鄧幸飛, 綦 艷, 李錦清, 張 燕, 熊 波, 劉 輝*

(1. 廣東產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院, 國家食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心(廣東), 廣東 佛山 528300; 2. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué), 廣東 廣州 510642)

不法商販為提高保健功效、降低成本、牟取暴利,在保健食品中非法添加化學(xué)藥物,成了制約保健食品行業(yè)健康發(fā)展的關(guān)鍵問題[1,2]。在減肥類、補(bǔ)腎壯陽類等保健食品中檢出化學(xué)藥物的事件時有發(fā)生[3,4]。近年來,隨著痛風(fēng)發(fā)病率的上升導(dǎo)致了抗痛風(fēng)類保健食品的產(chǎn)業(yè)不斷增大。因此加強(qiáng)抗痛風(fēng)類保健食品中化學(xué)藥物的監(jiān)測刻不容緩。

反復(fù)發(fā)作的慢性痛風(fēng)患者常用的治療藥物有別嘌醇、丙磺舒和苯溴馬隆等[5,6]。這3種化學(xué)藥物均為處方藥,長期服用,將對肝腎功能產(chǎn)生很大的毒副作用,并有加重心腦血管疾病等風(fēng)險[7,8]。

目前,國內(nèi)外檢測別嘌醇、丙磺舒和苯溴馬隆的主要方法有液相色譜法、質(zhì)譜法、氣相色譜法和毛細(xì)管電泳法等,檢測對象主要是血液、尿液等生物樣品[9-14],而對保健食品中痛風(fēng)藥物成分的研究甚少。張秋炎等[15]采用HPLC-MS/MS測定中成藥與保健食品中非法添加的9種尿酸調(diào)節(jié)類藥物,該方法中別嘌醇和丙磺舒的檢出限分別為300 μg/kg和200 μg/kg,但對苯溴馬隆藥物未進(jìn)行檢測。楊園園等[16]采用液相色譜法檢測抗痛風(fēng)類保健食品,發(fā)現(xiàn)部分含有激素類的化學(xué)藥物,但該方法也未對別嘌醇、丙磺舒和苯溴馬隆進(jìn)行檢測。因此建立一種檢測全面、靈敏度高的方法應(yīng)用于保健食品中慢性痛風(fēng)藥物的篩查和測定變得尤為必要。

QuEChERS方法是一種最早用于蔬菜水果中農(nóng)藥殘留檢測的前處理方法,近年來經(jīng)改良后開始應(yīng)用于保健食品中違禁藥物殘留的測定[17,18]?？雇达L(fēng)類保健食品中常含有多種動植物提取物以及加工過程中添加的各種輔料,基質(zhì)成分比較復(fù)雜。因此,本文通過QuEChERS方法對樣品進(jìn)行凈化,以降低基質(zhì)效應(yīng),提高方法的靈敏度,并建立了UPLC-MS/MS同時測定抗痛風(fēng)類保健食品中丙磺舒、別嘌醇、苯溴馬隆3種藥物的檢測方法,填補(bǔ)了抗痛風(fēng)類保健食品中苯溴馬隆的檢測空白,為強(qiáng)有力打擊制假售假行為提供技術(shù)支持。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

UPLC-Xevo TQ超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國Waters公司); JP-C600超聲波清洗機(jī)(廣州吉普超聲波電子設(shè)備有限公司); 3-18K高速冷凍離心機(jī)(美國Sigma公司); DT-502A電子天平(常熟市金羊砝碼儀器有限公司); IKA MS3漩渦混合器(德國IKA公司)。

乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)、石墨化炭黑(GCB)、十八烷基鍵合硅膠(C18)吸附劑(40～60 μm,美國Agilent公司);丙磺舒、別嘌醇、苯溴馬隆(純度均≥97%,德國Ehrenstorfer公司);甲醇、乙腈(色譜純,美國Sigma公司);甲酸(優(yōu)級純,德國CNW公司);氨水(質(zhì)量分?jǐn)?shù)25%,廣州化學(xué)試劑有限公司);實驗用水為二級蒸餾超純水。

1.2 實驗條件

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱取10.0 mg丙磺舒、別嘌醇和苯溴馬隆標(biāo)準(zhǔn)品,置于100 mL棕色容量瓶中,先加入1 mL氨水溶液,再加入適量甲醇溶解,最后用甲醇稀釋定容,配制成質(zhì)量濃度為0.1 g/L的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液,于4 ℃下避光保存,有效期2個月。使用前恢復(fù)至室溫,根據(jù)需要進(jìn)行稀釋,用空白基質(zhì)溶液配制成混合標(biāo)準(zhǔn)工作液,現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.2樣品前處理

去除膠囊類抗痛風(fēng)保健食品的囊殼,保留內(nèi)容物,經(jīng)充分混合后準(zhǔn)確稱取樣品2.0 g,置于50 mL離心管中,加入5 mL含0.1%(v/v)氨水的乙腈溶液和1 g NaCl,渦旋振蕩混合1 min,再超聲提取5 min,以8 000 r/min離心5 min,收集上清液,置于離心管中,再加入5 mL含0.1%(v/v)氨水的乙腈溶液重復(fù)上述提取操作,合并兩次上清液。加入100 mg PSA、50 mg C18吸附劑和1 g無水Na2SO4,渦旋混合3 min,以8 000 r/min離心5 min;移取上清液5 mL至玻璃試管中,于40 ℃下氮?dú)獯蹈?用1 mL含0.1%(v/v)氨水的乙腈溶液復(fù)溶,上清液過0.22 μm有機(jī)濾膜,待測。

1.2.3色譜條件

色譜柱:菲羅門Kinetex C18柱(100 mm×4.6 μm, 2.6 μm);柱溫:40 ℃;樣品室溫度:15 ℃;流動相:(A)甲醇和(B)0.1%(v/v)甲酸水溶液;流速:0.20 mL/min。梯度洗脫程序:0～2 min, 5%A; 2～6 min, 5%A～80%A; 6～9 min, 80%A; 9～10 min, 80%A～5%A。進(jìn)樣體積:10 μL。

1.2.4質(zhì)譜條件

離子源:電噴霧電離(ESI)源;離子化方式:ESI+和ESI-;檢測模式:多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式;離子源溫度:150 ℃;檢測器電壓:2.83 kV;離子源電壓:正離子模式+4.5 kV,負(fù)離子模式-3.5 kV;脫溶劑氣溫度:500 ℃;脫溶劑氣流量:800 L/h;碰撞氣流量:0.13 mL/min。別嘌醇采用ESI+、MRM模式監(jiān)測,監(jiān)測時間為0～5.52 min;丙磺舒、苯溴馬隆采用ESI-、MRM模式監(jiān)測,監(jiān)測時間為5.62～12.00 min, ESI+與ESI-同時掃描,切換時間為0.01 min。丙磺舒、別嘌醇和苯溴馬隆的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表 1 丙磺舒、別嘌醇和苯溴馬隆的質(zhì)譜參數(shù)

* Quantitative ion pair.

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

分別在ESI+和ESI-模式下對丙磺舒、別嘌醇和苯溴馬隆3種藥物的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行電離檢測,通過調(diào)節(jié)儀器參數(shù)使母離子的豐度達(dá)到最大,進(jìn)一步對子離子進(jìn)行二級質(zhì)譜掃描,得到碎片離子信息,選取相對豐度較強(qiáng)、干擾較小的兩對子離子作為定性、定量離子(見表1),使3種藥物的靈敏度達(dá)到最佳。結(jié)果發(fā)現(xiàn)別嘌醇在ESI+模式下有更好的響應(yīng),而丙磺舒和苯溴馬隆在ESI-模式下有更好的響應(yīng)。

2.2 流動相的選擇

本文選用常見的甲醇和乙腈作為有機(jī)相,為提高待測物的離子化效率,同時改善峰形,通常在流動相中添加少量的揮發(fā)性酸、堿或鹽。本文考察了甲醇和0.1%(v/v)甲酸水溶液、乙腈和0.1%(v/v)甲酸水溶液、甲醇和0.1%(v/v)氨水水溶液、甲醇和0.1%(v/v)乙酸銨水溶液作為流動相,對3種藥物的色譜保留行為和離子化程度的影響。結(jié)果表明,在流動相中添加氨水或乙酸銨時,丙磺舒和苯溴馬隆響應(yīng)強(qiáng)度較好,但峰形展寬并拖尾嚴(yán)重,且別嘌醇響應(yīng)較低,不適合同時分離;而添加適量甲酸時,雖然丙磺舒和苯溴馬隆的響應(yīng)稍有降低,但別嘌醇響應(yīng)較高,可同時將3種藥物分離,且峰形對稱。此外,雖然使用乙腈作為有機(jī)相比使用甲醇時3種藥物的分離度和峰形更好,但丙磺舒、苯溴馬隆的響應(yīng)值較甲醇作為有機(jī)相時有所降低,綜合考慮3種藥物的特性,最終選擇甲醇和0.1%(v/v)甲酸水溶液作為流動相。圖1為丙磺舒、別嘌醇和苯溴馬隆標(biāo)準(zhǔn)品的總離子色譜圖,可見3種藥物分離效果良好,峰形對稱。

圖 1 丙磺舒、別嘌醇和苯溴馬隆標(biāo)準(zhǔn)品的總離子色譜圖Fig. 1 Total ion chromatograms of probenecid, allopurinol and benzbromarone

2.3 前處理條件的優(yōu)化

2.3.1提取液的選擇

別嘌醇、丙磺舒和苯溴馬隆3種藥物在水和很多常見有機(jī)溶劑中溶解性較差,加入酸或堿后溶解度增加[19]。為了提高3種藥物的提取效率,在樣品前處理提取過程中分別加入甲醇、乙腈、含0.1%(v/v)氨水的乙腈溶液、含0.1%(v/v)甲酸的乙腈溶液、含0.1%(v/v)氨水的甲醇溶液、含0.1%(v/v)甲酸的甲醇溶液進(jìn)行超聲提取,重復(fù)3次,考察6種提取液對3種藥物回收率的影響(見圖2)。結(jié)果顯示,單獨(dú)使用甲醇或乙腈作為提取液時,可能因為對藥物的溶解度較低導(dǎo)致3種藥物整體回收率偏低,且回收率隨著藥物濃度的增加而降低。當(dāng)提取液中添加了氨水或者甲酸時,3種藥物的回收率明顯提高,其中甲酸可有效提高苯溴馬隆的回收率,氨水可有效提高別嘌醇和丙磺舒的回收率。對比3種藥物的整體回收率,發(fā)現(xiàn)當(dāng)選擇含0.1%(v/v)氨水的乙腈溶液作為提取液時,別嘌醇、丙磺舒和苯溴馬隆的添加回收率分別為97.7%、103.0%和89.5%,符合GB/T 27404-2008標(biāo)準(zhǔn)對回收率范圍的要求。

圖 2 提取液對膠囊樣品中3種藥物回收率的影響Fig. 2 Effect of extraction solvents on the recoveries of the three drugs in capsule samples

2.3.2凈化方法的優(yōu)化

QuEChERS方法常用的吸附劑主要有PSA、GCB和C18等,吸附劑種類及含量是影響QuEChERS方法的重要因素[20]。PSA主要用于吸附樣品中的脂肪酸、有機(jī)酸、糖和酚類等,還可吸附部分極性色素；GCB主要用于去除樣品中的色素等,對極性化合物的吸附作用較強(qiáng),特別是對含有芳香環(huán)及對稱性結(jié)構(gòu)的化合物；而C18對去除樣品中的蛋白質(zhì)和脂類成分有較好的效果[21,22]。因此,在樣品前處理凈化過程中,分別加入不同種類和含量的吸附劑,重復(fù)3次,考察吸附劑對回收率的影響(見圖3)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),PSA和C18的組合能夠滿足凈化需求,這可能與痛風(fēng)類保健食品主要以脂類和植物提取物為主有關(guān)。而當(dāng)加入GCB作為凈化劑時,發(fā)現(xiàn)樣品檢測圖譜中雜峰較少,但是3種藥物的回收率明顯降低,這可能與GCB粉末對3種藥物都有很強(qiáng)的吸附能力有關(guān)。在選擇劑量方面,發(fā)現(xiàn)隨著劑量的上升,基質(zhì)的抑制作用逐漸降低,回收率升高,但再增加吸附劑的含量,可能出現(xiàn)吸附作用，導(dǎo)致回收率逐漸降低。經(jīng)過篩選組合,發(fā)現(xiàn)選擇100 mg PSA和50 mg C18作為吸附劑時,別嘌醇、丙磺舒和苯溴馬隆的添加回收率分別為105.7%、98.9%和83.5%,符合GB/T 27404-2008標(biāo)準(zhǔn)對回收率范圍的要求。

圖 3 吸附劑對膠囊樣品中3種藥物回收率的影響Fig. 3 Effect of adsorbents on the recoveries of the three drugs in capsule samples PSA: primary secondary amine; GCB: graphitized carbon black.

2.4 基質(zhì)效應(yīng)的考察

基質(zhì)效應(yīng)會影響UPLC-MS/MS分析的準(zhǔn)確性。常用來評價基質(zhì)效應(yīng)的方法為基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線法,即基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線與溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率之比,比值越接近1,則基質(zhì)效應(yīng)越小,比值在0.80～1.20之間時則認(rèn)為基質(zhì)效應(yīng)可忽略不計[23]。在1.2.1節(jié)標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制過程中,用空白基質(zhì)溶液配制的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液與含0.1%(v/v)氨水的乙腈溶液配制的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行對比,考察3種藥物在膠囊類保健食品中的基質(zhì)效應(yīng)(見表2)。結(jié)果顯示,本方法的基質(zhì)效應(yīng)值在0.90～1.10之間,因此基質(zhì)效應(yīng)影響不大。

表 2 3種藥物的線性范圍、基質(zhì)效應(yīng)、回歸方程、相關(guān)系數(shù)(R2)、檢出限和定量限

y: peak area of quantitative ion pair;x: mass concentration, μg/L.

2.5 線性范圍、檢出限和定量限

為了進(jìn)一步消除基質(zhì)效應(yīng)的影響,采用空白樣品基質(zhì)溶液配制不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定,以各組分定量離子的峰面積對相應(yīng)組分的質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸計算,外標(biāo)法定量。分別以S/N≥3和S/N≥10時的濃度作為方法的檢出限和定量限。結(jié)果表明,3種藥物在相應(yīng)濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)均大于0.99;別嘌醇、丙磺舒和苯溴馬隆的檢出限分別為5、25和25 μg/kg,定量限分別為17、80和80 μg/kg(見表2)。與張秋炎等[15]采用HPLC-MS/MS測定保健食品中非法添加的9種尿酸調(diào)節(jié)類藥物的方法相比,可以發(fā)現(xiàn)本方法中別嘌醇、丙磺舒的檢出限更低,可能與采用QuEChERS降低了樣品的基質(zhì)效應(yīng)、提高了方法靈敏度有關(guān)。

2.6 回收率與精密度

在膠囊類抗痛風(fēng)保健食品中分別添加3種藥物的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液,按1.2.2節(jié)方法提取凈化后測定,每個水平平行測試6次,計算3種藥物的平均加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。結(jié)果表明,3種藥物的平均加標(biāo)回收率為76.8%～116.6%, RSD為2.7%～14.6%(見表3),均符合GB 27404-2008標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的回收率在60%～120%范圍內(nèi)、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差不超過15%的要求。說明本方法具有良好的準(zhǔn)確度和精密度。

表 3 保健食品中3種藥物的平均加標(biāo)回收率和精密度(n=6)

2.7 實際樣品的測定

采用本方法檢測了市售的68份抗痛風(fēng)類保健食品,其中1份樣品檢出別嘌醇(296 mg/kg),其余樣品均未檢出丙磺舒、別嘌醇和苯溴馬隆藥物。表明抗痛風(fēng)類保健食品中存在非法添加化學(xué)藥物的風(fēng)險。

3 結(jié)論

本實驗利用QuEChERS前處理技術(shù),建立了UPLC-MS/MS測定抗痛風(fēng)類保健食品中別嘌醇、丙磺舒和苯溴馬隆3種藥物的檢測方法。該法快速準(zhǔn)確,靈敏度高,應(yīng)用于實際樣品檢測的重復(fù)性良好,為抗痛風(fēng)類保健食品非法添加化學(xué)藥物的監(jiān)測工作提供了可靠的技術(shù)支持。