宮瑞澤, 王燕華,, 祁玉麗,, 陳麗雪,, 李珊珊, 孫印石*

(1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所, 吉林 長春 130112; 2. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院, 吉林 長春 130118)

鹿茸(CerviCornuPantotrichum)是哺乳綱偶蹄目鹿科鹿屬動物梅花鹿或馬鹿雄鹿未骨化密生茸毛的幼角[1]。新鮮鹿茸富含血液,若不及時加工容易腐敗變質(zhì),因此鹿茸的產(chǎn)地初加工直接關(guān)系鹿茸的品質(zhì)和養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟效益。商品鹿茸通常按不同加工方式分為煮炸茸、凍干茸、排血茸和帶血茸;按不同切制部位分為蠟片、粉片、紗片和骨片。

鹿茸中富含多糖、蛋白質(zhì)、多肽、激素、生長因子、核苷等生物活性成分[2-7],鹿茸多糖是其中研究較多的活性成分,現(xiàn)代研究表明,鹿茸多糖具有抗氧化、抗肝損傷、減肥降脂、增強機體免疫力等功能[8-11]。鹿茸的不同加工方式會在一定程度上影響其化學(xué)成分和藥理作用[12,13]。

本課題組通過前期研究發(fā)現(xiàn),不同加工方式、不同部位及不同炮制方式對鹿茸中的粗蛋白、氨基酸、脂肪酸、硫酸軟骨素、礦質(zhì)元素、核苷、生物胺等成分均存在顯著影響[14-19]。目前,不同加工方式對鹿茸中水溶性多糖及單糖組成的影響未見報道。本研究用水提醇沉法提取鹿茸中的水溶性多糖,經(jīng)水解-衍生后以UPLC分析各單糖組成及含量。本文通過研究不同加工方式對鹿茸中水溶性多糖含量及單糖組成的影響,以期為鹿茸的加工利用及產(chǎn)品開發(fā)提供參考。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Acquity UPLC H-Class超高效液相色譜儀,配備二極管陣列檢測器(美國Waters公司); 721G紫外可見分光光度計(上海儀電分析儀器有限公司); DM-200冷凍干燥機(北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司); DTC-8超聲波清洗機(鼎泰(湖北)生化科技設(shè)備制造有限公司); VORTEX-BE渦旋機(海門市其林貝爾儀器制造有限公司); HH-4A數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州國華電器有限公司); DHG-9123A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實驗設(shè)備有限公司); SF-TDL-5A大功率離心機(上海菲恰爾分析儀器有限公司); FW135中草藥粉碎機(天津泰斯特儀器有限公司); WP-UP-WF-40微量分析型超純水機(四川沃特爾水處理設(shè)備有限公司); 0.22 μm針筒式濾膜(有機系)(天津津騰實驗設(shè)備有限公司)。

單糖對照品:D-甘露糖(批號:C25D8H51117)、D-氨基葡萄糖鹽酸鹽(批號:S27M7I15344)、D-核糖(批號:J03D7R26100)、D-葡萄糖醛酸(批號:K14J7S9017)、D-半乳糖醛酸(批號:S29J8I40844)、D-氨基半乳糖鹽酸鹽(批號:YS0918TA14)、D(+)-無水葡萄糖(批號:S08J6G1)和D-半乳糖(批號:Z22J9H64187)(純度均≥98%,上海源葉生物技術(shù)有限公司)。

1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP,分析純,上海源葉生物科技有限公司);三氟乙酸(色譜純,賽默飛世爾科技(中國)有限公司);乙腈、甲醇(色譜純,美國Sigma公司);石油醚、濃硫酸、苯酚、無水乙醇、鹽酸、氯仿和正丁醇(分析純,北京化工廠)。超純水(電阻率≥18.25 MΩ5cm)由實驗室超純水機制備。

鮮鹿茸購自吉林省長春市雙陽區(qū)鹿鄉(xiāng)鎮(zhèn),經(jīng)中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所李春義研究員鑒定為梅花鹿(CervusnipportTemminck)的茸角(二杠)。參考文獻方法[20],隨機選取3副鮮鹿茸進行煮炸與凍干的加工,3副鮮鹿茸進行排血與帶血的加工。將加工完的鹿茸按蠟片、粉片、紗片、骨片分為4個部位,粉碎,過篩(60目),置干燥器中備用。

1.2 鹿茸中水溶性多糖

1.2.1葡萄糖標準曲線的繪制

取適量無水葡萄糖，于105 ℃下烘至恒重,準確稱取10.0 mg,置于100 mL容量瓶中,加超純水溶解并定容至刻線。依次吸取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5和0.6 mL,置于試管中,加入1.0 mL超純水、2.5 mL濃硫酸和0.5 mL質(zhì)量分數(shù)為6%的苯酚水溶液,渦旋混勻,于室溫靜置30 min,在490 nm處測定吸光度。

1.2.2鹿茸水溶性多糖的提取與純化

準確稱取鹿茸樣品粉末1.0 g,每個樣品3份,加入5 mL石油醚,渦旋10 min,以8 000 r/min離心5 min,棄去上清液,殘渣重復(fù)脫脂2次,氮氣吹干溶劑。然后加入10.0 mL超純水,渦旋混勻,預(yù)浸12 h,于50 ℃超聲提取30 min,以8 000 r/min離心5 min,殘渣加入10.0 mL超純水重復(fù)提取1次,合并2次提取液。采用Sevag法除蛋白,加入5 mL氯仿-正丁醇(1∶1, v/v)溶液,渦旋10 min,以8 000 r/min離心5 min,沉淀蛋白質(zhì),重復(fù)上述操作,然后加入80.0 mL無水乙醇,于4 ℃冷藏過夜,以8 000 r/min離心10 min,棄去上清液,用無水乙醇洗滌沉淀2～3次,即得鹿茸水溶性多糖供試品。

1.2.3鹿茸水溶性多糖的測定

準確稱取1.2.2節(jié)下制備的鹿茸水溶性多糖供試品1.0 mg,加入10 mL超純水溶解,準確量取1 mL溶液,參照1.2.1節(jié)方法測定吸光度,計算不同加工方式的鹿茸中不同部位上水溶性多糖的含量。

1.3 鹿茸中水溶性多糖中的單糖組成

1.3.1對照品溶液的制備

精密稱取單糖對照品各5.0 mg,置于5 mL容量瓶中,加入適量超純水溶解并定容至刻度,配成質(zhì)量濃度為1 g/L的單糖混合對照品溶液;精密吸取1 mL混合對照品溶液,置于試管中,分別加入0.3 mol/L PMP溶液和0.3 mol/L NaOH溶液各0.5 mL,充分混勻,然后于70 ℃水浴反應(yīng)30 min,加入0.5 mL 0.3 mol/L HCl溶液。最后加入5 mL氯仿萃取,以8 000 r/min離心5 min,棄去下層溶液,重復(fù)多次以除去多余的PMP衍生化劑,上清液用0.22 μm有機系濾膜過濾,即得衍生處理的單糖混合對照品溶液。

1.3.2供試品溶液的制備

精密稱取按1.2.2節(jié)下制備的不同加工方式鹿茸水溶性多糖各2.0 mg,加入2 mol/L HCl甲醇溶液0.5 mL,然后充氮氣封管,于80 ℃水解16 h,水解后氮氣吹干。隨后加入2 mol/L三氟乙酸溶液0.5 mL,于120 ℃水解1 h,水解液轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿中,加入2 mL無水乙醇,于70 ℃蒸干以除盡三氟乙酸。向蒸發(fā)皿中加入1 mL超純水,溶解水解后的多糖樣品,然后分別加入0.3 mol/L PMP溶液和0.3 mol/L NaOH溶液各0.5 mL,其余操作與1.3.1節(jié)相同。

1.3.3色譜條件

色譜柱:Acquity UPLC?BEH C18柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm);柱溫:30 ℃;流動相:A為0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH=7), B為乙腈;流速:0.3 mL/min。梯度洗脫條件:0～4.8 min, 17.5%B; 4.8～10.0 min, 17.5%B～18.5%B。進樣量:2 μL;檢測波長254 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理及檢測方法的選擇

多糖的提純通常采用水提醇沉法,以水為提取溶劑將鹿茸中的多糖提取后,通過加入無水乙醇,并使其體積分數(shù)為70%～80%,從而沉淀鹿茸中的水溶性多糖。熱水煎煮法和超聲輔助提取法是目前提取多糖常采用的方法,宋佳等[21]通過提取率、單糖含量等比較熱水煎煮和超聲輔助提取鹿茸多糖的效率,結(jié)果表明,超聲輔助提取法提取鹿茸中的多糖具有操作簡單、提取率高、耗時短等優(yōu)點。因此本實驗選擇超聲輔助提取法提取鹿茸多糖,水提醇沉法純化鹿茸水溶性多糖。

采用苯酚-硫酸法對鹿茸多糖進行含量測定,多糖在濃硫酸的作用下脫水生成糠醛或羥甲基糠醛,然后與苯酚縮合形成橙紅色化合物,在490 nm條件下測定其吸光度。該方法具有操作簡單、靈敏度高、重復(fù)性好等優(yōu)點。組成鹿茸多糖的單糖組分無紫外吸收,通過PMP衍生使其帶上發(fā)色團,通過紫外檢測并定量。此外,本實驗首次采用UPLC對鹿茸多糖中的單糖組成進行分析,UPLC具有高分離度、高分離效率、高靈敏度的特點,大大提高了分離效果、縮短了分析時間。

2.2 單糖分析的方法學(xué)考察

2.2.1線性關(guān)系、檢出限與定量限

精密吸取衍生后單糖混合對照品溶液適量,用超純水進行梯度稀釋,得到系列衍生后單糖混合對照品溶液,按1.3.3節(jié)的色譜條件進樣,測定峰面積,每個質(zhì)量濃度平行進樣3次,以峰面積的平均值為縱坐標(Y),質(zhì)量濃度為橫坐標(X, mg/L),繪制標準曲線。將衍生后單糖混合對照品溶液用超純水逐級稀釋后,以信噪比(S/N)為3的溶液濃度作為檢出限(LOD),以S/N為10的濃度作為定量限(LOQ)。各單糖的回歸方程、線性范圍、LOD和LOQ見表1, 8種單糖在線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)(R2)均>0.99, LOD和LOQ分別為0.19～3.56 μg/L和0.62～10.69 μg/L,均能滿足實際樣品檢測需要。

表 1 8種單糖的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

Y: peak area;X: mass concentration, mg/L.

2.2.2精密度試驗

精密吸取衍生后單糖混合對照品溶液2 μL,按1.3.3節(jié)色譜條件進樣分析,連續(xù)進樣5次,測定峰面積,計算各單糖衍生物峰面積的RSD值。結(jié)果表明,8種單糖峰面積的RSD為1.33%～2.17%,均小于5%,表明儀器精密度良好。

2.2.3重復(fù)性試驗

精密稱取煮炸茸(粉片)樣品6份,每份2.0 mg,按1.3.2節(jié)制得供試品溶液,精密吸取6份供試品溶液各2 μL,按1.3.3節(jié)色譜條件依次進樣分析,測定峰面積,計算各單糖的含量。結(jié)果表明,8種單糖峰面積的RSD為1.33%～2.81%,表明本實驗重復(fù)性良好。

2.2.4穩(wěn)定性試驗

精密稱取煮炸茸(粉片)樣品2.0 mg,按1.3.2節(jié)制得供試品溶液,吸取供試品溶液2 μL,并分別在0、2、4、8、16和24 h后按1.3.3節(jié)色譜條件進樣分析,測定峰面積。結(jié)果表明,8種單糖峰面積的RSD為1.74%～2.73%,表明儀器在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.5加樣回收試驗

精密稱取9份已知鹿茸單糖含量的鹿茸樣品(煮炸茸粉片)粉末1.0 mg,按照其單糖含量的80%、100%和120%加入適量的單糖對照品,按1.3.2節(jié)方法制備供試品溶液,按1.3.3節(jié)色譜條件測定各單糖衍生物峰面積,并計算單糖含量、回收率及其RSD值。結(jié)果表明,8種單糖的平均加標回收率為98.47%～101.21%, RSD為1.34%～2.16%,表明方法準確度較高。

2.3 不同加工方式鹿茸中水溶性多糖含量

采用苯酚-硫酸法測定不同加工方式鹿茸中水溶性多糖的含量,建立葡萄糖濃度與吸光度之間的回歸方程。以葡萄糖濃度為橫坐標(X, mg/L)、吸光度為縱坐標(Y)繪制回歸曲線,得到線性回歸方程Y=0.011 8X+0.012,R2為0.997 9。

圖 1 煮炸茸與凍干茸中水溶性多糖的含量(n=3)Fig. 1 Water-soluble polysaccharide contents in antler velvet after boiled and freeze-dried processes (n=3) The same letter (a-e) indicated no significant difference (P>0.05), otherwise it denoted a significant difference (P<0.05).

煮炸茸和凍干茸水溶性多糖的含量見圖1,煮炸茸蠟片、粉片、紗片和骨片中水溶性多糖的含量分別為1.74、1.67、1.03和1.13 g/kg,凍干茸蠟片、粉片、紗片和骨片中水溶性多糖的含量分別為2.77、3.07、1.22和3.20 g/kg。煮炸茸蠟片、粉片、紗片、骨片中水溶性多糖的含量均顯著低于凍干茸的相應(yīng)部位(P<0.01)。低溫干燥較高溫?zé)峒庸じ妆Ａ趱r鹿茸中的水溶性多糖,傳統(tǒng)煮炸茸加工過程中的沸水煮炸和長時間的高溫烘烤易發(fā)生消耗鹿茸中糖類物質(zhì)的反應(yīng),如焦糖化反應(yīng)和美拉德反應(yīng)等。

煮炸茸蠟片、粉片水溶性多糖的含量顯著高于紗片、骨片(P<0.05),蠟片、粉片水溶性多糖的含量差異不顯著(P>0.05),紗片、骨片水溶性多糖的含量也無顯著性差異(P>0.05);凍干茸蠟片、粉片、骨片水溶性多糖的含量均顯著高于紗片(P<0.05),骨片、粉片水溶性多糖的含量無顯著性差異(P>0.05)。蠟片、粉片、紗片和骨片分別對應(yīng)發(fā)育程度不同的軟骨組織,發(fā)育程度不同的軟骨組織其生長分化速率不同,營養(yǎng)物質(zhì)水溶性多糖的含量必然也存在差異。

排血茸和帶血茸水溶性多糖的含量見圖2,排血茸蠟片、粉片、紗片、骨片中水溶性多糖的含量依次為1.55、1.78、0.96和0.77 g/kg,帶血茸蠟片、粉片、紗片、骨片中水溶性多糖含量依次為1.69、1.64、1.01和1.31 g/kg。

圖 2 排血茸與帶血茸中水溶性多糖的含量(n=3)Fig. 2 Water-soluble polysaccharide contents in antler velvet processed without and with blood (n=3) The same letter indicated no significant difference (P>0.05), otherwise it meant a significant difference (P<0.05).

帶血茸的蠟片和骨片中水溶性多糖的含量顯著高于排血茸(P<0.05);排血茸的粉片中水溶性多糖的含量顯著高于帶血茸(P<0.05);排血茸與帶血茸的紗片中水溶性多糖的含量無顯著性差異(P>0.05)。帶血茸加工過程中無血液排出,血液中也含有豐富的糖類物質(zhì),因此帶血茸蠟片、骨片中水溶性多糖的含量均顯著高于排血茸相應(yīng)部位;然而軟骨組織中富含血液中沒有的硫酸軟骨素等水溶性黏多糖,粉片軟骨組織較多,因此單位質(zhì)量的排血茸粉片較帶血茸粉片水溶性多糖含量高。

帶血茸蠟片、粉片中水溶性多糖的含量顯著高于骨片(P<0.05),骨片顯著高于紗片(P<0.05);排血茸4個部位中水溶性多糖的含量差異顯著(P<0.05),粉片、蠟片、紗片和骨片中水溶性多糖的含量依次遞減。不同發(fā)育程度的軟骨組織其生長分化速率、物質(zhì)代謝程度的不同仍是造成上述差別的主要原因。

2.4 不同加工方式鹿茸中單糖組成和含量

不同加工方式鹿茸中單糖種類均包括甘露糖、氨基葡萄糖、核糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、氨基半乳糖、葡萄糖和半乳糖8種(見圖3),其中以氨基葡萄糖、氨基半乳糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖和半乳糖為主,這與宋佳等[21]的報道基本一致。鹿茸是由軟骨組織發(fā)育而來,硫酸軟骨素是軟骨組織中特有的生物活性成分,氨基葡萄糖和氨基半乳糖是硫酸軟骨素中特有的單糖,因此其在鹿茸中含量較高。

圖 3 (a)混合對照品溶液和(b)鹿茸樣品(凍干茸紗片) 中8種單糖的色譜圖Fig. 3 Chromatograms of the eight monosaccharides in (a) a mixed standard solution and (b) a gauze slices of freeze-dried antler velvet

凍干茸與煮炸茸中單糖的含量見表2。同一部位煮炸茸中各單糖含量均顯著低于凍干茸(P<0.05),煮炸茸加工過程中的高溫加劇了焦糖化反應(yīng)和美拉德反應(yīng),消耗了一定量的糖產(chǎn)生非糖物質(zhì);煮炸茸與凍干茸不同部位之間表現(xiàn)出蠟片、粉片、紗片和骨片單糖含量依次遞減的規(guī)律,發(fā)育程度不同的軟骨組織其生長分化速率不同,其營養(yǎng)物質(zhì)糖的含量必然也存在差異。

表 2 不同加工方式的鹿茸中8種單糖的含量(x±SD, n=3)

帶血茸與排血茸中單糖含量見表2。帶血茸與排血茸相比,因加工過程中保留了茸體中的血液,血液中富含糖、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì),所以相同部位帶血茸中單糖含量顯著高于排血茸(P<0.05);對氨基葡萄糖和氨基半乳糖而言,因其是軟骨組織中特有成分硫酸軟骨素的單糖組成成分,血液中不含有上述成分,所以單位質(zhì)量排血茸中氨基葡萄糖和氨基半乳糖的含量顯著高于帶血茸中的含量(P<0.05);不同部位單糖含量表現(xiàn)出蠟片、粉片、紗片和骨片單糖含量依次遞減的規(guī)律,不同發(fā)育程度的軟骨組織生長分化速率、物質(zhì)代謝程度的不同仍是造成單糖含量差別的主要原因。

3 結(jié)論

本實驗采用苯酚-硫酸法和柱前衍生超高效液相色譜法分析了鹿茸中水溶性多糖和8種單糖,并應(yīng)用該方法對鹿茸樣品進行檢測。結(jié)果表明,不同加工方式對鹿茸中水溶性多糖及單糖含量影響較大,該方法的建立為鹿茸多糖的結(jié)構(gòu)組成、活性研究及產(chǎn)品開發(fā)提供了堅實的理論基礎(chǔ)。