基于嗅覺可視化技術(shù)和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用鑒別霉變小麥

嚴 松，林 顥

（江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013）

糧食在儲運過程中，極易感染霉菌，導致發(fā)霉變質(zhì)[1]。據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織估計，全世界每年大概有5%～7%的谷物、飼料等農(nóng)作物受霉菌污染導致不能食用，不僅造成糧食的浪費和經(jīng)濟的損失，還會產(chǎn)生危害人畜健康的真菌毒素等[2]。因此，監(jiān)控和預防糧食發(fā)生霉變已經(jīng)成為糧食工作中的重中之重。目前，在日常生活中對糧食霉變的判別主要是依靠人的嗅覺、視覺感官等手段完成[3]，而在實驗室中大多采用理化方法判別糧食是否霉變[4]，主要方法有菌落計數(shù)法[5]、薄層色譜分析法[6]、高效液相色譜法[7-9]等。這些分析方法操作十分繁瑣、成本高、分析難度較大、耗時較長，往往在檢測出霉菌后，糧食已經(jīng)遭受了不可逆的危害，從而對霉變的檢測失去意義。

小麥霉變檢測技術(shù)要求和發(fā)展趨勢是快速、準確、無損和早期檢測，從全新角度尋找一種普便適用、精準和無損檢測方法，實現(xiàn)早期危害的真菌多參量測量，科學指導防霉減損，已經(jīng)成為一項迫切且重要的工作，這對于國家儲備糧的安全也具有非常重要的意義。小麥在霉變過程中，有機物受到微生物的作用后，會產(chǎn)生大量的特征性揮發(fā)性物質(zhì)[10]。目前，最常用的檢測方法就是傳感器法，對于霉變小麥的無損檢測方法主要有電子鼻技術(shù)和圖像處理技術(shù)，電子鼻技術(shù)采用的金屬氧化物傳感器對揮發(fā)性氣體的選擇性較差，靈敏度較低，而圖像處理技術(shù)只能檢測出已經(jīng)表面長霉的小麥，這兩種技術(shù)都只能用于檢測霉變較為嚴重的小麥。近年來，基于氣敏傳感器陣列的嗅覺可視化技術(shù)迅速發(fā)展，它采用的色敏材料具有廣譜性、專一性強、靈敏度高且不受濕度影響的特點[11-12]，能夠?qū)崿F(xiàn)對小麥霉變的快速、準確檢測。國內(nèi)外學者還陸續(xù)利用嗅覺可視化技術(shù)完成了對魚肉[13]、雞肉[14]、香腸[15]等新鮮度的檢測。此外，該技術(shù)還可以用于食醋[16]、水果[17]、咖啡[18]和茶葉[19-20]等食品的揮發(fā)性氣體，展現(xiàn)了嗅覺可視化技術(shù)在食品檢測方面巨大的潛力。

本研究首先利用氣相色譜-質(zhì)譜（g a s chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用技術(shù)對不同霉變程度小麥的揮發(fā)性成分進行分析，找出表征小麥霉變的標志物，并為小麥揮發(fā)性氣體的可視化檢測提供一定的參考。利用嗅覺可視化技術(shù)對霉變小麥進行判別，借助主成分分析（principal component analysis，PCA）和模式識別法分別建立小麥霉變程度的檢測模型，以期實現(xiàn)對霉變小麥快速、無損檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

矮抗58小麥種子購于宿遷中江種業(yè)有限公司，將新鮮的小麥種子放入生化培養(yǎng)箱中，設定溫度為30 ℃，相對濕度為90%，2～3 d后小麥就會逐漸發(fā)霉，通過改變小麥在生化培養(yǎng)箱中的儲藏時間制備不同霉變程度的小麥樣品。

8-（4-硝基苯基）-4,4-二氟硼二吡咯甲烷、8-（4-溴苯基）-4,4-二氟硼二吡咯甲烷、8-苯基-4,4-二氟硼二吡咯甲烷由本實驗室自主合成；二氯甲烷 國藥集團化學試劑有限公司；4-甲基-2-戊醇 北京百靈威科技有限公司。

1.2 儀器與設備

固相微萃取進樣器、75 μm CAR/PDMS固相微萃取頭 美國Supelco公司；帶硅橡膠墊的15 mL樣品瓶上海安譜實驗科技股份有限公司；PVDF膜 美國密理博公司；BS224S型電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；PC-420型磁力恒溫攪拌器 美國Coming公司；HP6890-5973 GC-MS聯(lián)用儀 美國Agilent公司；嗅覺可視化檢測系統(tǒng)由本實驗室自主搭建。

1.3 方法

1.3.1 GC-MS對小麥霉變標志物的篩選分析

采用頂空固相微萃取與GC-MS分別對新鮮小麥及在生化培養(yǎng)箱中儲藏3、7、11 d的霉變小麥進行檢測，每個批次10 個樣品，共40 個樣品。實驗開始前，將萃取頭插入GC進樣口于300 ℃老化1 h，直至無雜峰。然后稱?。?.0±0.1）g的小麥樣品置于15 mL的萃取瓶中，并加入10 μL 0.012 12 g/mL的4-甲基-2-戊醇作為內(nèi)標以定量。將該萃取瓶置于75 ℃進行水浴加熱。將萃取頭刺穿瓶蓋的橡膠墊置樣品頂空，推出纖維頭并頂空吸附小麥自然揮發(fā)氣體40 min。吸附完成后，將纖維頭撤回，并將萃取頭從萃取瓶子中拔出。再將萃取頭插入GC儀器的進樣口，推出纖維頭，250 ℃解吸5 min，完成樣品的進樣。

G C條件：D B 5 2 M 5彈性石英毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；柱溫：始溫65 ℃保持4 min，以5 ℃/min升溫至180 ℃后保持5 min，最后以20 ℃/min升溫至220 ℃后保持5 min；載氣（高純He）流量1 mL/min，不進行分流；進樣口溫度250 ℃。

MS條件：接口溫度250 ℃；電離方式正離子，離子源溫度230 ℃；電子能量70 eV；質(zhì)量掃描范圍50～550 u。

1.3.2 嗅覺可視化系統(tǒng)對霉變小麥的識別1.3.2.1 色敏傳感器的制作

傳感器的制作：分別精確稱取10 mg的色敏材料，各自用二氯甲烷溶解，定容至5 mL容量瓶中。所有溶液均超聲15 min促進溶解，獲得質(zhì)量濃度為2 mg/mL溶液。用100 mm×0.3 mm的毛細管吸取1 μL溶液并用陣列模板輔助點樣于疏水的PVDF膜上。待色敏材料在基底材料上揮發(fā)至穩(wěn)定，就獲得可視化傳感器陣列，將其用樣本袋單個密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2.2 嗅覺可視化系統(tǒng)的構(gòu)建

實驗中采用自制的嗅覺可視化系統(tǒng)，如圖1所示，該系統(tǒng)主要由硬件和軟件兩部分組成。硬件部分主要包括反應室、3CCD相機、漫反射LED積分球光源以及信號輸出系統(tǒng)（計算機）。軟件部分主要包括圖像獲取裝置驅(qū)動程序和圖像處理程序[21]。

將不同的色敏材料制成傳感器構(gòu)成色敏傳感器陣列，這些色敏材料與待測物反應后，其顏色會產(chǎn)生顯著的變化[22]。將3CCD相機獲取反應前后的圖像經(jīng)過中值濾波、閾值二值化、形態(tài)學處理后，以傳感器陣列上每個傳感器單位的中心為圓心，分別取半徑為15 個像素點的圓作為每個傳感器的感興趣區(qū)域（region of interest，ROI），分別提取反應前后每個傳感器中ROI的R、G、B分量的灰度均值，然后對灰度均值進行相減，便可得到反應前后R、G、B分量的特征差值（ΔR、ΔG、ΔB），隨后對ΔR、ΔG、ΔB的絕對值歸一化后進行灰度圖像疊加，即可生成其特征圖。

圖1 嗅覺可視化檢測裝置示意圖Fig.1 Schematic diagram showing the artificial olfaction system

1.3.2.3 霉變小麥揮發(fā)性氣體與傳感器反應分析

利用GC-MS篩選出的小麥霉變標志物對色敏材料進行篩選，將篩選出的色敏材料制備成色敏傳感器陣列，并將其用于對不同霉變程度小麥（新鮮小麥、儲藏3、7、11 d的霉變小麥）的可視化檢測。實驗步驟：將傳感器制備好后，立即用嗅覺可視化裝置采集原始圖像，然后分別取8.0 g不同霉變程度的小麥（新鮮小麥、儲藏3、7、11 d的霉變小麥）倒入小燒杯并密封，隨后置于55 ℃的烘箱內(nèi)使得傳感器與霉變小麥揮發(fā)特征氣體反應20 min，隨后取出傳感器并用嗅覺可視化系統(tǒng)采集反應后的圖像。最后利用圖像處理提取反應前后的ΔR、ΔG、ΔB值，進行數(shù)據(jù)分析后建立對不同霉變程度小麥揮發(fā)性成分的判別模型。

1.4 數(shù)據(jù)的采集與處理

GC-MS數(shù)據(jù)的收集由HP-Chemstation System工作站系統(tǒng)對照NIST 98庫完成，成分由譜庫進行鑒定，采取面積歸一化法計算各物質(zhì)的相對含量。

嗅覺可視化系統(tǒng)中圖像的獲取裝置是3CCD相機，其獲取軟件是在Windows系統(tǒng)下應用Microsoft Visual Studio+QT4.6開發(fā)完成。圖像處理部分利用Matlab軟件完成。最終將得到的特征圖譜與ΔR、ΔG、ΔB值通過PCA、線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）和K-最近鄰域（K-nearest neighbores，KNN）模式識別方法區(qū)分不同霉變程度的小麥。

2 結(jié)果與分析

2.1 GC-MS對霉變小麥霉變標志物的篩選分析結(jié)果

GC-MS共檢測出53 種揮發(fā)性成分，其中烴類13 種、醇類12 種、醛類9 種、酮類4 種、雜環(huán)類3 種以及其他化合物12 種。其中，新鮮小麥的揮發(fā)性成分主要是異戊醛、己醛、壬醛3種醛類物質(zhì)；隨著小麥霉變程度的加劇，在輕微霉變小麥的揮發(fā)性氣體中開始檢測出1-辛烯-3-醇、2-丁基-1-辛醇、甲酸異戊酯等有機物，主要增加的化合物為醇類化合物。隨著霉變程度的進一步加劇，在中度霉變的小麥中檢測出正十六烷、正十八烷和2,2,4,4-四甲基-3-戊酮，主要增加的化合物為烴類物質(zhì)以及酮類物質(zhì)。此時小麥內(nèi)部的脂肪、蛋白質(zhì)進一步氧化、水解。在對重度霉變小麥的揮發(fā)性氣體的檢測中，檢測出反-乙-十一烯醇、反式-乙-辛烯-1-醇、苯甲醛、苯乙醛和3-辛酮，醇類物質(zhì)與醛類物質(zhì)含量大量增加。另外，在所有霉變小麥揮發(fā)性氣體的檢測中都檢測出了1-辛烯-3-醇、雙戊烯、長葉烯和右旋萜二烯。

2.1.1 小麥霉變揮發(fā)性氣體成分的PCA結(jié)果

PCA是一種通過正交線性變化實現(xiàn)數(shù)據(jù)降維的多元線性分析方法[23]，利用PCA可以從大量的原始數(shù)據(jù)中提取有效信息，將多指標轉(zhuǎn)化為較少的綜合指標，通過前3 個主成分的三維圖將不同類別的聚類趨勢展示出來，不僅簡化了數(shù)據(jù)量，也保留了有效信息[24-26]。由圖2可知，前3 個主成分的方差貢獻率分別為46.47%、29.40%、7.92%，累計方差貢獻率達到83.79%，可見霉變小麥揮發(fā)性氣體成分的整體信息可用前3 個主成分表示。從圖2可以看出，儲藏7 d與儲藏11 d的小麥都在三維圖中有部分重疊并且在三維圖中相隔較近，其原因可能是小麥霉變后期揮發(fā)性氣體成分差別不大，小麥霉變情況相似。除此之外，其他批次的霉變小麥可以很好地區(qū)分。整體而言，通過對小麥揮發(fā)性氣體的PCA可良好地區(qū)分不同霉變程度小麥，進一步證實通過對揮發(fā)性氣體的研究表征霉變小麥的可行性。

圖2 不同霉變程度小麥PCA圖Fig.2 PCA plot for wheat with different mildew degrees

2.1.2 載荷因子分析

載荷因子反映該變量在主成分中的貢獻度，其絕對值越大說明貢獻度越高。為篩選出能夠表征霉變小麥的標志物，本研究利用載荷因子分析對PCA中的前3 個主成分分量進行分析，如圖3所示，26號化合物的載荷因子最高，其對應的化合物是1-辛烯-3-醇，說明1-辛烯-3-醇是小麥霉變過程中影響最大的揮發(fā)性氣體成分；其次是5號和15號，分別是異戊醛和壬醛。

圖3 不同霉變程度小麥揮發(fā)性氣體主成分模型的載荷因子Fig.3 Loading factors of volatile organic compounds in moldy wheat based on PCA model

分別對不同霉變小麥揮發(fā)性氣體中的1-辛烯-3-醇、異戊醛和壬醛含量的變化進行方差分析，如表1所示。隨著霉變程度的加劇，1-辛烯-3-醇含量顯著增加；而異戊醛含量的變化沒有規(guī)律，差異也不顯著；壬醛也只在新鮮小麥和儲藏7 d的霉變小麥中檢出。因此，本研究確定以1-辛烯-3-醇作為表征不同霉變程度小麥的標志物。

表1 方差貢獻率最大的3 種揮發(fā)性成分含量的變化規(guī)律Table1 Changes in the contents of 3 volatile organic components with the largest contribution to the total variance

2.2 嗅覺可視化系統(tǒng)對霉變小麥的識別結(jié)果

2.2.1 嗅覺可視化對霉變小麥的反應特征

實驗通過嗅覺可視化系統(tǒng)從12 種氟硼吡咯類化合物和18 種金屬卟啉中篩選出3 種對1-辛烯-3-醇敏感的色敏材料，分別為8-（4-硝基苯基）-4,4-二氟硼二吡咯甲烷、8-（4-溴苯基）-4,4-二氟硼二吡咯甲烷、8-苯基-4,4-二氟硼二吡咯甲烷。將這3 種化合物溶于二氯甲烷配制成2 mg/mL的溶液，分別用0.3 mm的點樣毛細管點在基底材料上（PVDF膜），制備成1×3的交互敏感傳感器陣列。將該陣列與不同霉變程度的小麥（新鮮小麥，儲藏3、7、11 d的霉變小麥）反應，其反應前后圖像以及特征圖像如圖4所示。

圖4 不同霉變程度小麥的傳感器響應Fig.4 Sensor responses to wheat with different mildew degrees

2.2.2 嗅覺可視化系統(tǒng)識別的PCA結(jié)果

通過制備好的1×3的色敏傳感器陣列對不同霉變程度的小麥（新鮮小麥，儲藏3、7、11 d的霉變小麥）進行分類。每個霉變程度小麥36 個樣本，共144 個霉變小麥樣本，其中每個樣本有9 個變量（3 種色敏材料×ΔR、ΔG、ΔB），其所包含的信息量過大，故采用PCA法對所提取的特征值進行降維處理。從9 個特征參數(shù)中選取3 個主成分擬合原數(shù)據(jù)，其方差貢獻率分別為55.54%、20.51%、8.98%，累計方差貢獻率達到85.03%，因此，可用前3 個主成分代表小麥霉變揮發(fā)性氣體的整體信息。從圖5可以看出，各個霉變程度的小麥在散點圖中都能呈現(xiàn)出一定的聚類趨勢，除了新鮮小麥與儲藏11 d的霉變小麥有一小部分的重疊，其他幾類的霉變小麥都能實現(xiàn)較好的區(qū)分。通過PCA結(jié)果說明，通過嗅覺可視化技術(shù)對霉變小麥進行識別的方法可靠。

圖5 不同霉變程度小麥的PCA圖Fig.5 Principal component analysis of wheat with different mildew degrees

2.2.3 模型識別結(jié)果

2.2.3.1 KNN模型識別

KNN是一種“有監(jiān)督的學習”的模式識別方法[27]，首先將訓練集全部樣本的數(shù)據(jù)存儲在計算機，然后判別每個未知樣本，逐一計算其與訓練集樣本間的距離，找出其中最近的K 個進行判別[28]。K值的大小和主成分數(shù)對判別結(jié)果有一定的影響。本研究以PCA提取的主成分因子作為KNN判別模型的輸入，從144 個樣本中隨機選取96 個樣本作為訓練集，剩下的48 個樣本作為預測集，采用交叉驗證過程來優(yōu)化9 個K值（K=1,2,…,9）和9 個主成分數(shù)（PCs=1,2,…,9），結(jié)果如圖6所示。從圖6可以看出，當K為2、主成分數(shù)為9時，KNN模型交叉驗證識別率最高。此時，模型交叉驗證識別率為95.83%，預測集識別率為95.83%。

圖6 不同霉變程度小麥的KNN模型Fig.6 KNN model for wheat with different mildew degrees

2.2.3.2 LDA模型識別

LDA基本思想是投影，將n維數(shù)據(jù)投影到低維空間，使得投影后組與組之間盡可能地分開，即在該空間中有最佳的分離性，而衡量標準是新的子空間有最大的類內(nèi)距離和最小的類間距離[29]。以PCA提取的主成分因子作為LDA判別模型的輸入，從144 個樣本中隨機選取96 個樣本作為訓練集，剩下的48 個樣本作為預測集進行判別分析，判別結(jié)果如圖7所示。從圖7可以看出，隨著主成分數(shù)的增加，模型訓練集的識別率先上升再下降，隨后又上升到最大；而預測集的識別率先上升后持續(xù)下降。綜合考慮訓練集和預測集的識別效果，當主成分數(shù)為5時，模型的判別效果最佳，此時訓練集的識別率為92.71%，預測集的識別率為85.40%。

圖7 不同霉變程度小麥的LDA模型Fig.7 LDA model for wheat with different mildew degrees

綜上所述，KNN和LDA模型都實現(xiàn)了對不同霉變程度小麥的判別，其模型訓練集與預測集的識別率如表2所示。從表2可以看出，雖然LDA模型建立時所選用的主成分數(shù)比KNN少，模型更為簡單，但是KNN的識別效果要優(yōu)于LDA。KNN模型在K為2、主成分數(shù)為9時，模型訓練總體識別率達到95.83%，預測總體識別率也達到了95.83%。因此，所建立的KNN模型為對不同霉變程度小麥的最佳檢測模型。

表 2 KNN與LDA模型識別率Table2 Recognition rates of KNN and LDA model

3 結(jié)論與討論

本研究利用GC-MS技術(shù)對不同霉變程度小麥的揮發(fā)性成分進行檢測，通過PCA將不同霉變程度小麥成功地區(qū)分，驗證了通過基于氣敏傳感器的嗅覺可視化技術(shù)對霉變小麥檢測的可行性，并通過載荷因子分析得出1-辛烯-3-醇是能夠表征小麥霉變程度的標志物，其含量在不同霉變程度的小麥中具有顯著差異?；诖?，利用小麥霉變的標志物（1-辛烯-3-醇）對色敏材料進行篩選并制成可視化傳感器陣列。利用嗅覺可視化技術(shù)對霉變小麥進行表征時，所建立的KNN和LDA模型都能夠完成對不同霉變程度小麥的判別，其中KNN的識別效果要優(yōu)于LDA，其模型在不同霉變程度小麥檢測的識別率達到95.83%，表明嗅覺可視化在表征小麥霉變氣體上具有優(yōu)異的檢測性能。而且相比傳統(tǒng)的GC-MS檢測，嗅覺可視化具有更高的檢測靈敏度，而且具有操作簡便快速、成本低等優(yōu)勢。

本研究利用實驗室自制的嗅覺可視化系統(tǒng)完成了對不同霉變程度小麥的檢測識別，該系統(tǒng)檢測具有良好的穩(wěn)定性與重復性，但要將該系統(tǒng)運用于實際應用中，還需要提高反應室中揮發(fā)性氣體在傳感器分布的均勻性、可視化傳感器的靈敏性和穩(wěn)定性以及進一步縮短反應時間，提高裝置的穩(wěn)定性和精確性以用于生產(chǎn)化。