孫琳，潘俊敏

清華大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，北京 100084

真核細胞鞭毛也被稱作纖毛，主要由長微管形成的軸絲和包裹在軸絲外的纖毛膜組成，是一種突出于細胞表面的保守細胞器[1-2]。真核細胞纖毛參與細胞運動、信號傳導(dǎo)等生理過程，并能夠調(diào)控細胞周期，影響細胞分化和發(fā)育。纖毛多種多樣的功能決定了其在人類生長發(fā)育過程中具有重要意義，纖毛結(jié)構(gòu)和功能缺陷會引發(fā)一系列發(fā)育異常和遺傳疾病。如今已經(jīng)鑒定到多種人類疾病是由纖毛相關(guān)基因缺陷導(dǎo)致，這類疾病在癥狀上有相似重疊且都是可遺傳的，因此統(tǒng)稱為“纖毛相關(guān)性疾病”[3-4]。

巴德-畢德氏綜合征 (Bardet-Biedl syndrome，簡稱BBS) 是一種能夠引發(fā)多種疾病癥狀的人類遺傳病，也是一種纖毛相關(guān)性疾病?；颊咧饕憩F(xiàn)有視網(wǎng)膜萎縮、肥胖、多指 (趾) 畸形、腎臟畸形、性腺發(fā)育不良及學(xué)習(xí)困難等[5]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)約19個基因可能導(dǎo)致該疾病，其中認為BBS1、BBS2、BBS4、BBS5、BBS7、BBS8、BBS9與BBIP1所編碼的BBS蛋白共同構(gòu)成巴德-畢德氏綜合征蛋白復(fù)合體BBSome[6-7]。BBSome基因在含有纖毛的真核細胞中高度保守，并多數(shù)定位于基體、中心體和纖毛，但由于缺陷體纖毛往往在形態(tài)上能夠保持完整，人們認為BBSome蛋白并非纖毛必要結(jié)構(gòu)蛋白[8-10]，但參與纖毛內(nèi)運輸、纖毛蛋白和纖毛膜蛋白質(zhì)的運輸過程[6,11-13]。BBS8也稱TTC8，是具有三角形四肽重復(fù)序列(Tetratricopeptide repeat，TPR) 的BBSome蛋白，在沙特阿拉伯和巴基斯坦的家族中首次報道了在BBS8中出現(xiàn)突變的巴德-畢德爾綜合癥患者[14]。線蟲中，BBS7和BBS8通過維持IFT-A和IFT-B復(fù)合物的結(jié)合控制纖毛內(nèi)運輸[15]。盡管已經(jīng)有這些進展，但是BBSome特別是BBS8在纖毛內(nèi)的作用機制仍不清楚，一種可以分離缺陷纖毛并進行生化分析的模型，將能為研究提供更多便利。

萊茵衣藻Chlamydomonas reinhardtii是一種真核單細胞藻類，有兩根等長鞭毛，具有單倍體、全基因測序、鞭毛易觀察及分離等優(yōu)勢，廣泛應(yīng)用于纖毛研究領(lǐng)域，纖毛內(nèi)運輸 (Intraflagellar transport，IFT) 就是在衣藻中首先被分離和鑒定的[16]。

本文利用衣藻作為模式生物，通過對BBS8基因缺陷突變體及其回補藻株的研究，確定BBS8蛋白在胞體與纖毛的精細定位，發(fā)現(xiàn)BBS8蛋白缺乏會導(dǎo)致纖毛膜蛋白異常積累，并影響纖毛功能和長度調(diào)控，為進一步研究巴德-畢德氏綜合征提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藻株、菌株及質(zhì)粒

野生型萊茵衣藻藻株21gr (mt+，cc1690)，購自美國衣藻中心；大腸桿菌菌株Match1，用于質(zhì)粒分子克隆，本實驗室保存；質(zhì)粒pJMG含有巴龍霉素抗性的APHVIII片段，用于衣藻突變體篩選，本實驗室保存；質(zhì)粒pJP-HA具有潮霉素抗性，用于在衣藻內(nèi)表達帶有HA標(biāo)簽的蛋白，本實驗室保存。

1.1.2 主要試劑

DNA限制性內(nèi)切酶購自NEB公司；Phanta高保真PCR聚合酶購自諾唯贊生物科技有限公司；免疫印跡ECL發(fā)光液購自康為世紀生物科技有限公司；蛋白濃度測定試劑購自Bio-Rad公司。

一抗：HA(Rat，1∶1000或1∶100)購自Roche公司；α-tubulin (Mouse，1∶3 000或1∶500)購自Sigma公司；IFT38 (Rabbit，1∶100)，本實驗室保存。二抗 (HRP標(biāo)記)：Goat anti-Rat IgG、Goat anti-Mouse IgG，稀釋比例均為1∶5 000，均購自柏奧易杰 (北京) 科技有限公司。熒光二抗：Alexa Fluor 488 goat anti-rat、Texas Red 594 goat anti-mouse、Texas Red 594 goat anti-rabbit，稀釋比例均為1∶200，均購自Life Technologies公司。

1.2 方法

1.2.1 突變體的篩選及鑒定

在連續(xù)光照條件下，利用TAP培養(yǎng)基培養(yǎng)衣藻濃度至4×106個細胞/mL，將250 μL濃縮細胞和約100 ng的APHVIII片段同時加入電擊杯中，冰上預(yù)冷后使用電擊儀電擊，使得DNA片段隨機插入衣藻基因組中。將電擊后的細胞避光過夜恢復(fù)，涂布在具有篩選抗性的平板上，光周期照射1周后挑取轉(zhuǎn)化子。

提取轉(zhuǎn)化成功的藻株的基因組，使用限制酶位點定向擴增 PCR技術(shù) (Restriction enzyme site-directed amplification PCR，RESDA-PCR) 克隆得到外緣片段插入位點位置，在衣藻基因組庫中對比測序結(jié)果，確定插入片段破壞的基因。

1.2.2 衣藻細胞顯微拍攝及鞭毛長度測量

衣藻細胞使用終濃度5%戊二醛固定，利用微分干涉相差顯微鏡 (Differential interference microscope，DIC) 和Slide軟件進行拍照，細胞形態(tài)觀察使用100×物鏡，鞭毛長度測量使用40×物鏡。將拍攝照片導(dǎo)出，利用ImageJ軟件線段測量功能量取并計算鞭毛長度，每個樣品至少測量50個細胞。

1.2.3 衣藻鞭毛的解聚與再生

誘導(dǎo)鞭毛解聚：將5×焦磷酸鈉 (NaPPi) 母液加入衣藻生長狀態(tài)良好的培養(yǎng)基中，使其終濃度為20 mmol/L。酸刺激 (pH shock) 去鞭毛和再生：使用鹽酸迅速調(diào)節(jié)pH至4.0-4.5，30 s后加入KOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0左右，離心重懸衣藻細胞，等待鞭毛再生。兩項誘導(dǎo)實驗均在處理前和處理后的不同時間點取樣，戊二醛固定后拍照記錄鞭毛長度。

1.2.4 衣藻免疫熒光及熒光拍攝

衣藻細胞使用終濃度4%多聚甲醛固定，并使用0.5% NP-40溶液穿膜，細胞懸液在預(yù)先使用聚乙烯亞胺 (PEE) 處理的載玻片上靜置，可使細胞貼在載玻片上。將玻片浸入–20 ℃保存的甲醇中，取出后晾干，依次進行封閉、一抗及二抗 (避光)處理。最后，在載玻片上滴加防熒光淬滅封片劑(Fluromount G)，蓋上蓋玻片并用透明指甲油封片，徹底固化后在4 ℃冰箱存放。

1.2.5 衣藻鞭毛的分離提取

使用上述酸刺激法處理大量衣藻細胞，將處理后的細胞低速離心，取出含有鞭毛的上清液與蔗糖溶液混合，并在離心管底部加入高濃度蔗糖溶液后離心，將上層溶液再次高速離心得到純凈鞭毛蛋白沉淀，加入含蛋白酶抑制劑的溶液溶解，–80 ℃凍存待用，提取過程在–4 ℃條件下進行。

1.2.6 衣藻鞭毛組分的分離

將凍存的鞭毛樣品冰上解凍，測量樣品蛋白濃度后取出部分鞭毛進行組分分離實驗。將解凍后的樣品再利用液氮迅速冷凍、冰上充分解凍，反復(fù)4次，使鞭毛軸絲和膜之間的基質(zhì)充分溶出，離心后上清標(biāo)記為基質(zhì)組分，沉淀漂洗后加入含有0.5% NP-40的溶液，溶解鞭毛膜蛋白，離心后上清標(biāo)記為膜組分，沉淀漂洗后再溶解標(biāo)記為軸絲組分。將3部分樣品制備為蛋白免疫印跡樣品。

1.2.7 蛋白樣品銀染及質(zhì)譜鑒定

聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDS-PAGE) 完成后將凝膠剝離，用雙蒸水沖洗，乙醇-冰醋酸溶液固定，乙酸鈉致敏液致敏后水洗3次，將凝膠置于預(yù)冷的0.25%硝酸銀溶液中染色20 min，染色完畢水洗2次，使用預(yù)冷的2.5%碳酸鈉-0.04%福爾馬林溶液顯色，條帶清晰后終止顯色，凝膠保存于1%冰醋酸中。

銀染后拍照記錄凝膠的條帶帶形，將所需檢測樣品條帶的對應(yīng)位置凝膠切下，對照組和實驗組同時分別進行蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定，并利用phytozome網(wǎng)站(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)提供的萊茵衣藻5.5版本蛋白數(shù)據(jù)庫進行蛋白比對，蛋白鑒定工作委托清華大學(xué)生物醫(yī)學(xué)測試中心代為進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 篩選獲得BBS8基因衣藻突變體

通過電擊轉(zhuǎn)化法將外源DNA片段插入野生型衣藻21gr細胞基因組，抗性篩選后得到轉(zhuǎn)化藻株，測序確定APHVIII片段在基因組中的插入位點，在phytozome網(wǎng)站衣藻基因庫中對比插入位點對應(yīng)的基因。經(jīng)過大量轉(zhuǎn)化篩選，得到1株BBS8基因破壞的突變體，APHVIII片段正向插入在BBS8基因的第5個內(nèi)含子上，距離第6個外顯子6 bp，將此突變體命名為bbs8突變體，如圖1所示。

2.2 突變體鞭毛存在功能缺陷

觀察bbs8突變體與野生型21gr的形態(tài)差異，發(fā)現(xiàn)在液體培養(yǎng)基中bbs8突變體能夠活躍游動，對比野生型沒有異常。在微分相差干涉顯微鏡下，突變體的胞體形態(tài)和鞭毛長度與野生型細胞也無明顯差異 (圖2A)。

圖1 突變體插入位點及相關(guān)基因信息Fig.1 Insertion position in the genome of bbs8 mutant and the information of BBS8 gene.(A) Model pattern of BBS8 gene shows gene size, arrangement of exon and intron, and insert location of exogenous gene.(B) View of BBS8 protein size and domain.

衣藻具有避強光、趨弱光的生理特點，鞭毛蛋白異常時可能導(dǎo)致細胞的光敏功能喪失[17-18]，利用強光照射bbs8突變體，發(fā)現(xiàn)其在培養(yǎng)基中仍有活躍的自由運動，但感光極性運動特性消失，不再向背光側(cè)極性遷移 (圖2B)。

使用NaPPi處理衣藻細胞，會誘導(dǎo)鞭毛逐漸解聚直至消失。酸處理刺激衣藻細胞能使鞭毛從根部脫落，去除刺激后鞭毛會重新長出，用此兩種方法檢測bbs8突變體的鞭毛的解聚和組裝功能是否存在缺陷。bbs8突變體在解聚實驗中表現(xiàn)出顯著的鞭毛解聚延遲，延遲體現(xiàn)于兩個方面：在野生型鞭毛完全解聚時突變體有4-6 μm的鞭毛；并且突變體鞭毛在5 h仍具有明顯鞭毛，不能完全解聚 (圖2C)。鞭毛再生實驗中，bbs8突變體鞭毛組裝速率和最終長度和野生型并無明顯差異(數(shù)據(jù)未列出)，鞭毛再生過程不受影響。鞭毛的組裝和解聚實驗說明，bbs8突變體鞭毛解聚受到明顯的阻礙，存在鞭毛功能異常。

圖2 bbs8突變體和回補藻株的鞭毛性狀Fig.2 The phenotype of bbs8 mutant and BBS-HA rescue.(A) DIC images of wild type cell (21gr) and bbs8 mutant, bar=5 μm.(B) Arrow indicates the direction of strong light stimulation, the grayscale is the distribution of the cells.(C) Curve graph of flagellar length during the period of disassembly.

2.3 BBS8基因回補能夠恢復(fù)突變體性狀

衣藻源BBS8基因共編碼561個氨基酸，翻譯后蛋白大小為61 kDa，與人源BBS8蛋白同源性高，并具有非常保守的8個TRP結(jié)構(gòu)域。從野生型衣藻細胞基因組中PCR克隆全長的BBS8基因(包含5?-UTR序列及其含有內(nèi)源啟動子的前1 684 bp序列)，終止密碼子替換為含有終止子的3×HA(Haemagglutinin)蛋白標(biāo)簽。將重組基因構(gòu)建于含有潮霉素的表達載體中，通過電轉(zhuǎn)法導(dǎo)入衣藻細胞基因組，篩選得到回補藻株，命名為bbs8::BBS8-HA。

利用免疫熒光印跡方法檢測回補藻株的蛋白表達情況。使用HA抗體檢測，發(fā)現(xiàn)回補藻株中有帶標(biāo)簽蛋白表達，蛋白大小略小于70 kDa，與BBS8-HA蛋白預(yù)測大小一致 (圖3)。

為進一步驗證bbs8突變體的性狀是由BBS8基因缺陷導(dǎo)致，對回補藻株進行光刺激、鞭毛組裝與解聚實驗，結(jié)果如圖2所示?；匮a藻株的強光避光性得到恢復(fù)，鞭毛解聚延遲性狀相比bbs8突變體也有明顯恢復(fù)，沒有完全恢復(fù)到野生型性狀可能是由于重組蛋白表達量較低，或標(biāo)簽位置對蛋白功能起到微弱影響。由此證明，BBS8基因突變是導(dǎo)致突變體性狀的直接原因，BBS8蛋白缺失會造成鞭毛功能缺陷。

2.4 BBS8蛋白是一個衣藻鞭毛蛋白

為了更直觀地判斷BBS8蛋白在衣藻鞭毛及胞體中的分布，通過免疫熒光(Immunofluorescence，IF)，在激光共聚焦顯微鏡(Laser scanning confocal microscopy)下，直接觀察蛋白在細胞中的定位。以野生型細胞為對照組，表達BBS8-HA蛋白的回補藻株為實驗組，并分別使用α-tubulin和IFT38兩種蛋白示意軸絲結(jié)構(gòu)和IFT-B復(fù)合物。可以看到BBS8-HA蛋白在鞭毛基體處有明顯的定位亮點，同時在整個鞭毛上呈現(xiàn)點狀分布，這種分布方式是典型的鞭毛蛋白的定位 (圖4A)。

觀察BBS8-HA蛋白與IFT38蛋白在基體位置的定位情況，發(fā)現(xiàn)兩種蛋白位置上具有高度重合，如圖4B所示，這種基體部位的共定位也符合進入鞭毛的IFT的貨物蛋白的特征。

2.5 bbs8突變體鞭毛存在蛋白異常積累

對突變體鞭毛進行進一步生化檢測，利用凍融和去垢劑穿透方法將鞭毛蛋白分為3個組分，分別對比其與野生型衣藻鞭毛的差異。為使3個不同組分在一次實驗中均有較為明顯的特征，以1 μg鞭毛所分離出的組分為標(biāo)準(zhǔn)一份 (1×)，按比例調(diào)整不同組分的上樣量進行凝膠電泳，并采用銀染方法染色 (圖5)。首先，對比無其他處理下的野生型鞭毛和bbs8突變體鞭毛發(fā)現(xiàn)，在軸絲和膜組分中，bbs8突變體與野生型相比有多條蛋白質(zhì)積累條帶，從中選取其中3個條帶進行質(zhì)譜鑒定。

圖3 回補藻株蛋白表達情況檢測Fig.3 Protein expression detection of rescued strain.

圖4 BBS蛋白在衣藻鞭毛和胞體的定位Fig.4 Location of BBS8 protein in the flagellum and cell body of chlamy.(A) bbs8::BBS8-HA cells labeled by anti-α-tubulin and anti-HA.BBS8-HA is located near the basal bodies and in dots along both f lagella.Bar=5 μm.(B)Double immunolabeling of bbs8::BBS8-HA cell with anti-HA and anti-IFT38.BBS8-HA and IFT38 look like to be co-located near the basal bodies.Bar=1 μm.

質(zhì)譜結(jié)果分析時，界定bbs8突變體特異肽段數(shù)(Unique piptides)大于等于5，且突變體與野生型的肽譜匹配(Peptide-spectrum match，PSM)比值大于等于2的蛋白是可信的條帶蛋白，并從中剔除明顯蛋白質(zhì)大小不符合凝膠所在位置預(yù)期的蛋白，分析結(jié)果分別見表1、表2和表3。利用NCBI和SMART蛋白分析網(wǎng)站分析這些蛋白的可能結(jié)構(gòu)及功能，發(fā)現(xiàn)表1對應(yīng)條帶1中的FAP102、FAP233、PDE27蛋白，表2對應(yīng)條帶2中的FAP102、Cre15.g640000蛋白及表3對應(yīng)條帶3中的FAP102、ACA1、Cre14.g613950、FAP233和Cre16.g681750蛋白，均為膜蛋白或含有明顯跨膜結(jié)構(gòu)域。其中ACA1為膜上鈣離子運輸ATPase，Cre16.g681750有鈣離子運輸ATPase功能域，兩種蛋白在人中都具有同源蛋白，其他積累蛋白中部分蛋白也具有人源蛋白同源結(jié)構(gòu)域，推測BBS8蛋白在人類細胞纖毛中可能執(zhí)行相似功能，有待進行后續(xù)研究。由于在組分分離過程中，凍融和所采用的NP-40去垢劑處理均屬于較為溫和的蛋白洗脫方式，且由于不同蛋白的結(jié)構(gòu)特性和溶解特性存在差異，實際膜蛋白在軸絲組分中被檢驗出是正常的。因此，銀染和質(zhì)譜實驗結(jié)果說明bbs8突變體會導(dǎo)致膜蛋白在鞭毛中的異常積累。

圖5 突變體鞭毛有蛋白積累缺陷Fig.5 Protein accumulation defects in the flagella of bbs8 mutant. Silver-stained 4%–15% precast polyacrylamide gel of axonemes (AXO), matrix, and membrane from standard f lagella (std.) and depolymerizing flagella (dep.) of wild type and bbs8.Depolymerizing flagella gotten from cells after NaPPi 1 h.

表1 鞭毛軸絲組分條帶1質(zhì)譜鑒定結(jié)果Table 1 Identification results of line 1 from AXO of flagella by mass spectrum

表2 鞭毛軸絲組分條帶2質(zhì)譜鑒定結(jié)果Table 2 Identification results of line 2 from AXO of flagella by mass spectrum

表3 鞭毛膜組分條帶3質(zhì)譜鑒定結(jié)果Table 3 Identification results of line 3 from membrane of flagella by mass spectrum

2.6 BBS8蛋白參與鞭毛膜蛋白的運輸

在鞭毛長度穩(wěn)定的情況下，鞭毛中存在著蛋白的動態(tài)穩(wěn)定調(diào)節(jié)，蛋白在鞭毛上的運入和運出是一個動態(tài)調(diào)節(jié)的過程[19]。bbs8突變體的鞭毛膜蛋白在鞭毛內(nèi)積累，說明這些積累蛋白的運輸機制受到了阻礙。NaPPi處理衣藻細胞后，鞭毛的結(jié)構(gòu)蛋白運輸回胞體，鞭毛逐漸解聚。在圖5中，對比NaPPi解聚1 h處理后提取的鞭毛，bbs8突變體在NaPPi處理后的對應(yīng)3個條帶位置也均有積累，且銀染染色強度大于解聚處理前鞭毛。解聚時加重的蛋白積累表明，這些蛋白的異常積累確實是運輸缺陷導(dǎo)致的。解聚時蛋白積累的缺陷導(dǎo)致了解聚的速率降低和進程延長，BBS8-HA蛋白的表達能夠回補bbs8突變體的解聚性狀，如圖2C所示。這些實驗證據(jù)說明，BBS8蛋白缺失是bbs8突變體鞭毛膜蛋白異常積累和功能缺陷的原因，并說明BBS8蛋白參與了鞭毛膜蛋白的運輸過程。

3 討論

通過DNA片段隨機插入基因組方式，篩選得到BBS8基因破壞的衣藻bbs8突變體，該突變體缺乏感光極性運動，在藥物誘導(dǎo)鞭毛解聚時表現(xiàn)出鞭毛解聚速率慢等性狀。實驗分析bbs8突變體的鞭毛生化特征，發(fā)現(xiàn)其鞭毛內(nèi)有多種膜蛋白異常積累，且在解聚時異常積累的膜蛋白量增加，說明膜蛋白積累是膜蛋白運輸缺陷導(dǎo)致，BBS8蛋白參與膜蛋白運輸。

纖毛膜相關(guān)蛋白由囊泡運輸?shù)姆绞酵瓿蓮母郀柣w到纖毛口袋處或細胞膜處的運輸，并通過膜融合的方式將膜蛋白錨定在前體纖毛膜上，在此與纖毛內(nèi)運輸IFT復(fù)合物結(jié)合，由馬達蛋白介導(dǎo)，在纖毛內(nèi)進行正向和反向運輸[20-21]。BBSome是纖毛內(nèi)運輸膜蛋白的重要復(fù)合物，是IFT復(fù)合物和纖毛膜蛋白鏈接的橋梁，但其鏈接方式和作用機制并不清楚。衣藻bbs8突變體的鞭毛膜蛋白在鞭毛內(nèi)有異常積累，卻沒有形成明顯的鞭毛基部膨大，可見這些膜蛋白并不堆積在鞭毛基部，說明在鞭毛內(nèi)仍能進行正向運輸，也可以排除鞭毛內(nèi)正常進行反向運輸后，無法回收回胞內(nèi)的情況。一種可能解釋思路是，這些膜蛋白以不需要由BBS8蛋白介導(dǎo)的運輸方式完成正向運輸，但在反向運輸時，需要BBS8蛋白介導(dǎo)，因此在bbs8突變體中，這些膜蛋白不能夠進行正常反向運輸，無法運回胞內(nèi)，從而在鞭毛內(nèi)異常積累。這種猜測可能說明膜蛋白的正向和反向運輸?shù)臋C制不同，或不全由BBSome介導(dǎo)，或BBsome構(gòu)象變化而使膜蛋白與其結(jié)合的方式不同。

本研究對BBS8基因突變的衣藻進行了初步分析，證明BBS8基因破壞會導(dǎo)致鞭毛內(nèi)膜蛋白運輸缺陷，從而影響鞭毛功能，為之后進一步探究BBSome復(fù)合物如何運輸纖毛膜蛋白提供了有效材料，并為巴德-畢德氏綜合征的病理分析提供理論依據(jù)。