王宏民，李赫，張?zhí)旌?，張仙紅

1 山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 經(jīng)濟(jì)管理學(xué)院，山西 太谷 030801

2 山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801

蟲生真菌在入侵寄主的過程中，通過分泌蛋白酶、幾丁質(zhì)酶和脂酶等多種水解酶來降解昆蟲體壁[1]，從而入侵寄主昆蟲。其中絲氨酸彈性凝乳蛋白酶Pr1是一類能高效降解昆蟲體壁蛋白的重要酶[2]。據(jù)報(bào)道，球孢白僵菌Pr1酶在球孢白僵菌侵入蟲體過程中起重要作用，且經(jīng)過基因改良可過量分泌蛋白酶和幾丁質(zhì)酶的白僵菌菌株其毒力顯著增強(qiáng)[3]；綠僵菌中也已發(fā)現(xiàn)有10種絲氨酸彈性凝乳蛋白酶 (Pr1A-Pr1K)，且將Pr1基因?qū)刖G僵菌中超量表達(dá)獲得的重組菌株其侵染力明顯提高[4]；玫煙色棒束孢Isaria fumosorosea表皮蛋白酶基因敲除型菌株對(duì)煙粉虱若蟲的致死率顯著低于對(duì)照[5]?？梢?，Pr1酶是蟲生真菌的一個(gè)重要的毒力因子。

玫煙色棒束孢是一種地理分布廣泛、昆蟲寄主多樣的蟲生真菌。早在1961年，有關(guān)學(xué)者就開始利用感染玫煙色棒束孢的棉鈴蟲進(jìn)一步感染黏蟲、斜紋夜蛾和銅綠金龜子的幼蟲[6]。用玫煙色棒束孢北京變種顯著降低了溫室黃瓜上的白粉虱的種群數(shù)量[7]。近年來，有關(guān)玫煙色棒束孢致病機(jī)理[8-11]、毒力基因克隆和表達(dá)[12]、致病相關(guān)基因的差異表達(dá)[13]等已陸續(xù)得到了研究。毒力基因高表達(dá)是提高昆蟲病原真菌毒力和進(jìn)一步擴(kuò)大真菌殺蟲劑應(yīng)用的有效手段[14]。那么不同毒力的菌株其Pr1蛋白酶基因的表達(dá)是否存在差異，這種差異與其毒力的相關(guān)性如何，目前還未見報(bào)道。本試驗(yàn)采用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)了毒力不同的玫煙色棒束孢菌株P(guān)r1酶基因的表達(dá)量，旨在探討玫煙色棒束孢Pr1酶活力、Pr1酶基因表達(dá)量與其毒力之間的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

玫煙色棒束孢Pf-9606、Pf-7606、Pf-904、Pf-941、Pf-14菌株保存于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)昆蟲實(shí)驗(yàn)室。

1.2 供試?yán)ハx

采集個(gè)體大小一致的無翅桃蚜，用新鮮離體的桃樹葉片 (葉柄用濕棉球包裹) 在 (25±1)℃、相對(duì)濕度 (75±5)%、12 L∶12 D光照條件下進(jìn)行飼養(yǎng)。

1.3 供試藥劑

Pr1 蛋白酶專一性短肽底物 Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA，購自Sigma公司。

試劑盒TransZol Up Plus RNA Kit、TransScript II One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix (AH311)、TransStart Tip Green qPCR SuperMix，購自北京全式金生物技術(shù)(TransGen Biotech) 有限公司。

考馬斯亮藍(lán)染色液：0.1 g/L考馬斯亮藍(lán)G-250，47 g/L乙醇，85 g/L磷酸。

冰醋酸、EDTA均為分析純。

1.4 毒力測(cè)定

對(duì)桃蚜的毒力測(cè)定采用坡塔噴霧法。取PDA培養(yǎng)基 (馬鈴薯200 g，葡萄糖200 g，瓊脂200 g，蒸餾水1 L) 上培養(yǎng)10 d的供試菌株的分生孢子，用無菌水配制成1×107孢子/mL的孢子懸浮液，每個(gè)培養(yǎng)皿中放入30頭桃蚜，用坡塔噴霧器進(jìn)行噴霧，每皿噴霧量設(shè)置為1 mL，沉降時(shí)間為40 s。每處理3次重復(fù)，用無菌水作對(duì)照。逐日定時(shí)觀察、記錄各個(gè)處理的桃蚜死亡情況，并將死亡蚜蟲尸體移出放入消毒的培養(yǎng)皿中，26 ℃保濕培養(yǎng)。采用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

1.5 Pr1蛋白酶活性測(cè)定

粗酶液的制備：將濕重7.5 g的菌絲接入100 mL基本鹽培養(yǎng)基 (NaCl 0.3 g/L，MgSO4·7H2O 0.3 g/L，K2HPO40.3 g/L) 中，于26 ℃、180 r/min的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，除去菌體得到粗酶液。

菌株P(guān)r1蛋白酶活性的測(cè)定參照Gille-spie等專一性短肽底物法[15]。將1.4 mL Tris-HCl緩沖液(0.1 mol/L，pH 8.0)、50 μL粗酶液和50 μL Pr1底物混勻，28 ℃、180 r/min搖床振蕩10 min，冰浴1 min后終止反應(yīng)，410 nm測(cè)定混合液的吸光率，用50 μL DMSO代替Pr1底物設(shè)為空白對(duì)照。每個(gè)菌株3次重復(fù)。酶活單位定義：以pH 8.0、28 ℃使反應(yīng)混合物每分鐘的OD410平均增加0.01的酶量為一個(gè)酶活單位，酶活以活力表示，計(jì)算比酶活 (單位：U/mg)。

數(shù)據(jù)處理：運(yùn)用SPSS軟件進(jìn)行一元線性回歸分析，將供試菌株的Pr1酶活力與致病力進(jìn)行相關(guān)性分析。

1.6 蛋白質(zhì)濃度測(cè)定

利用考馬斯亮藍(lán)法，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)定蛋白含量。

1.7 Pr1蛋白酶基因表達(dá)量測(cè)定

1) 按照TransZol Up Plus RNA Kit說明書提取供試菌株的總RNA；恒壓300 V，1.5% TAE瓊脂糖凝膠電泳5 min檢測(cè)RNA；取1 μL RNA樣品，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定提取的各樣品的總RNA濃度及OD260/OD280值。

2) 使用 TransScript II One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix (AH311)試劑盒，反轉(zhuǎn)錄玫煙色棒束孢的RNA樣品。反應(yīng)體系包含1 μg Total RNA、10 μL 2×TS II Reaction Mix、1 μL TransSctipt II RT/RI Enzyme Mix、0.5 μL Random Primer (0.1 μg/μL)、0.5 μL Anchored Oligo (dT)20 Primer (0.5 μg/μL) 和1 μL gDNA Remover及20 μL RNase-free Water。先將RNA模板、引物與RNase-free Water混勻，65 ℃孵育5 min后，冰浴2 min，然后再加入其他反應(yīng)組分，50 ℃孵育反轉(zhuǎn)錄15 min；85 ℃加熱5 min失活TransScript II RT/RI和gDNA Remover。

3) 熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)見表1：根據(jù)湯強(qiáng)提交的IfuPr1的cDNA序列 (GenBank登錄號(hào)FJ423001.1)[12]，用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)qPCR引物，以延長因子 (Elongation factor) 基因作為內(nèi)參基因。

表1 引物設(shè)計(jì)Table 1 Design of primer

4) 熒光定量反應(yīng)體系和條件：使用TransStart Tip Green qPCR SuperMix試劑盒，反轉(zhuǎn)錄玫煙色棒束孢的RNA樣品，反應(yīng)體系包含1 μL Template、0.4 μL Forward Primer (10 μmol/L)、0.4 μL Reverse Primer (10 μmol/L)、10 μL 2×TransStart Tip Green qPCR SuperMix、0.4 μL Passive Reference Dye (50×，optional)、20 μL ddH2O。

PCR 反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性 30 s，94 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，共40-45個(gè)循環(huán)。

5) 數(shù)據(jù)處理：當(dāng)目的基因與內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率相近時(shí)，采用2–△△CT法計(jì)算不同玫煙色棒束孢Pr1蛋白酶基因相對(duì)于對(duì)照組的表達(dá)量，不同菌株間差異顯著性用SPSS進(jìn)行單因素的新復(fù)極法數(shù)據(jù)分析。所有數(shù)據(jù)用±s表示。柱狀圖用軟件Excel繪制。

目的基因的相對(duì)表達(dá)水平=目的基因與內(nèi)參基因的倍數(shù)差異 (未知樣本) /目的基因與內(nèi)參基因的倍數(shù)差異 (對(duì)照樣本)。

Relative Quantity=2–△△CT。

6) Pr1酶活力、基因表達(dá)量與毒力的關(guān)系：運(yùn)用SPSS軟件進(jìn)行多元線性回歸分析，多重比較運(yùn)用了共線性分析法。將供試菌株的Pr1酶活力、蛋白酶Pr1基因表達(dá)量與致病力進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試菌株對(duì)桃蚜的毒力及Pr1酶活力

供試菌株對(duì)桃蚜的毒力及不同菌株的Pr1酶活力如表2所示。由表2可知，不同菌株對(duì)桃蚜的毒力及Pr1酶活力存在一定的差異。其中菌株P(guān)f 904毒力最高，對(duì)桃蚜的致病力達(dá)94.13%，致死中時(shí)最短為2.29 d，Pr1酶活力最高為0.085 7 U/mg；其次為Pf 7606菌株，其毒力和酶活均顯著低于Pf 904菌株，其他供試各菌株毒力的變化趨勢(shì)與Pr1酶活力變化基本一致。

2.2 Pr1蛋白酶基因表達(dá)量

由圖1可知，供試玫煙色棒束孢不同菌株P(guān)r1酶基因表達(dá)量存在一定差異。玫煙色棒束孢Pf 904和7606的基因表達(dá)量較高，且這兩菌株的毒力也最高，分別為對(duì)照的5.9倍和5.8倍；而玫煙色棒束孢14、9606、941的基因表達(dá)量較低，依次為對(duì)照的5.2、4.8、3.1倍，且其毒力也呈逐漸趨勢(shì)。

2.3 供試菌株的致病力、Pr1酶活力及表達(dá)量的相關(guān)性分析

2.3.1 供試菌株P(guān)r1酶活力與毒力的相關(guān)性

以Pr1酶活力為自變量，毒力為因變量，采用SPSS皮爾遜相關(guān)分析法，分析自變量與因變量的相關(guān)性及自變量對(duì)因變量的被貢獻(xiàn)程度。對(duì)供試5菌株的Pr1酶活力與致病力作散點(diǎn)圖，經(jīng)線性趨勢(shì)擬合，得到不同菌株的Pr1酶活力與致病力的線性回歸分析方程：y=3.64x+0.62，R2=0.432，相關(guān)系數(shù)達(dá)到了極顯著水平 (圖2)。由此可知，Pr1酶活力與供試菌株的致病力呈正相關(guān)，菌株的Pr1蛋白酶活性越高，致病力越強(qiáng)。

表2 供試菌株對(duì)桃蚜毒力及Pr1酶活力Table 2 Virulence and Pr1 protease activity of tested strains

圖1 各菌株P(guān)r1基因相對(duì)表達(dá)量Fig.1 Pr1 gene relative expression of the strains.

圖2 玫煙色棒束孢及球孢白僵菌Pr1酶活力與菌株致病力的相關(guān)性Fig.2 The correlation between Pr1 protease activity and strain lethality of I.fumosorosea and B.bassiana.

2.3.2 供試菌株P(guān)r1酶活力、基因表達(dá)量與毒力的關(guān)系

以Pr1酶活力、Pr1基因表達(dá)量為自變量，毒力為因變量，采用SPSS共線性分析，分析了自變量與因變量的相關(guān)性與自變量之間的交互作用。結(jié)果表明，殘差符合正態(tài)分布 (圖3)，散落各點(diǎn)符合多元線性回歸方程 (圖4)，殘差排列散亂毫無規(guī)律，說明結(jié)果比較理想 (圖5)。

對(duì)供試菌株P(guān)r1酶活力、Pr1基因表達(dá)量與致病力進(jìn)行多元線性回歸分析，得到方程為y=0.236+10.833x1–0.039x2(x1=Pr1酶活力，x2=Pr1基因表達(dá)量)：調(diào)整R2=0.568，說明線性擬合方程能很好地反映原始數(shù)據(jù)；序列相關(guān)系數(shù)D-W為2.444，表明方程不存在序列相關(guān)，不是偽回歸方程；P(x1=0.367，x2=0.512)<0.05，表明Pr1酶活力、Pr1基因表達(dá)量對(duì)致病力有顯著影響；VIF=12.705，證明Pr1酶活力、Pr1基因表達(dá)量存在中度多重共線性。由此可知，Pr1蛋白酶基因表達(dá)量與Pr1酶活呈正相關(guān)，Pr1蛋白酶活力與菌株的致病力呈正相關(guān)，故Pr1蛋白酶活力、Pr1蛋白酶基因表達(dá)量均與菌株的致病力存在著一定程度的共線性。

圖3 殘差直方圖Fig.3 Histogram of residuals.

圖4 回歸標(biāo)準(zhǔn)化殘差的標(biāo)準(zhǔn)P-P圖Fig.4 Standardized regression residuals of the standard P-P figure.

圖5 殘差散點(diǎn)圖Fig.5 Residual scatterplot.

3 結(jié)論與討論

多數(shù)研究表明，昆蟲病原真菌分泌的蛋白酶活力與其毒力之間存在密切聯(lián)系[16]，如球孢白僵菌菌株的胞外蛋白酶產(chǎn)酶水平高低決定了其對(duì)紅脂大小蠹致病力的強(qiáng)弱，二者之間呈明顯的線性關(guān)系[17]；蟬擬青霉胞外蛋白酶活性與對(duì)蚜蟲的致病力的作用效率具有相關(guān)性[18]；白僵菌不同菌株的酶活力與其對(duì)害蟲的致病力關(guān)系為一次函數(shù)[19]；球孢白僵菌GXU-Bb及其分離子菌株GXU-Bb16、GXU-Bb10、GXU-Bb13和GXU-Bb05兩種類型的菌株產(chǎn)酶水平的高低差異與其對(duì)小菜蛾的致病力間有顯著或極顯著相關(guān)性[20]。本試驗(yàn)也表明，供試的玫煙色棒束孢Pr1酶活力與其毒力存在線性關(guān)系，且相關(guān)系數(shù)達(dá)到了極顯著的水平。可見進(jìn)行玫煙色棒束孢高毒力菌株的初步篩選時(shí)，Pr1酶活力可作為一個(gè)重要的參考指標(biāo)。但由于昆蟲病原真菌在侵染昆蟲體表時(shí)分泌一系列的體壁降解酶，而不同酶對(duì)不同體壁成分結(jié)構(gòu)的昆蟲發(fā)揮的作用可能不完全相同，因此，應(yīng)進(jìn)一步深入研究玫煙色棒束孢在侵染不同目昆蟲時(shí)其蛋白酶活力與其毒力的相關(guān)性。

據(jù)St Leger等報(bào)道，將Pr1基因?qū)刖G僵菌中超量表達(dá)獲得的重組菌株其侵染力明顯提高；增加綠僵菌Pr1基因的拷貝數(shù)使其超量表達(dá)蛋白酶Pr1，不僅極大地提高了綠僵菌的毒力，而且使其對(duì)寄主昆蟲的致死時(shí)間縮短了25%；通過基因工程手段促使綠僵菌超量表達(dá)降解表皮的蛋白酶PR1，可構(gòu)建高毒力殺蟲綠僵菌工程菌株[4]，可見毒力基因高表達(dá)是提高昆蟲病原真菌毒力和進(jìn)一步擴(kuò)大真菌殺蟲劑應(yīng)用的有效手段。本試驗(yàn)通過熒光定量PCR (qRT-PCR)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，玫煙色棒束孢不同菌株P(guān)r1蛋白酶基因的表達(dá)量與Pr1酶活呈正相關(guān)，且不同菌株P(guān)r1基因表達(dá)量差異與菌株本身的毒力大小一致，也與本研究生物測(cè)定的結(jié)果一致。可見，Pr1基因的表達(dá)量和Pr1蛋白酶的活力對(duì)玫煙色棒束孢菌株的篩選具有重要作用。

本研究采用熒光定量PCR方法，以EF延伸因子為內(nèi)參，建立了一種快速準(zhǔn)確檢測(cè)不同菌株P(guān)r1蛋白酶基因表達(dá)量的方法。該方法方便、高效，并具有良好的重復(fù)性，可用于玫煙色棒束不同菌株同一基因表達(dá)量的檢測(cè)，這為高效篩選性狀優(yōu)良菌株提供了有效的技術(shù)手段。