HPLC測(cè)定女貞子中特女貞苷的含量及指紋圖譜的建立△

劉美，張娟，肖炯昌，劉紅娜，曹兆軍，李先寬，馬琳*

1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193；2.清華德人西安幸福制藥有限公司，陜西 西安 710043

女貞子為傳統(tǒng)的固本扶正常用中藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，名女貞實(shí)[1]，在2015版《中華人民共和國(guó)藥典》收錄為木犀科植物女貞LigustrumlucidumAit.的干燥成熟果實(shí)。味甘、苦，涼，歸肝、腎經(jīng)，有滋補(bǔ)肝腎，明目烏發(fā)的功能。常用于治療肝腎陰虛，眩暈耳鳴，腰膝酸軟，須發(fā)早白，目暗不明，內(nèi)熱消渴，骨蒸潮熱等癥狀[2]。女貞子主要含有以下化學(xué)成分：1)三萜類(lèi)化合物，包括烏蘇烷型、齊墩果烷型、達(dá)瑪烷型以及羽扇豆烷型4種，共有熊果酸、齊墩果酸等40余種化合物[3]，譚文廣等[4]采用紫外法測(cè)定超聲提取得到的三萜化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5.61%，2005版《中華人民共和國(guó)藥典》前曾將齊墩果酸作為女貞子含量測(cè)定的指標(biāo)成分；2)黃酮類(lèi)化合物，其主要為木犀草素、芹菜素、槲皮素及其糖苷共7個(gè)化合物[5]；3)環(huán)烯醚萜類(lèi)的化合物主要有2個(gè)，即環(huán)烯醚萜與裂環(huán)環(huán)烯醚萜，主要為女貞苷、特女貞苷、新女貞子苷等[6]，特女貞苷為2015版《中華人民共和國(guó)藥典》質(zhì)量控制的含量測(cè)定指標(biāo)成分；4)苯乙醇苷類(lèi)化合物，包括毛蕊花苷、對(duì)羥基苯乙醇、北升麻寧等[7]；5)其他成分，包括各種微量元素如K、Ca、Na、Mg、Zn、Fe等，17種水解氨基酸，以及多糖、揮發(fā)油、甘露醇、磷脂、脂肪酸等多種成分[8]。此外，女貞子具有保肝、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗衰老、抗癌、降血糖、降血脂、抗炎抑菌、保護(hù)損傷細(xì)胞、強(qiáng)心等多種藥理作用[8]。

女貞子資源豐富，且為常綠植物，在我國(guó)廣泛栽種，野生家種均有，主要分布于河北、河南、江蘇、安徽、陜西、甘肅等地。但走訪藥材市場(chǎng)發(fā)現(xiàn)目前市售的女貞子藥材質(zhì)量較為混亂，混偽品和雜質(zhì)較多，使得整個(gè)行業(yè)女貞子質(zhì)量下降，且存在不均一性，因此對(duì)于市售女貞子藥材的質(zhì)量進(jìn)行嚴(yán)格管控，才能提高女貞子行業(yè)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。目前關(guān)于女貞子的研究較多，本研究主要采用高效液相色譜法測(cè)定安徽、河南、江蘇及陜西4個(gè)產(chǎn)地共23批女貞子藥材中特女貞苷的含量，并建立23批女貞子藥材的指紋圖譜，從而為完善和提高女貞子藥材的行業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津LC-20AT型高效液相色譜儀，配SPD-20A紫外-可見(jiàn)光檢測(cè)器，二元泵，在線脫氣機(jī)，SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器，柱溫箱，LC solution工作站；Sartorius BT125D電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司)，F(xiàn)A2004電子天平(上海精天電子儀器有限公司)，DFT-200 手提式高速中藥粉碎機(jī)(溫嶺市林大機(jī)械有限公司)，TDZ4-WS低速臺(tái)式離心機(jī)(湖南賽特湘儀離心機(jī)儀器有限公司)，KH3200B型超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試劑及藥材

特女貞苷(天津萬(wàn)象恒遠(yuǎn)科技有限公司，純度>98%，批號(hào)：20171005)。乙腈、甲醇、磷酸均為色譜純，水為娃哈哈純凈水。

23批女貞子藥材經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)馬琳教授鑒定均為木犀科植物女貞LigustrumlucidumAit.的干燥成熟果實(shí)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為0.1%磷酸水-乙腈梯度洗脫60 min，梯度洗脫程序?yàn)椋?～5 min，10%～10%乙腈；5～20 min，10%～20%乙腈；20～50 min，20%～33%乙腈；50～55 min，33%～100%乙腈；55～60 min，100%～100%乙腈。檢測(cè)波長(zhǎng)為224 nm；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量20 μL，體積流量1.0 mL min-1。

2.2 溶液的配制

2.2.1對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取特女貞苷對(duì)照品6.52 mg，置10 mL棕色容量瓶中，加入甲醇溶解定容，制成0.652 mg mL-1的特女貞苷對(duì)照品溶液，即得。

2.2.2供試品溶液的制備 精密稱(chēng)取女貞子藥材粉末(過(guò)三號(hào)篩)約1.0 g，置50 mL具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇水30 mL，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲提取30 min，取出，放至室溫，再稱(chēng)定質(zhì)量，用70%甲醇水補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，離心10 min(4000 r min-1)，用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3 線性關(guān)系考察

分別精密吸取2.2.1中特女貞苷對(duì)照品溶液適量，稀釋成不同系列濃度的對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣20 μL，記錄特女貞苷峰面積，以濃度X為橫坐標(biāo)，以峰面積Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：Y=19.7X+0.242 6 (r=0.999 6)，結(jié)果表明特女貞苷在0.054 33～0.652 mg mL-1線性關(guān)系良好。

2.4 精密度試驗(yàn)

精密吸取特女貞苷對(duì)照品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄特女貞苷峰面積，計(jì)算RSD(n=6)值為0.52%，表明儀器精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取同一批女貞子供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件分別在0、2、4、6、8、12、24 h進(jìn)樣分析，記錄特女貞苷峰面積，計(jì)算RSD(n=7)值為1.04%，表明女貞子供試品在室溫條件下放置24 h 穩(wěn)定性良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱(chēng)取同一批女貞子樣品共6份，按2.2.2項(xiàng)下方法平行操作，制備6份供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄特女貞苷峰面積，計(jì)算RSD(n=6)為1.22%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱(chēng)取同一批已知含量的女貞子樣品共6份，每份0.5 g，分別加入特女貞苷對(duì)照品適量，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄特女貞苷峰面積，計(jì)算回收率得特女貞苷的平均加樣回收率為101.17%，RSD為2.82%，結(jié)果表明該方法有良好的準(zhǔn)確性。

2.8 樣品含量測(cè)定

精密吸取23批女貞子樣品的供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，連續(xù)平行測(cè)定3次，每次進(jìn)樣20 μL。所得特女貞苷對(duì)照品和女貞子樣品色譜圖見(jiàn)圖1，含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

注：A.特女貞苷對(duì)照品；B.女貞子樣品；1.特女貞苷。圖1 女貞子對(duì)照品及樣品HPLC圖

表1 23批女貞子樣品特女貞苷含量測(cè)定結(jié)果(n=3)

2.9 指紋圖譜研究

將23批女貞子樣品的色譜圖，通過(guò)AIA格式導(dǎo)出文件，導(dǎo)入國(guó)家藥典委員會(huì)“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”軟件。采用中位數(shù)法，設(shè)置參照?qǐng)D譜，進(jìn)行多點(diǎn)校正，Mark峰匹配，生成對(duì)照指紋圖譜，共指認(rèn)了15個(gè)共有峰作為女貞子的基本特征峰，其中特女貞苷峰為10號(hào)峰，23批女貞子樣品的HPLC指紋圖譜見(jiàn)圖2，將女貞子對(duì)照?qǐng)D譜與藥材指紋圖譜進(jìn)行匹配，并計(jì)算相似度，得出非共有峰面積占比見(jiàn)表2，共有峰峰面積RSD見(jiàn)表3，相似度計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表4。

注：10.特女貞苷峰；R.對(duì)照?qǐng)D譜。圖2 23批女貞子樣品HPLC指紋圖譜

表4 女貞子指紋圖譜相似度計(jì)算結(jié)果

續(xù)表4

3 結(jié)論與討論

本實(shí)驗(yàn)過(guò)程中考察了不同的流動(dòng)相體系：乙腈-0.1%甲酸水溶液、乙腈-水溶液和乙腈-0.1%磷酸水溶液等，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙腈-0.1%甲酸水溶液的峰形會(huì)產(chǎn)生拖尾現(xiàn)象，乙腈-水的色譜峰分離度較差，乙腈-0.1%磷酸水溶液能使各成分分離良好。故采用乙腈-0.1%磷酸水溶液作為流動(dòng)相，并對(duì)洗脫程序進(jìn)行優(yōu)化，最終建立簡(jiǎn)便可行的分析方法。

由含量測(cè)定結(jié)果可知，N07樣品的特女貞苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)僅為0.35%，其余22批樣品的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均達(dá)到了藥典0.70%的要求，為0.35%～3.74%，其中安徽產(chǎn)地的女貞子藥材中特女貞苷含量最高，比《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定的含量高達(dá)5倍多，可見(jiàn)安徽、河南、江蘇及陜西4個(gè)產(chǎn)地的女貞子中特女貞苷含量均比較高。崔蘊(yùn)慧等[9]采用高效液相色譜法測(cè)定湖北、廣東、江蘇、河南、廣西、云南、江西、安徽、甘肅、陜西、浙江、湖南12個(gè)不同產(chǎn)地的女貞子中特女貞苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.473%～2.149%，其中安徽產(chǎn)地為最高。張炯怡等[10]采用HPLC測(cè)定10批貴州女貞子中特女貞苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.60%～1.02%。任爽等[11]采用高效液相色譜法測(cè)定了不同來(lái)源的16批女貞子中特女貞苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.11%～2.77%。且筆者在安徽亳州藥材市場(chǎng)采購(gòu)樣品時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)?shù)氐呐懽幼鳛榫G化植物栽種，資源十分豐富，但走訪藥材市場(chǎng)卻發(fā)現(xiàn)市售的女貞子藥材中當(dāng)?shù)禺a(chǎn)的并不多見(jiàn)，因此建議對(duì)當(dāng)?shù)氐呐懽铀幉馁Y源進(jìn)行充分開(kāi)發(fā)與利用。

其次，陜西的16批女貞子中特女貞苷的含量最穩(wěn)定，為0.8%～2.2%；河南的女貞子中特女貞苷的含量相對(duì)江蘇的較穩(wěn)定，兩個(gè)產(chǎn)地的3批女貞子藥材特女貞苷的含量分別為高中低3個(gè)等級(jí)，且每個(gè)等級(jí)之間總體相差約為2倍，含量差異相對(duì)較大，田志祥等[12]通過(guò)研究女貞子10、11、12月份中特女貞苷含量變化，得出女貞子在11月份時(shí)的特女貞苷含量最高，10月份含量最低，可能與女貞子果實(shí)在10月份并未完全成熟有關(guān)，而在12月后，特女貞苷的光不穩(wěn)定性造成其含量下降，或女貞子在生長(zhǎng)過(guò)程中可能由紅景天苷轉(zhuǎn)化為特女貞苷[13]，故初步推測(cè)女貞子雖為同一產(chǎn)地，但有采收時(shí)間不同而造成含量有較大差異的可能，因此，嚴(yán)格把控女貞子等果實(shí)種子類(lèi)藥材的產(chǎn)地采收加工環(huán)節(jié)對(duì)藥材行業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一性和均一性的建立有重要意義。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)高效液相色譜法建立了女貞子指紋圖譜，比較了23批女貞子包括安徽、河南、江蘇及陜西4個(gè)產(chǎn)地的指紋圖譜，由表4可知除女貞子N07與對(duì)照指紋圖譜的相似度低于0.8外，其余22批女貞子與對(duì)照指紋圖譜均達(dá)到0.8以上。由表2 可知23批女貞子非共有峰面積占比為24.84%～60.42%，由表3可知其共有峰峰面積RSD在10.23%～96.54%，說(shuō)明23批女貞子藥材成分相似，但各共有成分之間相對(duì)差異較大，推測(cè)女貞子藥材質(zhì)量差異較大可能與生長(zhǎng)環(huán)境、產(chǎn)地、采收期[9]、加工方法、貯藏時(shí)間及雜質(zhì)含量不符合藥典規(guī)范等因素有關(guān)，因此，對(duì)于女貞子藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制還需從源頭把控。而且女貞子化學(xué)成分復(fù)雜，主要成分特女貞苷、女貞子苷、紅景天苷、熊果酸、齊墩果酸等的研究越來(lái)越多，《中華人民共和國(guó)藥典》僅以特女貞苷1個(gè)成分作為其含量測(cè)定的指標(biāo)較為片面[14]，其他成分對(duì)于女貞子的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定也有影響，因此指紋圖譜的建立完善對(duì)女貞子行業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的控制可提供依據(jù)參考和意義。此外，女貞子質(zhì)量控制的標(biāo)準(zhǔn)研究還有很多需要去深入研究，例如女貞子藥效物質(zhì)基礎(chǔ)[15]、生物標(biāo)志物等方面，從而綜合建立更科學(xué)、有效、準(zhǔn)確的行業(yè)質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。本實(shí)驗(yàn)的方法條件下，可測(cè)定女貞子中特女貞苷含量并同時(shí)建立女貞子藥材指紋圖譜，方法簡(jiǎn)單易行，為女貞子的行業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立和提高提供了參考。