脅迫環(huán)境對(duì)菌株抗脅迫能力的影響

2.2.1 復(fù)合因素脅迫環(huán)境對(duì)菌株生長(zhǎng)能力的影響

表1 正交試驗(yàn)條件對(duì)酒酒球菌ΔOD600 nm的影響Table1 Orthogonal array design with ΔOD600 nm values of three Oenococcus oeni strains

續(xù)表1

表2 ΔOD600 nm正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果Table2 Analysis of variance for the effect of variables on ΔOD600 nm

由表1可知，ΔOD600nm與單因素脅迫試驗(yàn)結(jié)果相差較大。pH值、乙醇體積分?jǐn)?shù)和L-蘋果酸對(duì)菌株的生長(zhǎng)均具有抑制作用，因此，在3個(gè)脅迫因素協(xié)同作用下，對(duì)菌株生長(zhǎng)的抑制作用將會(huì)顯著增強(qiáng)。影響菌株生長(zhǎng)因素的主次順序均為pH值＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞L-蘋果酸質(zhì)量濃度。由K值可以確定最優(yōu)組合為A3B1C3，即pH 3.8、乙醇體積分?jǐn)?shù)10%、L-蘋果酸質(zhì)量濃度4 g/L。

SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，由表2可知，對(duì)于菌株b1，因素A和B有顯著性差異（P＜0.05）。對(duì)于菌株31-DH，因素A有顯著性差異（P＜0.05）。

2.2.2 復(fù)合因素脅迫環(huán)境對(duì)菌株L-蘋果酸降解速率的影響

由表3可知，影響菌株SX-1b、b1和31-DH的L-蘋果酸降解速率因素的主次順序均pH值＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞L-蘋果酸。由K值可以確定最優(yōu)組合為A3B1C3，即pH 3.8、乙醇體積分?jǐn)?shù)10%、L-蘋果酸質(zhì)量濃度4 g/L。用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，由表4可知，因素A、B和C沒有顯著性差異。

表3 正交試驗(yàn)條件對(duì)L-蘋果酸降解速率的影響Table3 Orthogonal array design with L-malic acid degradation rates of three O. oeni strains

表4 L-蘋果酸降解速率正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果Table4 Analysis of variance for the effect of variables on L-malic acid degradation rate

2.2.3 復(fù)合因素脅迫環(huán)境對(duì)菌株β-葡萄糖苷酶活性的影響

由表5可知，影響菌株SX-1b、b1和31-DH的β-葡萄糖苷酶活性因素的主次順序均為pH值＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞L-蘋果酸質(zhì)量濃度。由K值可以確定最優(yōu)組合為A3B1C3，即pH 3.8、乙醇體積分?jǐn)?shù)10%、L-蘋果酸質(zhì)量濃度4 g/L。用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，由表6可知，對(duì)于菌株31-DH，因素A有顯著性差異（P＜0.05）。

表5 正交試驗(yàn)條件對(duì)β-葡萄糖苷酶活性的影響Table5 Orthogonal array design with β-glycosidase activity of three O. oeni strains

表6 β-葡萄糖苷酶活性正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果Table6 Analysis of variance for the effect of variable on β-glycosidase activity

2.3 模擬酒環(huán)境下菌株的蘋果酸-乳酸發(fā)酵能力

2.3.1 模擬酒環(huán)境下菌株的L-蘋果酸降解速率

圖10 模擬酒中乙醇體積分?jǐn)?shù)10%（a）、12%（b）和14%（c）條件下的L-蘋果酸降解速率Fig.10 Effect of alcohol concentration (10% (a), 12% (b) and 14% (c))of model wine on the degradation rate of L-malic acid

為進(jìn)一步探究菌株b1的蘋果酸-乳酸發(fā)酵能力，將生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（OD600nm=1.0）菌株接種于含有不同乙醇體積分?jǐn)?shù)（10%、12%和14%）的模擬酒中，在20 ℃培養(yǎng)12 d，每天測(cè)定L-蘋果酸含量，以菌株的累積L-蘋果酸降解量表示L-蘋果酸降解速率。由圖10可知，在模擬酒環(huán)境中，各菌株均具有L-蘋果酸降解能力，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，菌株累積L-蘋果降解量顯著降低，即菌株L-蘋果酸降解速率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增加而降低。由圖10c可知，當(dāng)模擬酒的乙醇體積分?jǐn)?shù)為14%時(shí)，菌株SX-1b和31-DH在模擬發(fā)酵初期受到嚴(yán)重的抑制作用，菌株b1受到的抑制作用較小，因此，菌株b1可以快速適應(yīng)高乙醇體積分?jǐn)?shù)的環(huán)境；當(dāng)模擬發(fā)酵至第12天時(shí)，菌株b1累積L-蘋果酸降解量最高，為1.493 2 g/L，分別是菌株SX-1b與31-DH的1.41 倍和1.26 倍。

2.3.2 模擬酒環(huán)境下菌株的β-葡萄糖苷酶活性

由圖11可知，在模擬酒環(huán)境中，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增加，各菌株β-葡萄糖苷酶活性均降低。在不同乙醇體積分?jǐn)?shù)條件下，菌株b1的β-葡萄糖苷酶活性均高于SX-1b。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)大于12% 時(shí)，菌株b1的β-葡萄糖苷酶活性較SX-1b和31-DH高。因此，在高乙醇體積分?jǐn)?shù)的葡萄酒中，b1表現(xiàn)出較高的β-葡萄糖苷酶活性。

圖11 模擬酒中乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)酒酒球菌β-葡萄糖苷酶活性的影響Fig.11 Effect of alcohol concentration of model wine on β-glycosidase activity

結(jié)果表明，在模擬酒環(huán)境中，乙醇對(duì)菌株L-蘋果酸降解速率和β-葡萄糖苷酶活性均具有抑制作用。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為14%時(shí)，菌株b1的L-蘋果酸降解速率和β-葡萄糖苷酶活性均高于其余菌株，因此，耐酸突變菌株b1具有開發(fā)為商業(yè)發(fā)酵劑的潛能。

3 結(jié) 論

本研究通過(guò)對(duì)耐酸突變菌株b1生長(zhǎng)能力、L-蘋果酸降解速率和β-葡萄糖苷酶活性的研究發(fā)現(xiàn)，b1表現(xiàn)出良好抗脅迫能力和蘋果酸-乳酸發(fā)酵能力，具有成為商業(yè)發(fā)酵劑的潛能。結(jié)果表明低pH值、高乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)菌株的生長(zhǎng)能力、L-蘋果酸降解速率和β-葡萄糖苷酶活性均具有抑制作用，L-蘋果酸對(duì)其生長(zhǎng)能力和β-葡萄糖苷酶活性具有抑制作用，對(duì)L-蘋果酸降解速率具有促進(jìn)作用。當(dāng)單因素脅迫環(huán)境分別為pH 3.0、乙醇體積分?jǐn)?shù)14%和L-蘋果酸質(zhì)量濃度3 g/L時(shí)，b1的L-蘋果酸降解速率和β-葡萄糖苷酶活性均高于其余菌株。正交試驗(yàn)進(jìn)一步確定各因素對(duì)菌株生長(zhǎng)能力、L-蘋果酸降解速率和β-葡萄糖苷酶活性的影響程度為：pH值＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞L-蘋果酸。當(dāng)模擬酒的乙醇體積分?jǐn)?shù)為14% 時(shí)，菌株b1的累積L-蘋果酸降解量為1.493 2 g/L，分別是SX-1b與31-DH的1.41 倍和1.26 倍，且菌株b1的β-葡萄糖苷酶活性高于其余菌株。在后續(xù)的研究中，可將菌株b1接種于葡萄酒中進(jìn)行蘋果酸-乳酸發(fā)酵，進(jìn)一步探究其L-蘋果酸降解能力及其對(duì)葡萄酒香氣的影響。