抗牛免疫球蛋白G單克隆抗體的制備及鑒定

王麗威，劉 金，武俊瑞，烏日娜，岳喜慶,

（1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110866；2.遼寧工程技術(shù)大學(xué)理學(xué)院，遼寧 阜新 123000）

牛免疫球蛋白（bovine immunoglobulin，Ig）在理化性質(zhì)和分類(lèi)命名上與其他哺乳動(dòng)物及其相似，主要包括IgG、IgA、IgM和IgE四類(lèi)[1]。IgG分為IgG1和IgG2兩個(gè)亞類(lèi)。牛IgG分子結(jié)構(gòu)與人類(lèi)IgG結(jié)構(gòu)基本相同，由兩條相同的長(zhǎng)鏈多肽和兩條相同的短鏈多肽組成的“Y”形結(jié)構(gòu)，見(jiàn)圖1。牛IgG在牛的體液中廣泛分布，在初乳、血液中含量較高。在初乳的許多生物活性物質(zhì)中，IgG是最重要的一種。牛初乳中IgG的含量受乳牛的年齡、泌乳期和飼喂環(huán)境等多種因素制約。研究表明，牛IgG具有抗菌、調(diào)節(jié)免疫力、保護(hù)腸道黏膜等多種生物活性[2-7]。在初乳制品的開(kāi)發(fā)上，IgG含量直接決定產(chǎn)品的質(zhì)量和價(jià)格。在初乳加工及質(zhì)量檢測(cè)和奶牛犢牛飼喂管理中，迫切需要建立牛IgG的免疫學(xué)檢測(cè)方法。

圖1 牛IgG分子結(jié)構(gòu)模式圖Fig.1 Schematic diagram of a bovine IgG molecule

目前牛IgG的檢測(cè)方法主要為免疫分析法和親和色譜法[2]。其中免疫分析法主要包括瓊脂擴(kuò)散法[8-10]、免疫比濁法[8,11-14]和酶聯(lián)免疫法[9-10,15-17]等。這些快速方法都需要特異性識(shí)別牛IgG（包括IgG1和IgG2）的抗體。目前科研和生產(chǎn)中較為常用的抗牛IgG抗體試劑主要為兔、山羊、綿羊等動(dòng)物來(lái)源的血清抗體，屬多克隆抗體。這種抗體的制備方法所得抗體效價(jià)取決于不同種屬動(dòng)物免疫反應(yīng)性，免疫方法等諸多因素，難以保證批間質(zhì)量的穩(wěn)定性。另外由于哺乳動(dòng)物IgG之間的交叉反應(yīng)嚴(yán)重，要獲得達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求的特異性往往需要繁雜的交叉吸附處理[18-19]。單克隆抗體具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、均一性好的特點(diǎn)。國(guó)外學(xué)者已研制出抗牛IgG、IgG1、IgG2和IgG Fc片段的抗體[18-21]。國(guó)內(nèi)高東微[22]、王平[23]、韓秀娥[24]等研究了牛IgG單克隆抗體的制備，但目前還沒(méi)有商品化的抗牛IgG單克隆抗體，僅有的2 株單克隆抗體由國(guó)外進(jìn)口，價(jià)格十分昂貴。因此，利用雜交瘤技術(shù)制備分泌抗牛IgG的單克隆抗體，對(duì)于牛IgG的免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)的建立，具有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值和理論研究意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雌性BALB/c小鼠，吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)合格證號(hào)為SCXK（吉）2011-0001；SP2/0小鼠骨髓瘤細(xì)胞由吉林大學(xué)人獸共患病研究所提供。

標(biāo)準(zhǔn)牛IgG、辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體、山羊抗牛IgG抗體、牛乳酪蛋白、牛乳β-乳球蛋白、牛乳鐵蛋白、牛血清白蛋白、卵清白蛋白、冷水魚(yú)明膠、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、單克隆抗體亞類(lèi)鑒定試劑盒 美國(guó)Sigma公司；山羊IgG、綿羊IgG、兔IgG、牛IgM 北京博奧森公司；牛IgG1、牛IgG2、牛IgG Fab片段、Fc片段 美國(guó)Fitzgerald公司；RPMI-1640培養(yǎng)基 美國(guó)Gbico公司；3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺（3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine，TMB） 濟(jì)南泰天和公司；蛋白G親和層析柱 美國(guó)GE公司；胎牛血清美國(guó)Hyclone公司。

1.2 儀器與設(shè)備

酶標(biāo)儀 美國(guó)BioTek公司；二氧化碳培養(yǎng)箱香港利新公司；高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Thermo公司；AKTA蛋白純化系統(tǒng) 美國(guó)GE公司；垂直電泳儀美國(guó)Bio-Rad公司；凝膠成像分析系統(tǒng) 美國(guó)UVP公司；超低溫冰箱、倒置顯微鏡 日本三洋公司。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物免疫

取6 周齡雌性BALB/c小鼠，用乳化抗原（標(biāo)準(zhǔn)牛IgG加入等量完全弗氏佐劑乳化）腹腔注射，100 μg/只。2周后用乳化抗原（標(biāo)準(zhǔn)牛IgG加入等量不完全弗氏佐劑乳化）腹腔注射，100 μg/只。2 周進(jìn)行第3次免疫，操作同第2次免疫。1 周后采用間接酶聯(lián)免疫吸附（enzyme-linked immune sorbent assay，ELISA）法測(cè)定血清效價(jià)，選擇血清效價(jià)最高的小鼠在融合前3 d注射牛IgG加強(qiáng)免疫。

1.3.2 細(xì)胞融合及陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株的篩選

參考文獻(xiàn)[25]進(jìn)行細(xì)胞融合。加強(qiáng)免疫3 d后，取小鼠脾臟，制備細(xì)胞懸液，與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞按10∶1的比例混合，緩慢加入1 mL預(yù)熱的聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG），37 ℃水浴中融合30 s，立即1 000 r/min離心2 min。緩慢加入RPMI-1640培養(yǎng)基20 mL，800 r/min離心4 min，棄上清液，如此再洗1 次；融合物移至裝有50 mL含20%胎牛血清的HAT培養(yǎng)基中，混勻，加入到已準(zhǔn)備好飼養(yǎng)層的96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100 mL，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

融合細(xì)胞培養(yǎng)至8～14 d，細(xì)胞集落長(zhǎng)到孔底面積的1/4～1/2大小，培養(yǎng)液變黃，取細(xì)胞上清液，用改進(jìn)的夾心ELISA方法進(jìn)行抗體檢測(cè)，其具體步驟為：在酶標(biāo)板的每個(gè)孔中加100 μL稀釋1 000 倍的羊抗牛IgG抗體，4 ℃過(guò)夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，加含有0.05%吐溫20的磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline containing 0.05%Tween 20，PBST）洗滌3 次；加0.1 mol/L氯化銨溶液封閉，37℃溫育1 h，洗滌3 次；加雜交瘤細(xì)胞株培養(yǎng)液上清液100 μL于反應(yīng)孔中，置37 ℃溫育1 h，洗滌3 次。同時(shí)以陰性培養(yǎng)液上清液作陰性對(duì)照，以陽(yáng)性血清作陽(yáng)性對(duì)照，以PBS作空白對(duì)照。各反應(yīng)孔中加入5 000 倍稀釋的辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體100 mL，37 ℃溫育40 min，洗滌5 次；加入剛剛配制的TMB底物溶液100 μL，37 ℃暗處溫育10 min。加入終止液50 μL，立即在酶標(biāo)儀上測(cè)定OD450nm。

采用有限稀釋法對(duì)篩選出的陽(yáng)性孔進(jìn)行克隆。多次克隆直至所有細(xì)胞堆檢測(cè)均為陽(yáng)性，停止克隆。將陽(yáng)性細(xì)胞株轉(zhuǎn)移至6孔板中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期雜交瘤細(xì)胞，按程序冷凍保存。

1.3.3 單克隆抗體的制備

采用小鼠腹腔誘導(dǎo)腹水制備單克隆抗體。取16 周齡雌性BALB/c小鼠數(shù)只，每只腹腔注射0.5 mL石蠟油，7～10 d后腹腔注入擴(kuò)大培養(yǎng)的雜交瘤細(xì)胞（5×105個(gè)/只）。2 周后，采集腹水，37 ℃放置1 h，4 ℃過(guò)夜，4 ℃、10 000 r/min離心15 min，收集腹水上清液，－80 ℃凍存。

1.3.4 單克隆抗體的鑒定

1.3.4.1 單克隆抗體效價(jià)的測(cè)定

采用間接ELISA方法測(cè)定腹水抗體效價(jià)。具體步驟為：牛IgG質(zhì)量濃度為1 μg/mL，4 ℃包被過(guò)夜，0.1 mol/L氯化銨溶液37 ℃封閉1 h，將腹水從10 000 倍開(kāi)始倍比稀釋后加入酶標(biāo)板孔中，37 ℃溫育45 min，PBST洗滌3 次，加入5 000 倍稀釋的羊抗鼠酶標(biāo)二抗，100 μL/孔，37 ℃溫育1 h，PBST洗滌3 次，加入TMB底物溶液，100 μL/孔、37 ℃避光反應(yīng)10 min，每孔加入50 μL終止液，酶標(biāo)儀測(cè)定OD450nm值。同時(shí)以等稀釋度陰性腹水作為對(duì)照。計(jì)算平行稀釋的單克隆抗體OD值與陰性對(duì)照OD值的比值（P/N），P/N大于2.1時(shí)的最大稀釋倍數(shù)為單克隆抗體的效價(jià)。

1.3.4.2 單克隆抗體亞類(lèi)的鑒定

用單克隆抗體亞類(lèi)鑒定試劑盒鑒定單克隆抗體亞類(lèi)（按說(shuō)明書(shū)操作）。

1.3.4.3 單克隆抗體的純化

采用G蛋白親和層析法純化腹水單克隆抗體。取出凍存腹水，于4 ℃中緩慢解凍，12 000 r/min離心20 min，取上清液用0.22 μm膜過(guò)濾器過(guò)濾。收集的濾液經(jīng)HiTrap Protein G HP的柱子進(jìn)行純化；首先用10倍柱體積的20 mmol/L pH 7.0磷酸緩沖液洗柱，然后用注射器以1 mL/min的進(jìn)樣速度加入5～10 倍柱體積的溶于上樣緩沖液的腹水抗體，用上樣緩沖溶液沖洗柱子至OD280nm小于0.008，最后用2～5 倍柱體積的0.1 mol/L pH 2.7甘氨酸鹽酸緩沖液洗脫，用1.5 mL EP管（每管已加入100 μL 1 mol/L pH 9.0 Tris-HCl緩沖液）收集洗脫液，混勻后用pH試紙檢查洗脫液的pH值，如果pH值低于7可利用中和緩沖液調(diào)至約pH 7.4以防止抗體的變性。單克隆抗體純化后，用截留量分子質(zhì)量為8 000 Da的透析袋，4 ℃透析48 h，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）檢測(cè)抗體純度。

1.3.4.4 單克隆抗體反應(yīng)性分析

酶標(biāo)板包被牛IgG、牛IgG1、牛IgG2，間接ELISA檢測(cè)4株單克隆抗體與牛IgG1、IgG2的反應(yīng)性。

1.3.4.5 單克隆抗體識(shí)別抗原表位區(qū)域的確定

采用ELISA法檢測(cè)單克隆抗體對(duì)牛IgG分子識(shí)別部位。酶標(biāo)板上分別按1 μg/mL包被牛IgG全分子、牛IgG酶解Fc片段和Fab片段，其他同間接ELISA法。

采用免疫印跡法（Western Blot）檢測(cè)單克隆抗體識(shí)別牛IgG重鏈、輕鏈。取約0.05 μg牛IgG進(jìn)行12%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）SDS-PAGE，結(jié)束后用150 mA恒流轉(zhuǎn)膜1.5 h至硝酸纖維膜，用5%脫脂奶粉室溫封閉3 h，用質(zhì)量濃度為1 mg/mL的單克隆抗體在4℃反應(yīng)過(guò)夜，同時(shí)以未免疫小鼠血清IgG和羊抗牛IgG多克隆抗體作陰性、陽(yáng)性對(duì)照。PBST洗3 次后再用PBS洗2 次，加酶標(biāo)二抗反應(yīng)45 min，PBST洗3 次，PBS洗2 次后加底物，觀察顯色情況，考察單克隆抗體的抗原識(shí)別區(qū)域。

1.3.4.6 單克隆抗體特異性分析

選擇幾種常見(jiàn)動(dòng)物IgG、牛奶來(lái)源蛋白質(zhì)及反應(yīng)體系中涉及到的蛋白測(cè)定交叉反應(yīng)率。以不同質(zhì)量濃度的牛IgG和其他蛋白分別作競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線，計(jì)算各自的結(jié)合率，求出各自在50%抑制濃度（IC50）時(shí)的質(zhì)量濃度，用公式（1）計(jì)算交叉反應(yīng)率，考察單克隆抗體的特異性。

式中：S為交叉反應(yīng)率/%；y為IC50時(shí)牛IgG的質(zhì)量濃度/（μg/mL）；z為IC50時(shí)其他蛋白的質(zhì)量濃度/（μg/mL）。

1.3.4.7 單克隆抗體親合力的測(cè)定

利用非競(jìng)爭(zhēng)性酶免疫法測(cè)定9C6抗體親合力。牛IgG按1、0.5、0.25、0.125 μg/mL包被酶標(biāo)板。蛋白質(zhì)量濃度為1 mg/mL單克隆抗體從500 倍開(kāi)始倍比稀釋后按間接ELISA方法進(jìn)行測(cè)定。以單克隆抗體濃度（mol/L）的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)、OD450nm為縱坐標(biāo)，繪制4條S形曲線。以S形曲線的頂部為最大光密度ODmax，求出各曲線50%ODmax對(duì)應(yīng)的單克隆抗體濃度（IC50，mol/L）。將4 個(gè)濃度兩兩分組，根據(jù)公式（2）計(jì)算親合力常數(shù)。

式中：Ka為親合力常數(shù)；n為每組中兩個(gè)包被抗原濃度的倍數(shù)；[Ab’]t和[Ab]t分別為每組中兩條曲線IC50對(duì)應(yīng)的抗體濃度/（mol/L）。

2 結(jié)果與分析

2.1 免疫小鼠血清效價(jià)測(cè)定結(jié)果

小鼠3 次免疫后用間接ELISA法檢測(cè)血清效價(jià)，由表1可以看出，P/N大于2.1的最大稀釋倍數(shù)為2.048×106倍，因此4 只小鼠的血清效價(jià)均達(dá)到融合要求。

表1 免疫小鼠血清效價(jià)測(cè)定結(jié)果Table1 Serum titers of immunized mice

2.2 雜交瘤細(xì)胞株的篩選結(jié)果

免疫小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0融合后，計(jì)數(shù)融合株，計(jì)算得出融合率在30.5%～42.3%之間。對(duì)融合株細(xì)胞上清液進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)陽(yáng)性株進(jìn)行克隆篩選，最終從90 株融合株里篩選得到4 株穩(wěn)定分泌抗牛IgG單克隆抗體的細(xì)胞株，分別命名為2F6、5E3、9C6、9H8。

2.3 單克隆抗體鑒定結(jié)果

2.3.1 單克隆抗體效價(jià)測(cè)定結(jié)果

圖2 單克隆抗體效價(jià)測(cè)定結(jié)果Fig.2 Titers of McAbs

由圖2可以看出，2F6和5E3抗體效價(jià)為2.56×106，9C6和9H8為5.12×106。

2.3.2 單克隆抗體亞類(lèi)鑒定結(jié)果

表2 單克隆抗體亞類(lèi)鑒定結(jié)果Table2 Identification of subtypes of McAbs

如表2所示，2F6、5E3、9C6、9H8四株雜交瘤細(xì)胞分泌的抗體均為IgG1型。2F6、9H8的輕鏈為k型，5E3、9C6輕鏈為λ型。

2.3.3 單克隆抗體純化結(jié)果

采用G蛋白親和層析方法對(duì)腹水抗體進(jìn)行純化，純化后抗體經(jīng)SDS-PAGE進(jìn)行純度鑒定，由圖3可以看出，純化后的抗體在50 kDa和25 kDa位置出現(xiàn)清晰條帶，分別對(duì)應(yīng)抗體的重鏈和輕鏈，表明抗體純化取得了較好的效果。

2.3.4 單克隆抗體反應(yīng)性測(cè)定結(jié)果

采用間接ELISA法測(cè)定4 株單克隆抗體與牛IgG1和IgG2的反應(yīng)性，由表3可以看出，2F6、9H8只與牛IgG1反應(yīng)，5E3只與牛IgG2反應(yīng)，9C6與牛IgG1和IgG2均發(fā)生反應(yīng)。

圖3 單克隆抗體純化前后SDS-PAGE圖Fig.3 SDS-PAGE of ascites and purified McAbs

表3 單克隆抗體對(duì)IgG1和IgG2反應(yīng)性Table3 Reactivity of McAbs with IgG1 and IgG2

2.3.5 單克隆抗體識(shí)別抗原表位區(qū)域的確定

分別以牛IgG全分子、IgG酶解Fab片段和Fc片段為抗原包被酶標(biāo)板，采用間接法測(cè)定單克隆抗體對(duì)牛IgG分子的識(shí)別區(qū)域，表4結(jié)果表明，2F6、9C6識(shí)別Fab片段，而5E3、9H8識(shí)別Fc片段。進(jìn)一步采用Western Blot檢測(cè)其對(duì)牛IgG片段的識(shí)別。

表4 單克隆抗體對(duì)牛IgG片段的識(shí)別（ELISA）Table4 Recognition of bovine IgG fragments by McAbs (ELISA)

牛IgG在SDS-PAGE過(guò)程中，在SDS作用下二硫鍵被破壞，分解為重鏈和輕鏈，分子質(zhì)量分別為50 kDa和25 kDa。電泳后轉(zhuǎn)膜后，加單克隆抗體反應(yīng)，經(jīng)酶標(biāo)二抗檢測(cè)，由圖4可以看出，2F6單克隆抗體與25 kDa位置的條帶反應(yīng)，即與牛IgG輕鏈發(fā)生反應(yīng)，而5E3、9H8和9C6與50 kDa位置的條帶反應(yīng)，即與牛IgG重鏈反應(yīng)。結(jié)合表4結(jié)果判斷，9C6單克隆抗體識(shí)別牛IgG Fab段重鏈部分，而2F6識(shí)別牛IgG Fab段輕鏈部分，5E3、9H8識(shí)別牛IgG重鏈Fc段部分。因此，確定9C6為牛IgG免疫分析研究用抗體，對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。

圖4 免疫印跡結(jié)果Fig.4 Western Blot

2.3.6 單克隆抗體交叉反應(yīng)性的測(cè)定結(jié)果

表5 9C6交叉反應(yīng)率Table5 Cross-reactivity of 9C6%

9C6與幾種動(dòng)物IgG和免疫檢測(cè)常用蛋白的交叉反應(yīng)性測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表5。9C6產(chǎn)生的單克隆抗體與山羊IgG（G IgG）、綿羊IgG（S IgG）、兔IgG（R IgG）、牛IgM（B IgM）、牛乳酪蛋白（CN）、牛乳β-乳球蛋白（β-Lg）、牛乳鐵蛋白（LF）、牛血清白蛋白（BSA）、雞卵清白蛋白（OVA）、魚(yú)明膠（FG）的交叉反應(yīng)率均小于1%。

2.3.7 單克隆抗體親合力的測(cè)定結(jié)果

圖5 9C6親合力測(cè)定結(jié)果Fig.5 Affinity of 9C6

如圖5所示，經(jīng)計(jì)算，9 C 6的親合力常數(shù)為8.92×108L/mol，屬于較高親合力的抗體。

3 討 論

按常規(guī)方法從動(dòng)物血清中提取特異性的抗牛IgG的抗體需要繁瑣的吸收程序，研究制備的抗牛IgG單克隆抗體效價(jià)高、特異性強(qiáng)、性質(zhì)穩(wěn)定、可重復(fù)性好。利用雜交瘤細(xì)胞技術(shù)制備單克隆抗體技術(shù)自1975年建立以來(lái)，許多研究者利用該技術(shù)獲得了諸多克隆抗體原的單克隆抗體，但是抗牛IgG的單克隆抗體少之又少，原因主要在于用來(lái)培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)基中含有牛血清，而牛血清中含有牛IgG，使得雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的抗體一經(jīng)分泌便與培養(yǎng)基中的IgG結(jié)合，造成了陽(yáng)性克隆篩選的困難，使得許多研究者沒(méi)能成功地獲得有效的抗體。早在1982年，國(guó)外就報(bào)道了抗牛IgG單克隆抗體的制備[18]，實(shí)驗(yàn)中為排除牛血清中IgG的干擾，采用無(wú)血清培養(yǎng)基。這種培養(yǎng)基中細(xì)胞形態(tài)容易發(fā)生變化，甚至死亡，即使存活的細(xì)胞也容易失去原有的功能和生物學(xué)特性。而且，無(wú)血清培養(yǎng)基成本遠(yuǎn)高于血清培養(yǎng)基。本研究中創(chuàng)造性地采用了改進(jìn)的夾心ELISA模式檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞上清液中已經(jīng)形成的抗原抗體復(fù)合物，從大量的雜交瘤細(xì)胞株中篩選得到4株陽(yáng)性細(xì)胞株。抗體的親合力常數(shù)是對(duì)抗體與抗原之間作用的最本質(zhì)的描述，是表示抗原表面單一決定簇與相應(yīng)抗體單一結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合強(qiáng)度。在單克隆抗體的特性鑒定中，親合力常數(shù)的測(cè)定十分重要。一般認(rèn)為，親合力常數(shù)在107～1012L/mol之間時(shí)，屬于高親合力的抗體，在105～107L/mol之間時(shí)，屬于低親合力的抗體[26]。本研究利用非競(jìng)爭(zhēng)性酶免疫法測(cè)定抗體親合力，測(cè)得9C6的親合力常數(shù)為8.92×108L/mol，證明其分泌的抗體為高親合力抗體，可以滿足免疫學(xué)檢測(cè)方法的要求。

高東微等[22]用木瓜蛋白酶解IgG制備Fc片段用作免疫原免疫小鼠，通過(guò)細(xì)胞融合和篩選獲得一株分泌Fc片段的單克隆抗體，腹水單克隆抗體效價(jià)較高，與酪蛋白、乳清蛋白等交叉反應(yīng)率均小于1%，但未鑒定與抗原結(jié)合的片段。王平等[23]篩選得到4 株分泌抗牛IgG單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，相加實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明其中的1 株與其他3 株產(chǎn)生的抗體針對(duì)不同的抗原表位，但沒(méi)有明確鑒定出具體的識(shí)別片段。而且，這株單克隆抗體既與牛IgG反應(yīng)也與羊IgG反應(yīng)。韓秀娥等[24]報(bào)道用IgG全分子免疫小鼠制備抗牛IgG單克隆抗體。以上3 個(gè)報(bào)道未提及單克隆抗體與牛IgG1和IgG2的反應(yīng)性。本研究制備的抗體效價(jià)高、特異性好，與牛IgG1和IgG2均能發(fā)生反應(yīng)，這一點(diǎn)為準(zhǔn)確測(cè)定樣品的IgG含量提供了有效保障。牛IgG1和IgG2的Fab片段相同，F(xiàn)c片段既有差異序列，也有一些共同的抗原決定簇[1,27]。據(jù)測(cè)定，牛血清中IgG1質(zhì)量濃度6.0～15.1 mg/mL，IgG2質(zhì)量濃度5.0～13.5 mg/mL[27]。牛初乳中IgG1質(zhì)量濃度30.0～75.0 mg/mL，IgG2質(zhì)量濃度1.9～4.0 mg/mL[27]。因此無(wú)論是血清樣品還是初乳樣品中牛IgG的量都應(yīng)為二者的總和。若抗體不能保證針對(duì)IgG1和IgG2兩種抗原，則無(wú)法保證檢測(cè)的可靠性。此外，由于哺乳動(dòng)物IgG的同源性，制備出的抗牛IgG的單克隆抗體易與其他種類(lèi)的動(dòng)物IgG發(fā)生交叉反應(yīng)，如山羊、兔等[19,28-30]。國(guó)際上Sigma公司和Abcam公司出售的商品抗牛IgG單克隆抗體均來(lái)自BG-18細(xì)胞株，從側(cè)面反映出獲得產(chǎn)生特異性強(qiáng)、效價(jià)高的抗牛IgG單克隆抗體細(xì)胞株的困難程度。因此，可以認(rèn)為，本研究制備的單克隆抗體具備牛IgG免疫學(xué)分析所用抗體的特性，是一株優(yōu)良的抗體。經(jīng)過(guò)進(jìn)一步研究可以有以下幾個(gè)方面的應(yīng)用：1）經(jīng)HRP、FITC等標(biāo)記后用于免疫組化、免疫印跡、免疫層析、免疫傳感器等檢測(cè)體系中檢測(cè)牛IgG，包括牛初乳及制品中IgG濃度的檢測(cè)、小牛被動(dòng)免疫情況、疫苗等細(xì)胞培養(yǎng)生物制品中殘留牛IgG含量測(cè)定以及作為二抗檢測(cè)各種疾病的病原；2）單克隆抗體與sepharose CL-4B介質(zhì)偶聯(lián)制成親和層析填料，可用于高純度牛IgG、牛IgG及其酶解片段的制備和超低IgG胎牛血清的制備。

4 結(jié) 論

將免疫小鼠的脾細(xì)胞和小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0進(jìn)行融合，經(jīng)篩選得到穩(wěn)定分泌抗牛IgG單克隆抗體的細(xì)胞株4 株：5E3、2F6、9C6和9H8，其抗體亞型均為IgG1，腹水抗體效價(jià)可達(dá)到5.12×106。腹水抗體經(jīng)G蛋白親和層析純化后，純度較高；采用ELISA和Western Blot法對(duì)抗體識(shí)別抗原片段進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明，5E3、9H8識(shí)別牛IgG重鏈Fc片段，2F6識(shí)別牛IgG輕鏈Fab片段，9C6識(shí)別牛IgG重鏈Fab片段；只有9C6與牛IgG1和IgG2均反應(yīng)；進(jìn)一步的交叉反應(yīng)性測(cè)定結(jié)果表明，9C6與山羊IgG、綿羊IgG、兔IgG、牛IgM、牛乳酪蛋白、牛乳β-乳球蛋白、牛乳鐵蛋白、牛血清白蛋白、雞卵清白蛋白、魚(yú)明膠的交叉反應(yīng)率均小于1%；9C6的親合力常數(shù)達(dá)8.92×108L/mol，屬于高親合力抗體，可用其進(jìn)行免疫學(xué)方法的建立和應(yīng)用研究。