勵 炯, 孫 嵐, 金朦娜, 王紅青, 邱紅鈺

(杭州市食品藥品檢驗研究院, 浙江 杭州 310017)

非甾體類抗炎藥物(nonsteroidal anti-inflammatory drugs, NSAIDs)是一大類具有抗炎、止痛和解熱等療效的藥物總稱,其中有一類屬于非選擇性環(huán)氧化酶(cyclooxygenase, COX)抑制藥物,其作用機理是通過抑制COX的活性來抑制前列腺素的分泌,從而緩解肌肉和關節(jié)的局部疼痛、腫脹等癥狀[1,2]。非選擇性COX抑制藥物已被廣泛用于人和牲畜的疾病預防與治療[3],但對人體和牲畜也有諸多毒副作用,能引起腸胃道功能紊亂、過敏、再生障礙性貧血、凝血功能障礙、肝腎毒性、心血管疾病以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害等[4-6]。有研究[7]表明,長期使用非選擇性COX抑制藥物會引起大鼠的腎臟癌變和小鼠的肝臟癌變。歐盟、美國和日本[8]已針對部分非選擇性COX抑制藥物在動物源性食品中的最大殘留限量做了規(guī)定。

非選擇性COX抑制藥物是由不同化學結構組成的一類化合物,很多化合物化學性質完全不同,這就帶來一個同時檢測多種非選擇性COX抑制藥物的方法開發(fā)的難題,特別是樣品前處理(包括提取和凈化)[9]。目前,已報道的非選擇性COX抑制藥物的檢測方法主要有高效液相色譜法[10,11]、液相色譜-質譜聯(lián)用法[12-15]、氣相色譜-質譜聯(lián)用法[16,17]、毛細管電泳法[18]、生物傳感器法[19]等。液相色譜-質譜聯(lián)用法由于具有較高的靈敏度和選擇性,非常適合多種藥物殘留的檢測,已經(jīng)被廣泛應用于非選擇性COX抑制藥物的檢測[20,21],比如Gallo等[22]報道了利用串聯(lián)質譜法同時檢測人體血清中16種非選擇性COX抑制劑的方法;Dubreil-Chéneau等[13]和Gentili等[18]利用串聯(lián)質譜法分別開發(fā)了牛乳中12種和15種非選擇性COX抑制藥物殘留的檢測方法;Dowling等[23]利用高分辨質譜法檢測牛乳中8種非選擇性COX抑制藥物殘留。上述方法的前處理多用甲醇或乙腈進行提取,再經(jīng)液液萃取凈化或SPE固相萃取小柱凈化處理,缺點是在大批量檢測中耗時較長。本文采用分散固相萃取(dSPE)對奶粉中非選擇性COX抑制藥物進行凈化,并利用靈敏度高和抗干擾性強的超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法,對奶粉中7種非選擇性COX抑制藥物進行定性定量分析。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質譜聯(lián)用儀(包括Agilent 1290高效液相色譜儀和Agilent 6425串聯(lián)四極桿質譜儀,美國Agilent公司)、Milli-Q去離子水發(fā)生器(美國Millipore公司)、Sorvall ST 8R高速冷凍離心機(德國Thermo Fisher公司)、MS3旋渦混合器(德國IKA公司)。

標準品:水楊酸(批號100106-201605,質量分數(shù)99.7%)、布洛芬(批號100179-201406,質量分數(shù)99.5%)、雙氯芬酸鈉(批號100334-200302,質量分數(shù)100%)、吲哚美辛(批號100528-200904,質量分數(shù)99.9%)、吡羅昔康(批號100177-200603,質量分數(shù)99.8%)、萘普生(批號100198-201205,質量分數(shù)99.6%)、保泰松(批號100481- 200601,質量分數(shù)99.9%)購自中國食品藥品檢定研究院;鹽酸、抗壞血酸、氯化鈉、無水硫酸鎂(均為分析純)購自國藥集團化學試劑有限公司;乙腈、甲酸、乙酸乙酯(均為色譜純)購自德國Merck公司;十八烷基鍵合硅膠吸附劑(C18-N)和NH2-丙基乙二胺吸附劑(NH2-PSA)購自上海島津技邇公司。

1.2 標準溶液的配制

分別取7種非選擇性COX抑制藥物的標準品10 mg,用乙腈配制成1 000 mg/L的標準儲備溶液,于-20 ℃冰箱中保存,備用。

分別吸取適當體積的標準品儲備溶液,用乙腈稀釋成10 mg/L的混合標準中間溶液,于-4 ℃冰箱中保存,備用。

用乙腈稀釋混合標準中間溶液,配制成水楊酸、吲哚美辛、吡羅昔康和保泰松的線性范圍為5～200 μg/L,萘普生、雙氯芬酸鈉和布洛芬的線性范圍為10～200 μg/L的溶劑混合標準工作溶液,現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 質控樣品的配制

取2.0 g空白奶粉(檢測結果為陰性的奶粉),置于50 mL聚氟乙烯離心管中,加入一定量的混合標準中間溶液,使7種非選擇性COX抑制藥物在樣品中的質量濃度為50 μg/kg,即為質控樣品。

1.4 樣品前處理

提取:取2.0 g奶粉,置于50 mL聚氟乙烯離心管中,加入5 mL去離子水,渦旋振蕩2 min,使樣品充分溶解,加入2 mL 0.01 mol/L的抗壞血酸溶液(用1 mol/L鹽酸溶液調pH至2.5),渦旋振蕩30 s,依次加入10 mL乙腈-乙酸乙酯(1∶1, v/v)溶液、1 g醋酸銨和5 g無水硫酸鎂,渦旋振蕩1 min,超聲提取5 min,在4 ℃以5 000 r/min的速度離心5 min。取7 mL上清液移入新的50 mL聚氟乙烯離心管中,待凈化。

凈化:在待凈化的樣品溶液中加入凈化劑(含1 000 mg無水硫酸鈉、300 mg C18-N及100 mg NH2-PSA),旋渦混勻1 min, 以5 000 r/min的速度離心5 min。精密取5 mL上清液轉移至試管中,于40 ℃水浴下氮吹至近干。加入0.5 mL 0.1%(體積分數(shù),下同)甲酸水溶液-乙腈(1∶1, v/v),旋渦混勻1 min,溶解殘渣,用0.22 μm有機濾膜過濾,取濾液進行分析。

1.5 色譜和質譜條件

色譜柱:Waters CORTECS C18(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm);流動相:A相為0.1%甲酸水溶液,B相為0.1%甲酸乙腈。梯度洗脫程序:0～8.0 min, 90%A～45%A; 8.0～9.0 min, 45%A; 9.0～9.1 min, 45%A～90%A; 9.1～12.0 min, 90%A。柱溫:40 ℃;流速:0.4 mL/min,進樣量:1 μL。

離子源:電噴霧離子(ESI+和ESI-)源;多反應監(jiān)測(MRM)模式;干燥氣溫度:200 ℃;干燥氣流速:14 L/min;毛細管電壓:3.5 kV;毛細管出口電壓(fragmentor): 380 V;校準方法:質量軸自動調諧校正。MRM進行分段掃描:0～4.50 min,水楊酸;4.50～6.00 min,吡羅昔康;6.00～7.50 min,萘普生;7.50～8.85 min,吲哚美辛、雙氯芬酸鈉和布洛芬;8.85～12.00 min,保泰松。其他質譜參數(shù)詳見表1。

2 結果與討論

2.1 質譜和色譜條件的優(yōu)化

將7種非選擇性COX抑制藥物的標準品溶液(1 mg/L)直接進樣,分別在ESI+和ESI-兩種模式下進行一級質譜掃描,結果表明,水楊酸、萘普生、吲哚美辛、雙氯芬酸鈉、布洛芬在ESI-模式下的響應比較高,而吡羅昔康和保泰松兩種成分在ESI+模式下的靈敏度較高。得到7種化合物精確的母離子質荷比,優(yōu)化毛細管電壓。進一步對7種非選擇性COX抑制藥物的二級質譜參數(shù)進行優(yōu)化,選擇信號強度較大的2個碎片離子為特征子離子,其中相對豐度最強的為定量離子,其次為定性離子,以MRM模式進行掃描,詳細參數(shù)見表1。其中布洛芬的碎片離子只有一個,所以采用一個離子通道對奶粉中的布洛芬進行分析。

表 1 7種非選擇性COX抑制藥物的質譜參數(shù)

* Quantitative ion pair.

考察了7種非選擇性COX抑制藥物在3組不同流動相下的色譜行為:(1)A為0.1%甲酸水溶液,B為0.1%甲酸甲醇;(2)A為0.1%甲酸水溶液,B為0.1%甲酸乙腈;(3)A為0.1%甲酸水溶液(含5 mmol/L甲酸銨), B為0.1%甲酸乙腈。研究發(fā)現(xiàn),在流動相(1)條件下,7種非選擇性COX抑制藥物的分析時間過長,超過30 min,而且色譜峰峰形較差;在流動相(2)條件下,7種非選擇性COX抑制藥物的分析時間短,各組分色譜峰峰形較好,靈敏度滿足要求。本文考慮到7種非選擇性COX抑制藥物中除了吡羅昔康和保泰松,其余5種均為是ESI-模式檢測,因此在0.1%甲酸水溶液中加入5 mmol/L的甲酸銨(即流動相(3)),來提高負離子模式檢測的5種非選擇性COX抑制藥物的離子化程度,結果發(fā)現(xiàn)效果不明顯,而且會造成吡羅昔康和保泰松的色譜峰嚴重拖尾的現(xiàn)象,所以將0.1%甲酸水溶液和0.1%甲酸乙腈作為分析7種非選擇性COX抑制藥物的流動相體系。

復溶溶劑的比例也會影響殘渣中非選擇性COX抑制藥物的色譜行為和回收率,本文采用0.1%甲酸水溶液-乙腈作為復溶溶劑。對復溶溶劑中乙腈的體積分數(shù)(分別為10%、50%和90%)進行了考察,結果表明,當乙腈體積分數(shù)為10%時,殘渣中保泰松的溶解度較小,回收率較低;當乙腈體積分數(shù)為90%時,7種非選擇性COX抑制藥物的色譜峰會出現(xiàn)前傾和分叉峰;當乙腈體積分數(shù)為50%時,7種非選擇性COX抑制藥物的檢測靈敏度最高,色譜峰峰形較好,因此本文采用0.1%甲酸水-乙腈(1∶1, v/v)作為殘渣中7種非選擇性COX抑制藥物的復溶溶劑。7種非選擇性COX抑制藥物的MRM譜圖見圖1。

圖 1 7種非選擇性COX抑制藥物(20 μg/L)的MRM譜圖Fig. 1 MRM chromatograms of the seven non-selective COX inhibitors (20 μg/L)

2.2 提取方式的優(yōu)化

非選擇性COX抑制藥物常用的提取劑是甲醇和乙腈,除了其高效的提取效率之外,還具有凈化效果,可以去除樣品中的部分蛋白質。有文獻[21]報道用5%甲酸乙腈(酸化乙腈)提取牛乳中的非選擇性COX抑制藥物,提取效率較高,但是由于酸化乙腈僅僅對極性較強的化合物提取效果好,對于弱極性或者非極性化合物的提取效率一般。有文獻[8]采用乙腈-乙酸乙酯(1∶1, v/v)溶液提取牛乳中的非選擇性COX抑制藥物,因為乙酸乙酯能夠提高弱極性或者非極性化合物(包括保泰松、萘普生、吡羅昔康、布洛芬和吲哚美辛)提取效率。所以本文將乙腈-乙酸乙酯(1∶1, v/v)溶液作為奶粉中非選擇性COX抑制藥物的提取溶劑。有研究[16]發(fā)現(xiàn)保泰松在前處理過程中容易被氧化,回收率和重現(xiàn)性不高,需要在提取過程中加入一定量的抗壞血酸來防止保泰松的氧化。也有研究[21]表明,在提取過程中加入高濃度(0.1 mol/L)的抗壞血酸,會導致萘普生回收率降低,且并不能顯著提高保泰松的回收率,同時會污染質譜系統(tǒng)。所以本文將抗壞血酸的濃度降至0.01 mol/L,并用1 mol/L鹽酸溶液將pH調至2.5,結果表明,采用0.01 mol/L pH 2.5的抗壞血酸溶液-乙酸乙酯-乙腈(2∶5∶5, v/v/v)組成的提取溶劑提取質控樣品中7種非選擇性COX抑制藥物,保泰松的提取效率最高,而且不影響其他6種化合物的提取效率。提取溶劑的酸化處理(加入pH 2.5的抗壞血酸)能充分去除提取溶液中的蛋白質,還能增加非選擇性COX抑制藥物的pKa值,促進其質子化作用[8]。不同提取溶劑對奶粉中7種非選擇性COX抑制藥物的提取效率見圖2。

圖 2 不同提取溶劑對質控樣品中7種非選擇性COX 抑制藥物的提取效率Fig. 2 Extraction recoveries using different extraction solutions in quality-control samples Solvent 1∶ 5% (volume percentage) formic acid acetonitrile solution; solvent 2: acetonitrile-ethyl acetate (1∶1, v/v); solvent 3∶ 0.01 mol/L pH 2.5 ascorbic acid-acetonitrile-ethyl acetate (2∶5∶5, v/v/v).

2.3 凈化方式的優(yōu)化

有報道[13]將牛乳中的非選擇性COX抑制藥物經(jīng)甲醇提取后直接進樣,但是考慮到奶粉中高含量的脂類物質,會引起基質效應,影響檢測靈敏度,污染色譜和質譜系統(tǒng),所以有必要對提取溶液進行凈化處理。檢測奶制品中的非選擇性COX抑制藥物的凈化步驟一般采用兩種方式:液液萃取凈化和固相萃取小柱凈化(SPE)[18,23]。Peng等[8]用正己烷去除提取液中的脂類物質。而最常用的凈化方式是用SPE固相萃取小柱,已有的文獻[22]采用C18、親水親脂共平衡的大孔聚合物(HLB)、混合型陽離子交換樹脂(MCX)等填料的固相萃取小柱去除樣品中的脂類物質,但Dubreil-Chéneau等[13]用固相萃取小柱凈化后,發(fā)現(xiàn)結果重現(xiàn)性很差。

本文采用分散固相萃取對提取溶液進行凈化,采用無水硫酸鈉、C18-N及NH2-PSA 3種凈化劑,對其用量進行正交試驗優(yōu)化。無水硫酸鈉、C18-N及NH2-PSA用量分別作為因素A、B、C,每個因素取3個水平,按照L9(33)正交表試驗,比較質控樣品在各因素組合下的回收率和凈化效果,來選擇最佳配比組合(見表2)。結果表明,使用1 000 mg無水硫酸鈉、300 mg C18-N以及100 mg NH2-PSA組成的凈化劑可以獲得良好的凈化效果。

表 2 無水硫酸鈉、C18-N及NH2-PSA用量的正交試驗因素水平

表 3 7種非選擇性COX抑制藥物的線性范圍、線性方程、r2、檢出限和定量限

Y: peak area of quantitative ion;X: mass concentration, μg/L.

本文通過比較分散固相萃取、正己烷液液萃取和固相萃取(采用C18、HLB、MCX等3種填料)等3種凈化方式,發(fā)現(xiàn)質控樣品的凈化效率差別不大?？紤]到實驗的成本、效率和結果的重現(xiàn)性,最終選擇分散固相萃取作為檢測奶粉中7種非選擇性COX抑制藥物的凈化方式。

2.4 基質效應考察

樣品前處理過程中,除了目標化合物,還有其他同時提取出來的干擾成分,這些共流出組分會影響目標化合物的分離并干擾其離子化,引起檢測信號的減弱或增強,最終影響定量的準確性,這就是基質效應(ME)。一般用基質標準曲線的斜率與溶劑標準曲線的斜率之比作為ME,評價前處理的凈化效率。一般情況下,ME在85%～115%之間不存在明顯的基質效應。本文采用空白奶粉的提取溶液作為基質,分別精密加入適當體積的混合標準中間溶液,配制成水楊酸、吲哚美辛、吡羅昔康和保泰松的線性范圍為5～200 μg/L以及萘普生、雙氯芬酸鈉和布洛芬的線性范圍為10～200 μg/L的基質匹配標準工作液;溶劑混合標準工作溶液配制見1.2節(jié)。按1.5節(jié)儀器條件進行分析,得到基質標準曲線和溶劑標準曲線,結果ME為77.6%～87.1%,表明存在基質抑制效應,為消除或減弱基質效應干擾,本文采用相應空白基質溶液配制標準溶液繪制校正曲線。

2.5 線性關系、定量限及重復性

取2.4節(jié)中已配制的基質匹配標準工作液,分別進樣1 μL,以定量離子峰面積(Y)為縱坐標、標準品質量濃度(X, μg/L)為橫坐標進行線性回歸,得到線性方程、線性范圍和相關系數(shù)。結果表明,各組分在線性范圍內線性關系良好,相關系數(shù)(r2)均大于0.995 7。

取2.0 g空白樣品(檢測結果為陰性的奶粉),加入適當稀釋的混合標準中間溶液,按1.4節(jié)方法進行前處理,按1.5節(jié)方法進行分析。如表3所示,以定量離子對的信噪比(S/N)=3為檢出限(LOD)、S/N=10為定量限(LOQ),得到檢出限范圍為0.5～2 μg/g,定量限范圍為2～5 μg/g。

2.6 方法回收率與精密度

取2.0 g空白樣品(檢測結果為陰性的奶粉),添加低、中、高3個水平(詳見表4),每個水平有6份樣品,回收率和精密度試驗結果見表4。7種非選擇性COX抑制藥物的3個濃度水平的平均回收率為76.4%～89.8%,相對偏差為2.1%～7.9%。

表 4 奶粉中7種非選擇性COX抑制藥物的回收率與精密度試驗(n=6)

2.7 實際樣品檢測

用本方法完成了40批次奶粉(均來自2017年度杭州地區(qū)奶粉專項抽檢)的檢測,結果均未檢出7種非選擇性COX抑制藥物。

3 結語

本文建立了分散固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質譜測定奶粉中7種非選擇性COX抑制藥物殘留的方法,優(yōu)化了色譜、質譜、提取和凈化條件。與傳統(tǒng)固相萃取技術相比,該方法更加簡便、經(jīng)濟、高效,能夠滿足日常大批量奶粉檢測的需求。