朱銘立, 楊黎忠, 張衛(wèi)鋒, 蔡成元, 周向東

(1. 廣州市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)督所, 廣東 廣州 510308; 2. 珀金埃爾默企業(yè)管理(上海)有限公司, 上海 201203)

丙烯酰胺是一種白色晶體化學物質(zhì),其分子式為CH2CHCONH2,易溶于水、乙醇、醚及三氯甲烷等[1]。丙烯酰胺屬于2A類致癌物,已有大量的動物模型實驗表明,丙烯酰胺具有神經(jīng)、生殖生育和遺傳毒性[2]。2002年瑞典科學家[3]首次發(fā)現(xiàn)經(jīng)高溫加熱的含淀粉食物會產(chǎn)生丙烯酰胺,進一步研究表明,丙烯酰胺為食物加工過程中發(fā)生“美拉德反應(yīng)”時的副產(chǎn)物。2017年11月20日,歐盟[4]發(fā)布指令EU 2017/2158(已于2018年4月11日實施),制定了食品中的丙烯酰胺的基準水平和緩解措施,以減少食品中的丙烯酰胺的含量。在該指令中,規(guī)定了丙烯酰胺的基準水平:焙烤咖啡為400 μg/kg;速溶咖啡為850 μg/kg;咖啡替代產(chǎn)品為500～4 000 μg/kg。

目前,食品中丙烯酰胺的分析方法主要有氣相色譜(GC)法[5]、高效液相色譜(HPLC)法[6,7]、氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)法[8-10]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)法[11-16]等。前兩種方法受雜質(zhì)干擾大,靈敏度低,特異性差。而GC-MS法前處理需衍生化反應(yīng),操作步驟繁瑣,且耗時長,無法滿足大批量樣品的分析[8-10]。LC-MS/MS無需衍生化處理,操作簡便,且靈敏度高,近年來被廣泛應(yīng)用于丙烯酰胺的檢測[11-16]。

在食品安全檢測方法中常用的大氣壓質(zhì)譜離子源有電噴霧離子化技術(shù)和大氣壓化學電離技術(shù)。由于兩者離子化的方式不同,相對大氣壓化學電離(APCI)技術(shù)而言,電噴霧離子化(ESI)技術(shù)的基質(zhì)效應(yīng)影響更為顯著,導(dǎo)致方法的靈敏度降低,影響實驗方法的準確性[17,18]。目前LC-MS/MS法主要采用電噴霧離子化(ESI)技術(shù)對丙烯酰胺進行測定[11-16],鮮少有大氣壓化學電離技術(shù)應(yīng)用于丙烯酰胺的測定。國內(nèi)針對食品中丙烯酰胺的檢測方法為GB 5009.204-2014,該方法適用于熱加工(如煎、炙烤、焙烤等)食品中丙烯酰胺的測定,規(guī)定了液相色譜-大氣壓電噴霧-串聯(lián)質(zhì)譜法和氣相色譜-質(zhì)譜法用于測定食品中丙烯酰胺。該方法在前處理提取過程中采用水作為提取劑,而對于咖啡類樣品,水與咖啡粉末形成懸濁液體,難于通過離心獲得上清液,嚴重影響凈化步驟的進行。其次烘焙咖啡的基質(zhì)非常復(fù)雜,采用電噴霧離子化技術(shù)測定丙烯酰胺存在嚴重的基質(zhì)效應(yīng),很難對丙烯酰胺進行準確的定性定量檢測。

本文采用甲醇作為提取劑,避免了懸濁液的產(chǎn)生,然后通過HLB SPE小柱凈化,采用超高效液相色譜-大氣壓化學電離源-串聯(lián)質(zhì)譜(UHPLC-APCI-MS/MS)法進行測定,同位素內(nèi)標法定量,有效降低了基質(zhì)干擾,操作步驟簡單,為咖啡類產(chǎn)品中丙烯酰胺的檢測提供了更為簡便高效的方法。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

QSight220超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀(美國PerkinElmer公司), BP211D感量為0.01 mg的電子天平(德國Sartorius公司), N-EVAP氮吹儀(美國Organomation Associates公司), SI-T256旋渦混合器(美國Scientific Industries公司), Visiprep24TMDL固相萃取儀(美國Supelco公司), Milli-Q超純水機(美國Millipore公司), HLB SPE小柱(30 mg/1 mL,美國Waters公司)。

丙烯酰胺標準品(純度≥99%)、13C3-丙烯酰胺標準品(純度≥98%)、甲酸(色譜純)、甲醇(色譜純)和乙酸銨(色譜純)均購自美國Sigma-Aldrich公司;實驗用水由Milli-Q超純水機系統(tǒng)制得。實驗樣品購自當?shù)爻小?/p>

1.2 溶液配制

分別準確稱取適量丙烯酰胺和13C3-丙烯酰胺標準品,用超純水溶解并定容,配成質(zhì)量濃度為100 mg/L的標準儲備液,于3 ℃避光保存;移取適量標準儲備液,根據(jù)實驗需要用水逐級稀釋,并配制適當濃度的標準工作液,現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 樣品前處理

準確稱取0.50 g混勻的試樣,置于10 mL具塞塑料離心管中,加入25 μL 2 mg/L13C3-丙烯酰胺同位素內(nèi)標工作溶液,渦旋靜置2 min,再加入5 mL甲醇,渦旋混勻10 min,以10 000 r/min的速度離心5 min。取2 mL上清液過0.22 μm有機相微孔過濾頭至干凈的試管中,準確移取1 mL上述濾液于試管中(帶準確刻度的試管),加入約200 μL超純水,置于40 ℃下氮吹至約0.1 mL,用超純水準確定容至1 mL,待凈化。

采用2 mL甲醇和2 mL水活化HLB SPE小柱,將上述待凈化液轉(zhuǎn)移至HLB SPE小柱中,使其自然下滴進行樣品凈化,棄去前0.5 mL過柱的凈化液(避免活化柱子里剩余的水,導(dǎo)致樣品被稀釋),收集0.5 mL后段的凈化液,過0.22 μm有機相濾膜,供LC-MS/MS測定。

1.4 LC-MS/MS條件

1.4.1色譜條件

色譜柱:Perkinelmer Brownlee validated AQ C18色譜柱(100 mm×2.1 mm, 3.0 μm);柱溫:30 ℃;進樣量:10 μL;流動相:A相為含0.1%(體積分數(shù))甲酸的5 mmol/L乙酸銨水溶液,B相為甲醇;流速:0.4 mL/min;等度洗脫:A∶B=90∶10;分析時間為2 min。

1.4.2質(zhì)譜條件

質(zhì)譜離子源:APCI電離源;掃描方式:正離子掃描;監(jiān)測模式:多反應(yīng)監(jiān)測(MRM); APCI源電暈針電流:3 μA;反吹干燥氣流速:5 L/min;霧化氣流速:7.5 L/min;離子源溫度:200 ℃;熱表面誘導(dǎo)去溶劑(HSID)質(zhì)譜接口溫度:200 ℃。其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表 1 MRM掃描模式下丙烯酰胺和13C3-丙烯酰胺的質(zhì)譜參數(shù)

* Quantitative ion; RT: retention time; Q1: precursor ion; Q3: product ion; EV: entrance voltage; CE: collision energy.

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

丙烯酰胺為強極性化合物,在水中的溶解度為204 g/100 mL(25 ℃),而在甲醇中溶解度為155 g/100 mL[19]。本文選擇了水、甲醇作為提取溶劑進行比較,采用水提取的溶液顏色明顯深于采用甲醇提取的溶液。而且水與咖啡粉末形成懸濁液,難于通過離心獲得上清液,嚴重影響凈化步驟的進行。分別對所得提取液進行了凈化后上機試驗,結(jié)果表明,采用水提取時,在目標化合物峰附近存在雜質(zhì)峰,無法與目標化合物分離,嚴重干擾后面的色譜-質(zhì)譜檢測。而甲醇提取溶液無明顯雜質(zhì)干擾,因此最終選擇了甲醇作為提取溶劑。

2.2 凈化條件的優(yōu)化

烘焙咖啡制品的基質(zhì)較為復(fù)雜,含有色素、脂肪、蛋白質(zhì)以及糖類等化合物,導(dǎo)致在使用液相色譜-質(zhì)譜分析時,存在嚴重的干擾,需對提取液進行凈化處理。為了能夠達到凈化樣品、改善檢測效果的目的,美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)[14]發(fā)布的采用HPLC-MS/MS檢測咖啡中的丙烯酰胺方法和GB 5009.204-2014均使用Oasis HLB和Bond Elut-Accucat固相萃取柱聯(lián)用法對樣品進行凈化,但是聯(lián)用兩種固相萃取柱成本較高,并易使回收率降低。本研究采用HLB SPE小柱對提取樣品進行凈化處理,SPE小柱經(jīng)甲醇和水活化后,將待凈化液轉(zhuǎn)移至HLB SPE小柱,使其自然下滴。因活化HLB SPE小柱時,殘余水分殘留在HLB SPE小柱內(nèi),為避免樣品凈化液被殘余水分稀釋,棄去前段0.5 mL凈化液,收集后段凈化液。采用HLB SPE柱凈化,可去除脂肪和蛋白質(zhì)等雜質(zhì),防止色譜柱受到污染,確保實驗長期的穩(wěn)定性。

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

圖 1 在ESI源和APCI源下標準溶液和實際咖啡樣品中丙烯酰胺及13C3-丙烯酰胺的MRM色譜圖Fig. 1 MRM chromatograms of acrylamide and 13C3-acrylamide in standard solution and real coffee samples in ESI and atmospheric pressure chemical ionization (APCI) modes

丙烯酰胺通常采用電噴霧離子源(ESI)進行檢測分析[11-16],但在預(yù)實驗中發(fā)現(xiàn),咖啡樣品基質(zhì)在電噴霧離子源下檢測丙烯酰胺,產(chǎn)生嚴重的基質(zhì)效應(yīng),對實驗結(jié)果帶來很大影響。在液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)中,常見的大氣壓電離源有ESI源和APCI源。因離子化機理不同,較ESI源而言,APCI源的基質(zhì)效應(yīng)影響相對較小些[17,18]。本文采用1 μg/L丙烯酰胺標準溶液和實際樣品提取液(13C3-丙烯酰胺質(zhì)量濃度均為10 μg/L)在ESI和APCI兩種電離模式下進行比較,以13C3-丙烯酰胺的峰面積響應(yīng)值作為判斷依據(jù)。如圖1所示,在標準溶液中,ESI模式的靈敏度要優(yōu)于APCI模式;在實際樣品中,ESI模式下存在嚴重的基質(zhì)干擾,其靈敏度明顯低于APCI模式。從表2中可知,在ESI離子源下,實際樣品的基質(zhì)效應(yīng)為-99%,存在嚴重的基質(zhì)效應(yīng),從而導(dǎo)致目標化合物響應(yīng)值降低。而在APCI離子源下,樣品的基質(zhì)效應(yīng)為-20%,有較小的基質(zhì)效應(yīng),目標化合物獲得良好的響應(yīng)。因此相對ESI源而言,APCI源能大大降低咖啡的復(fù)雜基質(zhì)帶來的嚴重基質(zhì)效應(yīng)問題,在實際樣品檢測中,靈敏度要優(yōu)于ESI模式,更適合于咖啡中丙烯酰胺的檢測分析,因此最終選擇APCI模式用于咖啡中丙烯酰胺的測定。

2.4 線性范圍和檢出限

取丙烯酰胺質(zhì)量濃度為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、50.0和100.0 μg/L的系列標準溶液(同位素內(nèi)標13C3-丙烯酰胺質(zhì)量濃度為10 μg/L)進行測定,以丙烯酰胺與同位素內(nèi)標色譜峰峰面積比值為縱坐標y,以系列標準溶液的質(zhì)量濃度(μg/L)為橫坐標x,繪制丙烯酰胺的標準曲線,其線性方程為y=0.116 2x+0.012 89。在0.5～100 μg/L范圍內(nèi),丙烯酰胺的質(zhì)量濃度與對應(yīng)的峰面積比值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)r2為0.999。采用低濃度丙烯酰胺標準溶液,以超純水逐級稀釋并測定,分別以3倍和10倍信噪比在扣除基質(zhì)效應(yīng)的情況下確定方法的檢出限和定量限,本方法的檢出限為5 μg/kg,定量限為10 μg/kg。該方法檢測丙烯酰胺的線性范圍寬,靈敏度高,滿足咖啡類樣品中丙烯酰胺的日常的分析要求。

表 2 在ESI和APCI源下丙烯酰胺和13C3-丙烯酰胺在實際咖啡樣品中的基質(zhì)效應(yīng)

ME: calculation of peak area response ratio of13C3- acrylamide in real coffee sample and standard solution.

2.5 回收率和精密度試驗

取咖啡樣品,按照上述方法處理并測定,得到實際樣品中丙烯酰胺的含量為25.5 μg/kg。在上述樣品中添加丙烯酰胺標準溶液,3個加標水平為100、200和1 000 μg/kg,每個水平各添加6份樣品,并對樣品進行測定。如表3所示,丙烯酰胺的平均回收率為94.6%～115.0%,相對標準偏差(RSD)為2.8%～3.6%。該方法可獲得較滿意的回收率和精密度。

表 3 丙烯酰胺在咖啡樣品中的加標回收率及精密度(n=6)

2.6 實際樣品測定

采用本方法對市售12批次烘焙咖啡豆中丙烯酰胺的含量進行了分析。結(jié)果顯示,烘焙咖啡豆中均檢出丙烯酰胺,其含量均低于400 μg/kg,滿足歐盟發(fā)布的EU 2017/2158指令中規(guī)定烘焙咖啡豆中的丙烯酰胺的基準水平。

3 結(jié)論

本文建立了UHPLC-APCI-MS/MS測定食品中丙烯酰胺含量的方法。對比GB 5009.204-2014,本方法用甲醇提取,無需正己烷脫脂和HLB及Bond Elut-Accucat兩根固相萃取小柱凈化,簡化了前處理步驟,降低了檢測成本,同時利用APCI源測定咖啡類樣品中丙烯酰胺的含量,可大大降低咖啡的復(fù)雜基質(zhì)帶來的嚴重基質(zhì)效應(yīng)問題。本方法靈敏度高,回收率良好,重現(xiàn)性優(yōu)異,完全滿足咖啡中丙烯酰胺的日常檢測要求。