陳炯，馮巍，詹飛

河南科技大學 法醫(yī)學院，河南 洛陽 471023

在性犯罪案件中，從受害人處收集的檢材多是來自受害者和施暴者各種細胞和體液的混合物 (混合斑)[1-3]。此類案件中，精液或精斑作為重要的法醫(yī)物證檢材，通常伴隨受害者的生物樣本成分的存在。為了確認罪犯，法醫(yī)學者嘗試將混合物中的男性和女性細胞分離以獲取嫌疑人的DNA圖譜。根據(jù)細胞的形態(tài)、大小、比重及膜成分差異等，人們建立了從含有陰道上皮細胞的混合物中分離精子的多種方法，包括差異裂解法、濾膜法、激光捕獲顯微切割法和流式細胞分選法等[4-7]。差異裂解法是從陰道拭子中分離精子DNA的傳統(tǒng)方法。該方法利用精子和上皮細胞外膜特性的不同，將精子DNA與體細胞分離。此法的缺點是耗時長且自動化程度低[8]。激光捕獲顯微切割法實現(xiàn)了精子與上皮細胞的精準分離，但成本昂貴，難以普及[9-10]。此外，基于上皮細胞與精子沉降速率的差異，Horsman等研發(fā)了微流控芯片技術(shù)，實現(xiàn)了精子的快速分離，但該裝置工藝復(fù)雜，只適用于少數(shù)細胞類型的分離[11-12]。因此，建立一種簡便高效的精子分離方法仍是法醫(yī)學急需解決的難題。

近年來，利用針對精子特異性蛋白的抗體結(jié)合免疫磁珠 (IMB) 技術(shù)，為精子分離提供了一種可供選擇的方法。Li等[13]研究發(fā)現(xiàn)利用精子運動結(jié)構(gòu)域蛋白3 (MOSPD3) 抗體包被的磁珠可分離混合細胞中的精子，在精子濃度 ≥105/mL時，可獲得完整的男性DNA圖譜。Zhao等[14]用抗精子特異性透明質(zhì)酸酶 (PH-20) 抗體制備IMB，在混合物中精子/上皮細胞比例為103∶105時成功分離出精細胞。IMB法用于混合斑檢驗，依賴于與精子頭部抗原特異性結(jié)合的抗體，因此尋找合適的抗體成為必由之路。人載脂蛋白6 (Human lipocalin 6，hLCN6) 是新發(fā)現(xiàn)的載脂蛋白家族成員，它由附睪分泌且能與精子結(jié)合，與精子的成熟有關(guān)[15]。用RNA 干擾的方法將大鼠體內(nèi)載脂蛋白6 (rLcn6) 的表達抑制后，精子的活力降至原來的10%以下 (結(jié)果未發(fā)表)。雖然hLCN6與精子相互作用的分子機制尚不清楚，但根據(jù)其在精子上呈現(xiàn)的離散型斑點狀分布模式，人們推斷hLCN6極有可能是通過和精子表面特異性受體之間的相互作用而結(jié)合到精子上。hLCN6因其在附睪中的特異表達及所具有的生物功能在生殖醫(yī)學領(lǐng)域受到重視，而hLCN6能夠與精細胞結(jié)合的特性，使其作為特異性生物標記用于法醫(yī)學精細胞鑒定以及混合斑中精細胞的分離成為可能。本實驗室曾以原核表達純化的hLCN6蛋白為抗原，成功獲得了抗hLCN6單克隆抗體 (anti-hLCN6 mAb)[16]。在此基礎(chǔ)上，本研究進一步將抗體偶聯(lián)到IMB上，以期分離捕獲混合細胞中的精子，嘗試建立混合細胞體系內(nèi)精子分離的新方法。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

按照知情同意的原則，實驗用精液樣本及女性口腔上皮細胞樣本，分別由本實驗室10名健康成年男性和10名女性志愿者提供。蛋白酶K和二硫蘇糖醇 (DTT) 購自TaKaRa公司；QIAamp DNA微量提取試劑盒購自德國QIAGEN公司；AmpFlSTR Identifiler Plus PCR擴增試劑盒購自美國ABI公司；膜蛋白提取試劑盒購自美國Biovision公司；Sulfo-NHS-LC-Biotin、BCA蛋白定量試劑盒和增強型化學發(fā)光底物 (ECL) 購自Pierce公司；透析袋購自美國Viskase公司；Dynabeads FlowComp Flexi試劑盒與RNase-free DNase Ⅰ購自Thermo Fisher公司；鼠抗人β-肌動蛋白 (β-actin)mAb購自美國Cell Signaling公司；辣根過氧化物酶 (HRP) 標記山羊抗小鼠IgG和Dylight 488熒光標記羊抗鼠二抗購自武漢博士德公司；Prolong抗熒光衰減封片劑購自美國Life Technologies公司；其余各種化學試劑均購自Sigma-Aldrich公司。

Centrifuge 5810R型低溫冷凍高速離心機和Thermomixer comfort恒溫混勻儀購自Eppendorf公司；OmegaLum G型凝膠成像分析儀購自美國Aplegen公司；Sunrise型96孔酶標儀購自TECAN公司；3130XL遺傳分析儀購自美國ABI公司；MagneSphere磁分離架購自美國Promega公司。

1.2 抗hLCN6 mAb親和力的測定

利用間接ELISA法測定抗hLCN6 mAb的親和力，以1 μg/mL重組蛋白His-hLCN6包被酶標板，封閉后加入倍比稀釋的mAb，以HRP標記的山羊抗小鼠IgG為二抗，酶標儀讀取OD450吸光值。當連續(xù)幾個稀釋度的OD450讀數(shù)不再增大時視為抗原抗體100%結(jié)合，以抗體濃度 (mol/L) 為橫坐標，OD450吸光值為縱坐標做散點圖，生成對數(shù)趨勢線和公式。將OD450最大值的一半代入公式，求出此時的抗體濃度即為mAb的親和力解離常數(shù) (Kd)[17-18]。

1.3 精子與口腔上皮細胞混合懸液及混合斑的制備

精液在射精后30 min內(nèi)經(jīng)PBS洗滌3次去除精漿及其他成分，用細胞計數(shù)板計數(shù)確定單位體積內(nèi)精子數(shù)量，以PBS緩沖液倍數(shù)稀釋，分別配制成精子數(shù)為103/mL、104/mL、105/mL的3組懸液。取女性志愿者口腔拭子，用PBS緩沖液洗脫后，在顯微鏡下計數(shù)，制成104/mL的上皮細胞懸液。同時取每位志愿者血樣作為DNA分型對照樣本。

取1 mL上皮細胞懸液加入到l mL已制備的不同數(shù)目的精子懸液中混勻，8 000 r/min離心5 min后棄上清，制成含約104個上皮細胞、精子數(shù)分別為103、104、105個的混合懸液 (1 mL) 3組各10份備檢。同法配制上述混懸液各1 mL，8 000 r/min離心5 min后棄上清液，沉淀加50 μL PBS重懸后滴于紗布上模擬制作混合斑。

1.4 免疫印跡檢測

取精子 (105/mL) 和口腔上皮細胞 (104/mL)懸液各10份，用膜蛋白提取試劑盒提取精子細胞膜蛋白，BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度，每份樣品取等量 (80 μg) 進行SDS-PAGE，200 mA恒電流轉(zhuǎn)膜1 h。含5%脫脂奶粉的PBST溶液 (含0.05% Tween-20的PBS緩沖液) 37 ℃封閉1 h，加hLCN6 mAb (1∶ 2 0 000稀釋) 37 ℃孵育1 h，加HRP標記的羊抗鼠IgG (1∶5 000稀釋) 37 ℃孵育1 h，ECL顯色后進行成像分析。用β-actin作為內(nèi)參。

1.5 免疫熒光檢測

將冷凍保存的精子用PBS洗滌，2%多聚甲醛固定15 min后，將精子在含50 mmol/L甘氨酸的PBS中洗滌3次，沉淀重懸于PBS中，調(diào)至107/mL。取1滴細胞懸液做涂片，–20 ℃凍存。染色當天，將精子在PBS中再水化15 min，用含4%山羊血清的PBS封閉15 min。將精子與1∶500稀釋的抗hLCN6 mAb孵育1 h。經(jīng)PBS洗滌后加入1∶500稀釋的熒光標記二抗，室溫孵育60 min，洗滌后用抗熒光衰減封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。用免疫前小鼠IgG作為對照。在光鏡下(400×)，隨機選取6個視野，每個視野計數(shù)50個細胞中陽性細胞數(shù)，計算平均陽性率[19]。

1.6 IMB分離混合細胞中的精子

1.6.1 hLCN6抗體的生物素標記

向hLCN6 mAb (5 mg/mL) 中加入Sulfo-NHSLC-Biotin，按試劑盒說明書的操作步驟，4 ℃反應(yīng)72 h，將反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到透析袋中，加PBS緩沖液 (1 L) 4 ℃透析過夜。

1.6.2 精子細胞的捕獲與分離

向制備好的精子與上皮細胞混合液 (混合斑使用前用PBS洗脫細胞) 中加入2 μL生物素標記的抗體，置于恒溫混勻儀上，37 ℃、800 r/min孵育1 h，2 000 r/min離心8 min，棄上清后沉淀用500 μL PBS洗滌3遍。用100 μL PBS重懸細胞，并加入20 μL鏈酶親和素包被的磁珠，5 ℃、30 r/min孵育15 min。將抗體和IMB的懸液用磁分離架吸附5 min，吸棄上清后加入200 μL預(yù)冷PBS洗滌3次，取2 μL懸液涂片鏡檢；用磁分離架吸附5 min，吸棄上清后加入500 μL洗脫緩沖液洗脫并回收精子，后用DNaseⅠ處理樣品去除女性DNA (具體參照說明書)。

1.7 差異裂解法

按GA/T383 2002差異裂解法，提取1.3中制備的另一組混合懸液或混合斑，第一步消化后回收精子。

1.8 DNA提取、擴增及檢測

將志愿者血樣以及上述回收的精子按QIAamp DNA微量提取試劑盒操作步驟分別提取DNA，應(yīng)用Identifiler Plus試劑盒進行PCR復(fù)合擴增，PCR產(chǎn)物用3130XL遺傳分析儀進行電泳分離，電泳結(jié)果用GeneMapper ID v3.2軟件分析。

1.9 統(tǒng)計學分析

以志愿者血樣的DNA分型作為參考，計算IMB分離法及差異裂解法得到的單一男性分型個數(shù)，同時統(tǒng)計每個樣本正確分型的基因座數(shù)，以正確分型13個以上、基因座峰值在200相對熒光單位 (Relative fluorescence units, RFU) 以上為檢測成功。對兩種方法的結(jié)果采用SPSS 20統(tǒng)計學軟件進行χ2檢驗，P<0.05為具有統(tǒng)計學差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗hLCN6 mAb親和力的測定

利用間接ELISA 方法測定抗hLCN6 mAb的親和力，結(jié)果表明該抗體與抗原的親和力解離常數(shù) (Kd) 為3.47×10–9mol/L (圖1)。

2.2 hLCN6在精子及上皮細胞中的免疫印跡分析

采用Western blotting對不同個體的精子細胞進行檢測，各樣本均檢出hLCN6蛋白，分子量約為16 kDa，與蛋白已知分子量相一致。而口腔上皮細胞中無hLCN6蛋白的表達 (圖2)。

圖1 抗hLCN6 mAb親和力測定Fig.1 Affinity assay of anti-hLCN6 mAb.

圖2 Western blotting檢測hLCN6在精子及口腔上皮細胞的表達Fig.2 Western blotting analysis of hLCN6 expression in spermatozoa and buccal epithelial cells.1: buccal epithelial cells; 2: spermatozoa.

2.3 hLCN6的精細胞定位

用純化的抗hLCN6 mAb對精子進行免疫熒光染色，結(jié)果顯示，在精子頭部的頂體后區(qū)域出現(xiàn)明顯的熒光信號 (圖3)，證明hLCN6蛋白主要分布在精子頭部，這與之前文獻報道一致。與hLCN6蛋白結(jié)合的精子陽性率為(90±5)% (n=6)。而對照抗體染色的精細胞頭部為陰性。

2.4 Anti-hLCN6 IMBs捕獲精子情況

將生物素標記的抗hLCN6 mAb包被IMBs，與細胞混合懸液進行孵育，充分洗滌后將樣品制備成涂片進行顯微觀察。顯微鏡下見精子結(jié)構(gòu)完整，每個精子可結(jié)合多個磁珠，主要結(jié)合在精子頭部 (圖4)。鏡下未檢測到口腔上皮細胞。

圖3 抗hLCN6 mAb的免疫熒光染色分析Fig.3 Immunofluorescence analysis of anti-hLCN6 mAb staining in sperm cells.(A) Immunofluorescent staining of spermatozoa with anti-hLCN6 mAb.(B)Control immunofluorescent staining of spermatozoa with normal mouse IgG.(C, D) Sperm cells observed under a light microscope.

圖4 顯微鏡觀察anti-hLCN6 IMBs捕獲精子情況Fig.4 Optical microscopy image for intact (A) and tail-lost sperm cell (B) captured by anti-hLCN6 IMBs (400×).

2.5 IMB法和差異裂解法分離精子DNA分型檢測情況

圖5 混合細胞懸液中精子分離的STR分型檢測結(jié)果Fig.5 STR typing of spermatozoa isolated from mixed cell suspensions.Sperm cells were separated with common differential lysis (A) and anti-hLCN6 mAb IMBs-based method (B).Female epithelial cell and sperm concentrations were 104/mL and 103/mL, respectively.

為了檢測anti-hLCN6 IMBs分離精子的效率和靈敏度，制備了一系列不同比例的精子-上皮細胞混合懸液和混合斑，分別用IMB法和差異裂解法對樣品中的精子進行分離回收，提取精子DNA后進行PCR-STR分型檢驗，統(tǒng)計結(jié)果見表1。當混合細胞中精子數(shù)量為103/mL時，10份樣品中9份得到成功分型，成功率為90%，而差異裂解法分型成功率僅為40%，兩者具有顯著差異 (P<0.05，圖5，表1)。精子細胞數(shù)為104/mL和105/mL時，IMB法檢測的單一男性13個STR基因座的正確分型率均為100%，兩種檢測方法成功率無明顯差異 (P>0.05)。不同數(shù)量的精子 (103/mL、104/mL、105/mL)與上皮細胞混懸液制作的混合斑中，IMB法檢測的各組樣本13個STR基因座的單一男性正確分型率分別為40%、90%和100%，每組的10份樣品中分別有0、4、10份樣品獲得了單一男性16個STR基因座的正確分型 (表2)。對于相同精子數(shù)量的混合懸液及混合斑，IMB法的STR檢出率均高于差異裂解法 (表1、2)。

表1 不同精子數(shù)的細胞混懸液中精子DNA的STR基因座檢出數(shù)Table 1 Number of STR loci successfully amplified from cell mixture suspensions with different sperm cells number

表2 不同精子數(shù)的模擬混合斑中精子DNA的STR基因座檢出數(shù)Table 2 Number of STR loci successfully amplified from simulated mixed stains with different sperm cells number

3 討論

由精液和陰道分泌液組成的混合斑是性侵案件中最常見的生物學檢材，如何從男女混合成分中分離出單一男性成分并進行DNA分型，是法醫(yī)物證檢驗中急需解決的難題[20-21]。近年來，IMB技術(shù)憑借其快速、簡單、高效等特點，已被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學領(lǐng)域的研究，包括微生物的免疫檢測、腫瘤細胞分選以及生物大分子的分離純化等[22-23]。法醫(yī)學家也嘗試將該方法用于混合斑中精子的分離檢測并取得了良好的結(jié)果。Arthur等[24]用MHS-10、NUH-2、HS-21三種抗體分別與磁珠偶聯(lián)，實現(xiàn)了精子的特異性捕獲，其中MHS-10磁珠的捕獲率最高。Anslinger等[25]針對精子表面血管緊張素轉(zhuǎn)化酶 (tACE) 抗原篩選抗體制備免疫磁珠，其中4E3抗體捕獲效果最好，對含有106個精子的混合斑捕獲效率接近100%。張爾力等[26]選用一種人類精子膜抗原對應(yīng)的抗體——抗ADAM2制備免疫磁珠，對混合樣本進行分離。結(jié)果顯示在精子含量為103/mL時的分離成功率為70%。李學博等[27]利用精子特異性抗體SPAG8結(jié)合免疫磁珠技術(shù)分離混合細胞系中的精子，建立混合斑中精子細胞分離的新方法。本實驗結(jié)果表明，該法用于混合細胞懸液中精子的分離效果明顯好于混合斑。

已往的文獻報道均是選用精子自身抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合從而進行分離，本研究是利用附睪特異性分泌蛋白hLCN6與精子結(jié)合，再用抗hLCN6單克隆抗體與之結(jié)合進而分離。前期研究中，利用抗hLCN6多克隆抗體證實該蛋白在附睪組織表達并分泌后結(jié)合到精子上，可能與精子成熟有關(guān)。本研究采用制備的抗hLCN6 mAb進行Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)，精子細胞中存在hLCN6蛋白，而上皮細胞中hLCN6表達呈陰性。免疫熒光實驗顯示，hLCN6蛋白大量分布于精子細胞表面，且以精子頭部的頂體后區(qū)域濃度最高，這將有利于IMB的結(jié)合。顯微鏡下可見精子頭部與IMBs的結(jié)合，證明了抗hLCN6 mAb結(jié)合的有效性。

本實驗制備的anti-hLCN6 IMBs能夠?qū)⒕訌幕旌霞毎麘乙褐蟹蛛x出來，實驗顯示在精子數(shù)量為103/mL時的分型成功率達90%，明顯高于差異裂解法 (40%)。這可能是由于當精子含量較少時，差異裂解法兩步消化造成精子細胞損失所致。而當精子濃度≥104/mL時，所有樣品均可得到單一男性分型。

IMB法對模擬混合斑中精子DNA的檢驗結(jié)果顯示，精子數(shù)為103/mL、104/mL、105/mL的混合斑，各組樣本分型成功率以及16個STR位點檢出率均高于差異裂解法。在精子數(shù)相同情況下，模擬混合斑的分型成功率低于混懸液，這可能是由于混合斑中的精子在被干燥和從紗布上洗脫時，細胞發(fā)生破裂導致表面抗原數(shù)量減少[28]，影響了磁珠的結(jié)合效率所導致。鑒于一些上皮細胞可能在精子分離前被破壞，釋放的女性DNA附著在IMB-精子復(fù)合物表面導致出現(xiàn)混合圖譜(圖5)，因此我們在提取精子DNA前，將IMB-精子復(fù)合物與DNaseⅠ進行孵育以消除外源DNA的污染。

綜上，我們首次成功利用附睪特異性分泌的能與精子結(jié)合的蛋白進行了精子分離，建立了基于anti-hLCN6 IMBs的混合斑中精子分離的新方法。該方法簡單高效，其分型成功率高于傳統(tǒng)的差異裂解法，可解決目前精子分離中的特異性差和體細胞DNA污染等問題，不僅為性侵案件中法醫(yī)學鑒別并分離精細胞及后續(xù)的個體識別提供新方法，而且為依據(jù)抗原-抗體反應(yīng)分離混合斑中的精細胞開辟新途徑。此項技術(shù)可作為性侵案件中法醫(yī)混合斑檢驗的有效補充手段，對法醫(yī)物證檢案具有一定的實用價值。