張學(xué)全 李賽 張漫 萬詩雨

摘 ?????要：以胱胺為引發(fā)劑，L-天冬氨酸4-芐酯內(nèi)酸酐（BLA-NCA）和L-苯丙氨酸內(nèi)酸酐（Phe-NCA）為單體通過開環(huán)聚合方法合成聚氨基酸共聚物（ASP（Z）），經(jīng)氫溴酸脫保護(hù)得到側(cè)鏈帶羧基的氧化還原敏感響應(yīng)的聚氨基酸共聚物（ASP-COOH），再將氧化還原敏感響應(yīng)的喜樹堿（CPT-SS-OH）小分子藥物鍵合到聚合物側(cè)鏈，得到雙重氧化還原敏感響應(yīng)的生物可降解兩親性聚合物，核磁共振氫譜（HNMR）和傅里葉紅外光譜（FTIR）結(jié)果表明成功的合成了目標(biāo)分子。通過兩親性高分子的自組裝形成膠束，動(dòng)態(tài)光散射（DLS）和掃描電子顯微鏡（SEM）對(duì)膠束的粒徑及分布、zeta電位和微觀形貌進(jìn)行表征。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩親性聚合物可形成球形結(jié)構(gòu)膠束，粒徑為（233.23±7.90）nm，zeta電位為（-21±1.10）mV。同時(shí)，膠束在生理?xiàng)l件下穩(wěn)定，在谷胱甘肽（GSH）存在條件下，雙重氧化還原敏感膠束結(jié)構(gòu)“崩解”。設(shè)計(jì)的雙重氧化還原敏感膠束可用于響應(yīng)腫瘤的微環(huán)境而實(shí)現(xiàn)快速藥物釋放。

關(guān) ?鍵 ?詞：雙重氧化還原敏感;氨基酸;聚合物膠束;谷胱甘肽

中圖分類號(hào)：TQ 317 ????????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：?A ??????文章編號(hào)：1671-0460（2019）11-2459-05

Preparation and Characterization of Biodegradable Polymer

With Dual-redox-response

ZHANG Xue-quan， LI Sai， ZHANG Man， WANG Shi-yu

（College of Chemical Engineering， Sichuan University， Sichuan Chengdu 610065， China）

Abstract： The polyamino acid copolymers （ASP（Z）） were synthesized by ring-opening polymerization with cysteamine as initiator， L-Aspartic acid 4-benzyl ester NCA （BLA-NCA） and L-Phenylalanine NCA （Phe-NCA） as monomers. After deprotection with hydrobromic acid， a redox-sensitive copolymer with carboxyl groups （ASP-COOH） was obtained， and then the redox-sensitive response camptothecin （CPT-SS-OH） was bonded to the polymer side chain to obtain a dual-redox-sensitive biodegradable amphiphilic polymer. The results of 1H NMR and FTIR showed that the target product was successfully synthesized. The micelles were formed by self-assembly of amphiphilic polymers， and the particle size and distribution， zeta potential and micromorphology of micelles were characterized by dynamic light scattering （DLS） and scanning electron microscopy （SEM）. The results showed that the amphiphilic polymer can form spherical structural micelles with a particle size of （233.23±7.90）nm and a zeta potential of （-21±1.10）mV. At the same time， the micelles are stable under physiological conditions， and the double redox-sensitive micelle structure "disintegrated" in the presence of glutathione （GSH）. Therefore， the dual-redox-sensitive micelles designed herein can be used to achieve rapid drug release under the tumor microenvironment.

Key words： Dual-redox-response; Amino acid; Polymer micelles; Glutathione

癌癥（cancer）是一種嚴(yán)重威脅全球人類健康疾病之一^[1]。目前用于癌癥治療的方法有手術(shù)、化療、放療、免疫治療、基因治療等^[2-4]。隨著對(duì)腫瘤的深入研究和發(fā)現(xiàn)，腫瘤區(qū)域的生理環(huán)境與正常組織相比有很大的不同，如腫瘤細(xì)胞的快速增殖和旺盛的代謝行為導(dǎo)致了高還原性環(huán)境^{[5， 6]}、低pH^{[7， 8]}、高度表達(dá)酶^{[9， 10]}等?；谀[瘤微環(huán)境設(shè)計(jì)的的納米藥物載體，不僅能解決純化療藥物帶來的全身毒性，還能實(shí)現(xiàn)對(duì)藥物的精確可控釋放。

聚氨基酸由于其優(yōu)良的生物可降解性和生物相容性，已被廣泛地用于藥物遞送系統(tǒng)^[11-13]。此外，聚氨基酸側(cè)鏈上豐富的活性官基團(tuán)，如天冬氨酸具有羧基基團(tuán)（-COOH）^[14-17]、賴氨酸具有氨基基團(tuán)（-NH2）^{[15， 18]}，這為聚氨基酸功能化改性提供了位點(diǎn)。

因此，基于腫瘤微環(huán)境，我們選用了人體中必需的兩種a-氨基酸作為聚合單體（L-苯丙氨酸、L-天冬氨酸4-芐酯），引入具有還原敏感性的二硫鍵，通過開環(huán)聚合制備出生物可降解的聚氨基酸，經(jīng)氫溴酸脫保護(hù)反應(yīng)，獲得了側(cè)鏈帶羧基（-COOH）官能團(tuán)的聚天冬氨酸，通過在側(cè)鏈上鍵合氧化還原敏感響應(yīng)的喜樹堿（CPT-SS-OH），構(gòu)建兩親性聚合物。采用透析法制備聚合物膠束在氧化還原敏感環(huán)境下聚合物中的二硫鍵可發(fā)生斷裂，膠束崩解，釋放化療藥物喜樹堿。

1 ?實(shí)驗(yàn)部分

1.1 ?試劑與儀器

胱胺二鹽酸鹽、L-天冬氨酸4-芐酯、喜樹堿購置于希恩思科技生化科技有限公司;L-苯丙氨酸購置于探索平臺(tái);二氯甲烷（CH2Cl2）、四氫呋喃（THF）、正己烷、二甲基亞砜、無水乙醚、三乙胺（TEA）、無水硫酸鎂等試劑均為分析純，購置于成都市科龍化工試劑廠;三光氣、氫溴酸（33%乙酸溶液）、4-二甲氨基吡啶（DMAP）購置于安耐吉化學(xué)有限公司;還原性谷胱甘肽（GSH）購置于阿達(dá)瑪斯試劑有限公司;透析袋購置于美國(guó)Spectrum公司;2-羥乙基二硫化物購置于Sigma-Aldrich。

Bruker 400MHz核磁共振波譜儀、傅里葉紅外光譜儀（FTIR）、動(dòng)態(tài)光散射儀（Malvern Zetasizer Nano ZS）、場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡（Hitachi S-4800，Japan）。

1.2 ?聚合物的合成

雙重氧化還原敏感響應(yīng)的生物可降解聚氨基酸的合成路線如圖1所示。

1.2.1 ?合成L-天冬氨酸4-芐酯內(nèi)酸酐（BLA-NCA）和L-苯丙氨酸內(nèi)酸酐（Phe-NCA）

準(zhǔn)確稱量12.5 g L-天冬氨酸4-芐酯于250 mL支口瓶?jī)?nèi)，抽真空和氮?dú)庵脫Q三次后，加入80 mL重蒸THF;準(zhǔn)確稱量21.6 g三光氣，并用重蒸THF溶解后于恒壓滴定漏斗中緩慢滴入。整個(gè)反應(yīng)體系于50℃下恒溫反應(yīng)，反應(yīng)3h后溶液變澄清，停止反應(yīng)。使用旋蒸系統(tǒng)除去大部分THF后，將其加入無水正己烷溶劑中，反復(fù)沉淀三次后，抽濾，將得到的濾餅于常溫真空干燥，即可得到白色粉末狀L-天冬氨酸4-芐酯NCA單體（BLA-NCA）。L-苯丙氨酸NCA（Phe-NCA）的合成方法過程如上所述。

1.2.2合成帶二硫鍵的聚苯丙氨酸和天冬氨酸共聚物ASP

稱量6 g胱胺二鹽酸鹽溶解于20 mL 超純水中，再逐滴加入2.132 g NaOH水溶液;室溫?cái)嚢璺磻?yīng)1 h，二氯甲烷萃取三次，無水硫酸鎂干燥，濃縮，真空干燥得到胱胺。稱取1.950 3 g Phe-NCA和2.542 3 g BLA-NCA單體置于圓底燒瓶中，氮?dú)夥諊录尤?00 mL重蒸CH₂Cl₂，攪拌分散均勻后，加入0.08 g胱胺，于35 ℃條件下攪拌反應(yīng)3 d后，旋蒸濃縮、乙醚沉淀、過濾并真空干燥后得到帶保護(hù)共聚物。稱取3 g該共聚物于圓底燒瓶中，三氟乙酸充分溶解后，分3次加入5 mL氫溴酸溶液，攪拌反應(yīng)3 h后，加入大量乙醚沉淀，過濾得到的沉淀使用去離子水溶解后，轉(zhuǎn)移至截留分子量為3?500透析袋中，于超純水中透析4?d，冷凍干燥即可得到白色產(chǎn)物即帶羧基的氨基酸共聚物ASP。

1.2.3 ?合成氧化還原敏感喜樹堿（CPT-SS-OH）

參照文獻(xiàn)^[19]的方法合成還原響應(yīng)性CPT，具體步驟如下所述：稱取CPT 2.0和0.8 g三光氣于支口瓶中，在氮?dú)夥諊?，加?50 mL無水二氯甲烷，磁力攪拌下使其分散均勻。稱取2.6 g DMAP，無水二氯甲烷將其溶解，置于恒壓滴定漏斗中，緩慢滴入支口瓶中，滴加完畢后，溶液變澄清，繼續(xù)攪拌30 min。隨后將10 g 2-羥乙基二硫化物溶于無水四氫呋喃中，并緩慢滴加到反應(yīng)瓶中，室溫下攪拌反應(yīng)24 h。反應(yīng)結(jié)束后，使用150 mL 0.1 M HCl溶液反復(fù)洗3次，然后依次使用飽和食鹽水和去離子水清洗一次。采用無水硫酸鎂將通過分液得到的有機(jī)層進(jìn)行干燥除水，過濾得到有機(jī)相，旋蒸濃縮，氯仿/甲醇（3：10/v：v）重結(jié)晶，常溫真空干燥即可得到CPT-SS-OH。

1.2.4 ?合成CPT-ASP

稱取0.5 g ASP和0.44 g CPT-SS-OH于圓底燒瓶中，氮?dú)獗Ｗo(hù)，加入25 mL DMSO使材料溶解，將0.34 g DCC和4‰ASP質(zhì)量的DMAP用DMSO溶解，再轉(zhuǎn)移至恒壓滴定漏斗中緩慢滴入到圓底燒瓶中，常溫反應(yīng)48 h。反應(yīng)結(jié)束后，選用截留分子量為3?500的透析袋透析2 d，冷凍干燥后得產(chǎn)物CPT-ASP。

1.3 ?雙重氧化還原敏感響應(yīng)的聚合物膠束制備

采用透析法制備雙重氧化還原敏感聚合物膠束，具體步驟如下：稱取7.5 mg CPT-ASP材料，使用300L色譜純DMSO溶解后，將該溶液逐滴滴入到劇烈攪拌的13 mL去離子水中，常溫?cái)嚢柽^夜，然后將該溶液轉(zhuǎn)移至截留分子量為2?000的透析袋中，去離子水進(jìn)行透析，每2 h更換一次水，直至溶劑透析完后后，將溶液從透析袋中轉(zhuǎn)移出來，定容至15 mL，超聲后，使用離心機(jī)進(jìn)行離心（3?500 r/min，5 min），收集上層溶液即可得到膠束溶液。

1.4 雙重氧化還原敏感響應(yīng)膠束的粒徑及形貌測(cè)試

使用動(dòng)態(tài)光散射儀對(duì)膠束粒徑及分布和zeta電位進(jìn)行測(cè)試。測(cè)試溫度為25℃，分散介質(zhì)為水，折射系數(shù)為1.33。采用掃描電鏡對(duì)膠束的微觀形貌進(jìn)行表征，樣品制備方法如下：將10L膠束溶液滴于硅片上，靜置，待水分自然揮干后用于形貌觀察。

1.5 ?雙重氧化還原敏感響應(yīng)膠束還原敏感性測(cè)試

常溫下，將膠束溶液分別在GSH濃度為0 mM、5和10 mM條件下孵育，孵育30 min 后，使用動(dòng)態(tài)光散射儀對(duì)膠束的粒徑及分布、zeta電位進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)使用掃描電鏡對(duì)膠束在GSH孵育前后進(jìn)行了微觀形貌觀測(cè)。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?雙重氧化還原敏感響應(yīng)的聚合物表征

首先，采用三光氣合成了兩種a-氨基酸內(nèi)酸酐（NCA）單體，再通過開環(huán)聚合和脫保護(hù)的方法獲得了策略帶官能團(tuán)的氨基酸共聚物，在側(cè)鏈化學(xué)鍵合氧化還原響應(yīng)的喜樹堿，構(gòu)建雙重氧化還原敏感響應(yīng)的兩親性高分子，具體合成步驟見圖1所示。

2.1.1 ?BLA-NCA和Phe-NCA單體結(jié)構(gòu)表征

通過FTIR表征BLA-NCA單體，結(jié)果如圖2B所示。在3?310和1?862?cm^-1處出現(xiàn)了N-H（-CO-NH-）的伸縮振動(dòng)和環(huán)酸酐中羰基的吸收峰，且在1?786和1?727?cm^-1附近出現(xiàn)了酰胺鍵的羰基特征吸收峰，說明成功的合成了BLA-NCA單體。在Phe-NCA的FTIR圖中（圖2A），同樣出現(xiàn)了形成內(nèi)酸酐上兩個(gè)特征羰基吸收峰（1?836.28和1?777.68?cm^-1）。特征峰的出現(xiàn)，可知兩種a-氨基酸均與三光氣發(fā)生了反應(yīng)，成功合成了對(duì)應(yīng)的NCA單體。

2.1.2 ?CPT-SS-OH和CPT-ASP的結(jié)構(gòu)表征

CPT-SS-OH的核磁氫譜圖結(jié)果如圖3所示，在d=4.38（a）和d=3.91（d）出現(xiàn)了酯鍵和羥基端相鄰的兩個(gè)亞甲基質(zhì)子峰;同時(shí)在d=2.75～3.06出現(xiàn)了與二硫鍵相鄰的四個(gè)氫質(zhì)子峰，d=1.02歸屬于喜樹堿上的甲基質(zhì)子峰，且質(zhì)子峰的積分比例與理論相符，說明成功合成了氧化還原敏感響應(yīng)的喜樹堿（CPT-SS-OH）。

雙重氧化還原敏感響應(yīng)的聚氨基酸共聚物和喜樹堿改性的共聚物的核磁氫譜結(jié)果如圖4所示。如圖4A所示，脫去鹽酸的胱胺引發(fā)BLA-NCA和Phe-NCA開環(huán)聚合后，在d=7.0～7.5之間，出現(xiàn)了芐氧羰基和苯丙氨酸上苯環(huán)的質(zhì)子峰，同時(shí)d=4.0～4.8歸屬于兩種氨基酸a碳原子上的質(zhì)子峰。當(dāng)經(jīng)過氫溴酸脫保護(hù)反應(yīng)后，d=7.0～7.5之間苯環(huán)的質(zhì)子峰的比例下降和d=5.02處質(zhì)子峰的消失，說明芐氧羰基的成功脫去（圖4B）。當(dāng)將CPT-SS-OH鍵合在聚氨基酸共聚物側(cè)鏈上后，位于d=7.0附近的苯環(huán)質(zhì)子峰比例增加，且CPT-SS-OH中與羥基相鄰的亞甲基質(zhì)子峰由于酯化反應(yīng)，移向了高場(chǎng)d=1.7。說明了喜樹堿改性的聚氨基酸共聚物成功合成。

2.2 ?雙重氧化還原敏感響應(yīng)的聚合物膠束粒徑及形貌表征

使用動(dòng)態(tài)光散射儀和掃描電鏡對(duì)制備的雙重氧化還原敏感響應(yīng)膠束的粒徑及分布、zeta電位和微觀形貌進(jìn)行了表征。如圖5所示，制備的膠束粒徑大小為（233.23±7.9）nm，電位為（-21±1.1）mV。同時(shí)從掃面電鏡的結(jié)果圖中可以看出，制備的膠束呈球形（如圖6所示），說明合成的兩親性聚合物可以在水中自組裝成納米結(jié)構(gòu)的膠束，且粒徑大小和表面的負(fù)電荷利于血液長(zhǎng)循環(huán)且通過EPR效應(yīng)到達(dá)腫瘤部位，實(shí)現(xiàn)藥物的高效遞送。

2.3 ?雙重氧化還原敏感響應(yīng)的聚合物膠束的還原敏感性表征

采用掃描電子顯微鏡和動(dòng)態(tài)光散射儀對(duì)雙重氧化還原敏感響應(yīng)的聚合物膠束粒徑和形貌進(jìn)行表征，結(jié)果如表1和圖6所示。

在GSH還原條件下，膠束粒徑都急劇增大，分散系數(shù)也同樣增大，zeta電位從負(fù)變?yōu)檎貏e是在10 mM GSH濃度下，zeta電位增加到（17.3±0.50）mV。此外，我們對(duì)10 mM GSH孵育后的膠束形貌進(jìn)行表征，結(jié)果如圖6所示。在與GSH孵育30 min后，膠束溶液出現(xiàn)了大量肉眼可見絮狀沉淀物，通過對(duì)溶液的上清液進(jìn)行微觀形貌表征，可以發(fā)行大量的納米粒子結(jié)構(gòu)被破壞，說明在氧化還原條件下，二硫鍵發(fā)生斷裂，造成了膠束結(jié)構(gòu)崩解。

3 ?結(jié)論

本文通過開環(huán)聚合和縮合反應(yīng)成功地合成了雙重氧化還原敏感響應(yīng)的生物可降解兩親性聚氨基酸，核磁氫譜和紅外光譜證明成功的合成了目標(biāo)聚合物。合成的聚合物在水溶液中可自組裝形成分散均勻的球形結(jié)構(gòu)、表面帶負(fù)電荷的納米膠束，且在氧化還原條件下（GSH）聚合物中二硫鍵斷裂破壞膠束結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致膠束崩解。因此，基于此類雙重氧化還原敏感響應(yīng)的聚合物膠束可實(shí)現(xiàn)在血液中長(zhǎng)循環(huán)，到達(dá)腫瘤組織或細(xì)胞中更快地釋放藥物，實(shí)現(xiàn)高效的腫瘤治療。

參考文獻(xiàn)：

[1]BRAY F， FERLAY J， SOERJOMATARAM I， et al. Global cancer statistics 2018： GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries[J].CA： A Cancer Journal for Clinicians， 2018，68（6）：394-424.

[2]VOICULESCU V M， LISIEVICI C V， LUPU M， et al. Mediators of Inflammation in Topical Therapy of Skin Cancers[J].Mediators of inflammation， 2019，2019：8369690.

[3]FARHOOD B， MORTEZAEE K， GORADEL N H， et al. Curcumin as an anti-inflammatory agent： Implications to radiotherapy and chemotherapy[J].Journal of Cellular Physiology， 2019，234（5）：

5728-5740.

[4]BREEDVELD S， CRAFT D， van HAVEREN R， et al. Multi-criteria optimization and decision-making in radiotherapy[J].European Journal of Operational Research， 2019，277（1）：1-19.

[5]MA J， DENG H， ZHAO F， et al. Liposomes-Camouflaged Redox-Responsive Nanogels to Resolve the Dilemma between Extracellular Stability and Intracellular Drug Release[J].Macromolecular Bioscience， 2018，18（7）：1800049.

[6]GHASSAMI E， VARSHOSAZ J， TAYMOURI S. Redox Sensitive Polysaccharide Based Nanoparticles for Improved Cancer Treatment： A Comprehensive Review[J].Curr Pharm Des， 2018，24（28）：3303-3319.

[7]RABIEE S， TAVAKOL S， BARATI M， et al. Autophagic， apoptotic， and necrotic cancer cell fates triggered by acidic pH microenvironment[D]. Journal of Cellular Physiology， 2019，?234?（7）：?12061-12069.

[8]DUONG H T T， THAMBI T， YIN Y， et al. Smart pH-Responsive Nanocube-Controlled Delivery of DNA Vaccine and Chemotherapeutic Drugs for Chemoimmunotherapy[J].ACS Applied Materials & Interfaces， 2019，11（14）：13058-13068.

[9]IA X， ZHANG Y， ZOU Y， et al. Dual Intratumoral Redox/Enzyme-Responsive NO-Releasing Nanomedicine for the Specific， High-Efficacy， and Low-Toxic Cancer Therapy[J].Advanced Materials， 2018，30（30）：1704490.

[10]BRUUN J， LARSEN T B， J?LCK R I， et al. Investigation of enzyme-sensitive lipid nanoparticles for delivery of siRNA to blood-brain barrier and glioma cells[J].International journal of nanomedicine， 2015，10：5995-6008.

[11]ABBAS M， ZOU Q， LI S， et al. Self-Assembled Peptide- and Protein-Based Nanomaterials for Antitumor Photodynamic and PhotothermalTherapy[J].Advanced Materials， 2017，29（12）：1605021.

[12]ZAGORODKO O， ARROYO-CRESPO J J， NEBOT V J， et al. Polypeptide-Based Conjugates as Therapeutics： Opportunities and Challenges[J].Macromolecular Bioscience， 2017，17（1）：1600316.

[13]GUPTA B， RUTTALA H B， POUDEL B K， et al. Polyamino Acid Layer-by-Layer （LbL） Constructed Silica-Supported Mesoporous TitaniaNanocarriers for Stimuli-Responsive Delivery of microRNA 708 and Paclitaxel for Combined Chemotherapy[J].ACS Applied Materials & Interfaces， 2018，10（29）：24392-24405.

[14]TIAN L， TAO L， LI H， et al. Hollow mesoporous carbon modified with cRGD peptide nanoplatform for targeted drug delivery and chemo-photothermal therapy of prostatic carcinoma[J].Colloids and Surfaces A： Physicochemical and Engineering Aspects， 2019，?570：?386-395.

[15]LIN W， MA G， YUAN Z， et al. Development of Zwitterionic Polypeptide Nanoformulation with High Doxorubicin Loading Content for Targeted Drug Delivery[J].Langmuir， 2019，35（5）：1273-1283.

[16]RAHMATOLAHZADEH R， HAMADANIAN M， MA MANI L， et al. Aspartic acid functionalized PEGylated MSN@GO hybrid as an effective and sustainable nano-system for in-vitro drug delivery[J]. Advances in Medical Sciences， 2018，63（2）：257-264.

[17]KOSS K M， UNSWORTH L D. Towards Developing Bioresponsive， Self-Assembled Peptide Materials： Dynamic Morphology and Fractal Nature of Nanostructured Matrices[J].Materials （Basel， Switzerland）， 2018，11（9）：1539.

[18]Z董銳， 鄭雪琴， 唐蘭勤. 聚乳酸-氨基酸共聚物的合成及表征[J].當(dāng)代化工， 2009，38（06）：559-562.

[19]WANG Y， WEI G， ZHANG X， et al. A Step-by-Step Multiple Stimuli-Responsive Nanoplatform for Enhancing Combined Chemo-?Photodynamic Therapy[J]. Advanced Materials， 2017， 29 （12）： 1605357.