盧伊娜，王光寅，謝 紅，謝智勇

（上海珈葉實業(yè)有限公司，上海 201100）

痤瘡是毛囊皮脂腺單位的一種慢性炎癥性皮膚病，主要好發(fā)于青少年，但隨著現(xiàn)代生活方式和工作壓力的變化，也逐漸多發(fā)于其他年齡層?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認為，飲食、生活習(xí)慣、雄激素等誘導(dǎo)因素下，皮脂腺快速發(fā)育，皮脂合成及分泌增加，同時毛囊漏斗部角質(zhì)細胞過度角化，導(dǎo)致厭氧性的痤瘡丙酸桿菌大量繁殖，將皮脂中的甘油三酯分解成游離脂肪酸（FFA），而皮脂又在紫外線、污染物、金屬離子等的作用下氧化成丙二醛、角鯊烯過氧化物等，這些代謝產(chǎn)物可進一步刺激細胞分泌炎性介質(zhì)和細胞因子，導(dǎo)致炎癥及異常免疫狀態(tài)的發(fā)生，爆發(fā)粉刺、丘疹、膿皰、結(jié)節(jié)等多形性皮損[1-3]。因此，針對痤瘡發(fā)生的多個機理如抑菌、控油、抗炎、抗角化等進行干預(yù)，是治療痤瘡的有效手段。

臨床治療痤瘡主要是使用異維A酸、抗生素和抗雄激素類藥物，容易產(chǎn)生副作用及耐藥性。針對以粉刺、炎性丘疹為表現(xiàn)癥狀的尋常性痤瘡，越來越多的公司開始尋求天然來源的活性成分，添加入化妝品作為日常使用的護膚品，來預(yù)防和治療痤瘡造成的皮損[3]。

《本草綱目》有云：“以骨入骨，以髓補髓，以皮治皮。”以皮治皮就是以動物或者植物的皮經(jīng)過加工處理后作為藥物使用來治療皮膚相關(guān)疾病。本文前期篩選了30余種植物皮，發(fā)現(xiàn)倒捻子（Garcinia Mangostana）果皮、厚樸（Magnolia Officinalis）樹皮、石榴（Punica Granatum）果皮有抑菌、抗炎等效果。本研究將這3種提取物通過特定的工藝進行復(fù)配，制備成三皮素溶液，體外驗證其抗氧化及抑制痤瘡丙酸桿菌的功效，再分別對皮脂腺細胞上的皮脂合成及其相關(guān)基因的mRNA表達水平、巨噬細胞上的炎癥因子表達水平進行研究，來闡述三皮素對抗痤瘡的作用，為其在個人護理領(lǐng)域中的進一步開發(fā)和應(yīng)用提供依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 主要試劑與儀器

三皮素溶液（將倒捻子果皮、厚樸樹皮、石榴果皮提取物按照一定比例復(fù)配溶解于60%的雙丙甘醇而成），上海珈葉實業(yè)有限公司；卵磷脂、三氯化鐵（FeCl3）、鹽酸（HCl）、三氯乙酸（TCA）、2-硫代巴比妥酸（TBA）、抗壞血酸（Vc），國藥集團化學(xué)試劑有限公司；痤瘡丙酸桿菌（ATCC 11827）、梭菌增菌培養(yǎng)基，北京中科質(zhì)檢生物技術(shù)有限公司；人皮脂腺細胞（SZ95，貨號BNCC338262，來源于ATCC）、小鼠巨噬細胞（Raw 264.7，ATCC TIB-71），北納創(chuàng)聯(lián)（蘇州）有限公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、青霉素-鏈霉素（PS）、PureLink 總RNA提取試劑盒、TaqMan 引物、TaqManRNA-to-CTTM一步法試劑盒，美國Thermo Fisher公司；油紅O染液、多聚甲醛、噻唑藍（MTT），美國Sigma公司；白介素6（ IL6）、前列腺素E2（ PGE2）、一氧化氮（NO）檢測試劑盒，欣博盛生物科技有限公司。厭氧罐、厭氧產(chǎn)氣袋，日本三菱化學(xué)株式會社；倒置顯微鏡及DC3000拍照軟件，江南永新光學(xué)有限公司；MultiSkan FC酶標(biāo)儀、Qubit核酸定量儀，美國Thermo Fisher公司；ABI 7500型實時熒光定量PCR儀，上海獸醫(yī)研究所大儀器平臺。

1.2 實驗方法

1.2.1 體外脂質(zhì)過氧化測定

參照文獻[4]，將卵磷脂、FeCl3振蕩溶解于磷酸緩沖液（PBS）配制成終濃度分別為10 g/L、4 mmol/L的溶液，于96孔板中依次加入100 μL卵磷脂溶液、35 μL FeCl3溶液，再加入15 μL用PBS稀釋成不同質(zhì)量分數(shù)的三皮素、Vc或溶劑，混勻后于37 ℃反應(yīng)2 h，再加入100 μL配制好的TCA-TBA-HCl溶液，95 ℃水浴反應(yīng)30 min，在酶標(biāo)儀540 nm處檢測吸光值（A）。抑制率=（1-A三皮素/A溶劑）×100%。

1.2.2 細胞內(nèi)脂質(zhì)含量測定

細胞內(nèi)皮脂含量的測定采用油紅O法[5]。將用含10% FBS、1% PS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)至指數(shù)增長期的SZ95細胞以3×104/孔接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h后分別加入質(zhì)量分數(shù)為0.1%和0.3%的三皮素或溶劑，于37 ℃繼續(xù)孵育24 h。棄去DMEM培養(yǎng)基，加入200 μL 4%的多聚甲醛溶液，室溫固定30 min后，棄去多余溶液，再加入0.5%的油紅O溶液（異丙醇溶解），在室溫下染色15 min。棄掉多余染色液，PBS輕洗2次，鏡檢觀察后拍照，分析其脂質(zhì)含量及細胞形態(tài)。細胞活力用MTT法檢測[5，6]。

1.2.3 基因表達檢測

將SZ95細胞以2×106/孔接種于12孔板中培養(yǎng)24 h，之后加入質(zhì)量分數(shù)為0.1%的三皮素或溶劑繼續(xù)孵育24 h。利用PureLink?總RNA提取試劑盒提取細胞總RNA，測定核酸濃度及完整性，再以500 ng總RNA為模板，按照TaqMan?RNA-to-CT?一步法試劑盒所提供的方法，于ABI 7500型實時熒光定量PCR儀上檢測實時熒光值（CT）。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）作為內(nèi)參基因，根據(jù)相對定量法（2-ΔΔCT）分別計算靶標(biāo)基因腎上腺素受體（AR）、胰島素樣受體（IGF1R）、過氧化物酶體增殖物激活受體（PPARγ）、Toll樣受體2 （TLR2）的相對表達量[7,8]。-ΔΔCT=（CT靶標(biāo)基因-CTGAPDH）三皮素-（CT靶標(biāo)基因-CTGAPDH）溶劑。

1.2.4 體外痤瘡丙酸桿菌最低抑菌濃度（MIC）測定

參照文獻[9]，將活化好的痤瘡丙酸桿菌于酶標(biāo)儀620 nm處測定吸光值（A），計算其菌液濃度后，用梭菌增強培養(yǎng)基稀釋至1×106CFU/mL。于96孔板中依次加入20 μL用PBS稀釋成不同質(zhì)量分數(shù)的三皮素或溶劑、180 μL稀釋菌液，37 ℃恒溫厭氧培養(yǎng)48 h后，取出細菌培養(yǎng)板，室溫振蕩5 min，檢測吸光值（A），抑制率的計算公式同前所述。同時肉眼觀察培養(yǎng)基的澄清度，并取200 μL進行平板涂布，厭氧培養(yǎng)48 h后無菌生長的最低濃度即為MIC。

1.2.5 炎癥因子表達量檢測

參照文獻[10]，將用含10% FBS、1% PS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)至指數(shù)增長期的Raw 264.7細胞以5×104/孔接種于96孔板中培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)液后再加入180 μL用培養(yǎng)基稀釋成不同質(zhì)量分數(shù)的三皮素或溶劑，加入或不加入20 μL痤瘡丙酸桿菌（初始濃度為5×108CFU/mL，于85 ℃滅活30 min），于37 ℃繼續(xù)孵育24 h。下層細胞用MTT法檢測細胞活力[6,10]，上層培養(yǎng)液收集至96孔板中，按照ELISA試劑盒的說明書分別檢測NO、IL6和PGE2的表達量（C）[11]，抑制率=（1-C三皮素/C痤瘡丙酸桿菌）×100%。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

采用GraphPad Prism 5軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，采用配對t檢驗對數(shù)據(jù)進行顯著性分析。P＜0.05認定為差異顯著，以“*”標(biāo)記；P＜0.01認定為差異極其顯著，以“**”標(biāo)記。

表1 三皮素對脂質(zhì)過氧化的抑制作用Tab.1 Inhibitory action of GMP on lipid peroxidation

2 結(jié)果與討論

2.1 三皮素抑制脂質(zhì)過氧化

脂質(zhì)過氧化導(dǎo)致的脂質(zhì)成分改變參與了痤瘡的發(fā)生與發(fā)展[12]。高價金屬離子如Cu2+、Fe3+等可誘導(dǎo)卵磷脂發(fā)生過氧化反應(yīng)，生成丙二醛（MDA），TBA可與MDA反應(yīng)生成粉紅色絡(luò)合物，在532 nm處有最大光吸收，因此，采用TBA反應(yīng)可定量檢測脂質(zhì)過氧化發(fā)生率[4]。表1為三皮素對脂質(zhì)過氧化的抑制作用。由表1可知，F(xiàn)eCl3可使A值增加至1.108，促進了MDA的生成，而三皮素可劑量依賴性地抑制脂質(zhì)過氧化，在質(zhì)量分數(shù)為1%時，抑制率達到46.44% （**，與溶劑組相比），為同等濃度下Vc的0.5倍。

2.2 三皮素降低SZ95細胞內(nèi)脂質(zhì)含量

人皮脂腺細胞大量分泌脂質(zhì)是發(fā)生痤瘡的前提條件[1,2]。皮脂腺細胞的活性受受體的配體調(diào)節(jié)，例如AR、IGF1R、PPARs、神經(jīng)肽受體、TLRs等[2,12]。雄激素、IGF1、PPAR激動劑、胰島素等通過與其相應(yīng)受體結(jié)合，激活信號通路，誘導(dǎo)脂質(zhì)和類固醇的生成[12]。

圖1 三皮素對SZ95細胞形態(tài)及細胞內(nèi)脂質(zhì)含量的影響（100×）Fig.1 The effects of GMP on cell morphology and sebum content in SZ95 cells （100×）

三皮素處理SZ95細胞24 h后，未染色前（圖1a～c），0.3%的三皮素處理組使細胞形態(tài)變圓變小，且有部分細胞破碎，皮脂分泌至培養(yǎng)基中。油紅O染色后（圖1d～f），0.3%的三皮素處理組細胞內(nèi)脂滴較溶劑組少，且脂滴變大，表明細胞處于終端分化[13，14]；MTT結(jié)果顯示0.1%的三皮素處理組的細胞活力達到95.61%，細胞內(nèi)脂滴的形態(tài)也無明顯變化，但脂滴量明顯變少，說明三皮素可減少脂質(zhì)合成。

2.3 三皮素下調(diào)IGF1R和PPARγ的表達

脂質(zhì)合成受很多信號通路的調(diào)控[2]。通過研究三皮素對SZ95細胞上AR、IGF1R、PPARγ、TLR2的mRNA表達水平的影響發(fā)現(xiàn)，0.1%的三皮素處理組相比于溶劑組可使IGF1R和PPARγ的mRNA表達量下降至0.68和0.84（圖2），而AR和TLR2受體表達量太低未檢測出，說明三皮素可通過下調(diào)IGF1R和PPARγ的表達量來減少皮脂合成。

圖2 三皮素下調(diào)IGF1R和PPARγ的mRNA表達Fig.2 Th e mRNA expression levels of IGF1R and PPARγ down-regulated by GMP

2.4 三皮素抑制痤瘡丙酸桿菌生長

痤瘡丙酸桿菌是與痤瘡發(fā)生密切相關(guān)的細菌之一[15]。圖3的體外抑菌試驗結(jié)果表明，質(zhì)量分數(shù)為0.01%～1%的三皮素劑量依賴性地抑制痤瘡丙酸桿菌的生長，在三皮素質(zhì)量分數(shù)為0.03%時抑制率即達到95.84% （**，與溶劑組相比），肉眼觀察培養(yǎng)基為澄清，平板涂布培養(yǎng)后無菌生長，因此，三皮素對痤瘡丙酸桿菌的MIC為0.03%。

圖3 三皮素對痤瘡丙酸桿菌生長的抑制作用Fig.3 In hibitory action of GMP on the growth of Propionibacterium acnes

2.5 三皮素抑制炎癥因子表達

痤瘡丙酸桿菌在痤瘡的發(fā)病中主要作用是誘導(dǎo)機體免疫反應(yīng)和局部炎癥的發(fā)生，同時它也參與毛囊導(dǎo)管上皮的過度角化[16]。痤瘡丙酸桿菌可刺激細胞分泌多種炎性介質(zhì)和細胞因子，導(dǎo)致炎癥及異常免疫狀態(tài)的發(fā)生，從而加重皮膚炎癥及痤瘡類型[16,17]。

表2為痤瘡丙酸桿菌誘導(dǎo)的炎癥因子表達量的變化。由表2可知，痤瘡丙酸桿菌誘導(dǎo)Raw 264.7細胞后檢測炎癥因子的表達量發(fā)現(xiàn)，NO的表達量從0.06 μmol/L升至9.58 μmol/L （**，與未刺激組相比），IL6和PGE2的表達量也升高了13倍以上，說明痤瘡丙酸桿菌可誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生炎癥。

表2 痤瘡丙酸桿菌誘導(dǎo)炎癥因子的表達Tab.2 The expression of cytokines induced by Propionibacterium acnes

同時檢測三皮素對痤瘡丙酸桿菌誘導(dǎo)的Raw 264.7細胞炎癥因子表達的作用，MTT結(jié)果顯示0.1%三皮素處理組的細胞活力達到91.55%；炎癥因子抑制率的結(jié)果表明（圖4），質(zhì)量分數(shù)為0.003%～0.1%三皮素劑量依賴性地抑制了NO、IL6和PGE2的表達，其抑制率在0.1%時均達到90%以上（**，與痤瘡丙酸桿菌組相比），顯示出良好的抗炎效果。

圖4 三皮素對痤瘡丙酸桿菌誘導(dǎo)炎癥因子的抑制作用Fig.4 In hibitory action of GMP on cytokines induced by Propionibacterium acnes

3 結(jié)論

1）三皮素可抑制脂質(zhì)過氧化，并通過下調(diào)IGF1R和PPARγ的mRNA表達量來減少皮脂腺細胞內(nèi)的皮脂合成。

2）三皮素抑制痤瘡丙酸桿菌生長，顯著降低痤瘡丙酸桿菌誘導(dǎo)的巨噬細胞NO、IL6和PGE2炎癥因子的表達量，來達到抗炎的效果。

3）作為一種來源于3種植物皮的復(fù)配型植物提取物，三皮素可添加入化妝品中，發(fā)揮其抗炎、抑菌、抑制脂質(zhì)合成的作用，來對抗尋常性痤瘡。