劉靜雨 耿俊俊 邢靜茹 劉文嬌 張曉建

（河南科技學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453003）

乳腺炎是奶牛業(yè)中最重要的疾病之一，不僅會(huì)損害動(dòng)物健康和福利，并伴有產(chǎn)奶量下降、醫(yī)療保健成本增加、淘汰率較高，有時(shí)甚至死亡。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，抗生素治療后的細(xì)菌學(xué)治愈率為0～80%，且高達(dá)40%的乳腺炎病例似乎是既往治療失敗的疾病，且發(fā)病可能性提高了4.8倍。先前研究人員已從血清蛋白結(jié)合、脂溶性抗菌劑的pKa值、藥效學(xué)和藥代動(dòng)力學(xué)等方面討論了抗藥性問(wèn)題，提出了一個(gè)假說(shuō)：在包含葡萄球菌在內(nèi)的多種微生物受感染組織中，微生物膜的生長(zhǎng)，使細(xì)菌對(duì)幾乎所有抗生素產(chǎn)生了抗性。鑒于此，本綜述概述了與乳腺炎中細(xì)菌生物膜生長(zhǎng)相關(guān)的機(jī)制，以期揭示細(xì)菌對(duì)幾乎所有抗生素的敏感性降低的原因，為奶牛乳腺炎有效防控提供理論依據(jù)。

1 生物膜

生物被膜是微生物有組織生長(zhǎng)的聚集體。細(xì)菌不可逆的附著于惰性或活性實(shí)體的表面，繁殖、分化，并分泌一些多糖基質(zhì)，將菌體群落包裹其中而形成的細(xì)菌聚集體膜狀物。人們研究認(rèn)為皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和鏈球菌的細(xì)菌生物膜對(duì)抗生素和宿主免疫防御機(jī)制的抗性很強(qiáng)，而這些細(xì)菌大多也是牛乳腺炎的主要病原體，因此乳腺炎治療反復(fù)感染的困難可能與這些病原體形成生物膜的能力有關(guān)。

1.1 生物膜的形成與成熟

在自然環(huán)境中，微生物會(huì)嘗試粘附在可用表面上，并從一個(gè)表面擴(kuò)散到另一個(gè)表面，這種表面運(yùn)動(dòng)性以及二元分裂導(dǎo)致附著細(xì)胞進(jìn)一步聚集，而這些原代細(xì)胞聚集體產(chǎn)生胞外多糖以促進(jìn)結(jié)塊。由此可見(jiàn)，生物膜形成的初始階段包括兩個(gè)階段：第一階段在細(xì)胞壁相關(guān)粘附素的作用下，細(xì)胞與天然聚合物表面的附著增加，粘附于表面。第二階段是通過(guò)細(xì)胞增殖形成由細(xì)胞外多糖相互連接的多細(xì)胞層成熟結(jié)構(gòu)，葡萄球菌會(huì)產(chǎn)生糖萼，作為黏液層進(jìn)一步保護(hù)細(xì)菌生物膜，但這些粘液層的化學(xué)性質(zhì)仍未完全闡明。任何細(xì)菌生物膜的生長(zhǎng)潛力均受到生物膜內(nèi)細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)素的可用性和跨生物膜的獨(dú)特流通通道的限制。另外，pH值、氧氣灌注、碳納米管、來(lái)源和滲透壓也可影響生物膜成熟。當(dāng)生物膜達(dá)到臨界質(zhì)量時(shí)，進(jìn)入動(dòng)態(tài)平衡，最外層細(xì)胞層開(kāi)始產(chǎn)生浮游生物，這些細(xì)菌可以自由逃脫生物膜并在其他表面定殖。

1.2 葡萄球菌產(chǎn)生的生物膜的表型和基因型基礎(chǔ)

研究發(fā)現(xiàn)，從葡萄球菌會(huì)產(chǎn)生的粘液層中純化出兩種多糖級(jí)分，多糖I（＞80%）為至少有130個(gè)?-1，6-N-乙酰氨基葡糖殘基的線性同聚糖，帶正電，多糖II（＜20%）的非N-乙?；疍-氨基葡萄糖殘基含量較低，并且含有磷酸鹽和酯連接的琥珀酸酯，多糖II為陰離子，結(jié)構(gòu)獨(dú)特，在細(xì)胞簇形成中有一定的功能，被稱(chēng)為多糖細(xì)胞間粘附素（PIA），金黃色葡萄球菌也有相同發(fā)現(xiàn)。值得注意的是，完整生物膜還有壁絨酸、葡萄球菌表面蛋白、聚集因子、積累相關(guān)蛋白和生物膜相關(guān)蛋白等其他組分[1]。

研究發(fā)現(xiàn)，表皮葡萄球菌0～47突變體存在兩種基因型，其中積累缺陷型突變體由于無(wú)法形成細(xì)胞間聚集，進(jìn)而無(wú)法產(chǎn)生PIA和形成生物膜。另外，icaR基因的缺失增強(qiáng)了PIA表達(dá)，也說(shuō)明該基因位點(diǎn)參與的PIA表達(dá)。編碼四個(gè)基因的ica操縱子存在于大多數(shù)金黃色葡萄球菌菌株中，而厭氧可以ica的表達(dá)，這也解釋了有氧條件下未能觀察到PIA產(chǎn)生（以及隨后生物膜生長(zhǎng)）的原因。表皮葡萄球菌ica操縱子也受sigB操縱子控制，而金黃色葡萄球菌則受輔助基因調(diào)節(jié)劑（Agr）和葡萄球菌輔助調(diào)節(jié)劑（sar）的控制。這在一定程度上表明陽(yáng)性細(xì)菌菌株生物膜比陰性菌株生物膜更與重大感染有關(guān)。

1.3 大腸桿菌和鏈球菌產(chǎn)生的生物膜的表型和基因型基礎(chǔ)

大腸桿菌的生物膜形成不僅受到生長(zhǎng)培養(yǎng)基滲透壓增加的抑制，而且其生長(zhǎng)強(qiáng)度也與rpoS基因有關(guān)，因?yàn)閞poS基因是受營(yíng)養(yǎng)限制和有毒代謝產(chǎn)物的增加而表達(dá)的。盡管鏈球菌生物膜生長(zhǎng)已得到廣泛研究，但是，就口腔鏈球菌而言，群體感應(yīng)和雙組分系統(tǒng)在生物膜調(diào)節(jié)和生物膜的形成機(jī)制尚未被闡明。從大腸桿菌中篩選基因文庫(kù)表明，基因表達(dá)的主要改變可能與粘附和遷移有關(guān)。在惡臭假單胞菌中，附著后6小時(shí)內(nèi)改變了30多個(gè)基因和40多個(gè)基因產(chǎn)物，在從浮游生長(zhǎng)到銅綠假單胞菌生物膜完全成熟的過(guò)渡過(guò)程中，改變了800多種蛋白質(zhì)的表達(dá)水平（相當(dāng)于觀察到的蛋白質(zhì)組的50%），表明該階段變異的復(fù)雜性。

2 生物膜對(duì)宿主免疫系統(tǒng)的抵抗力

形成生物膜的外聚合物可保護(hù)細(xì)菌免受宿主免疫系統(tǒng)的影響。表皮葡萄球菌產(chǎn)生的細(xì)胞外粘液既可保護(hù)細(xì)胞免受巨噬細(xì)胞的吞噬，也可免受多形核白細(xì)胞中的活性氧的影響。同樣，嗜中性白細(xì)胞對(duì)產(chǎn)生粘液的金黃色葡萄球菌菌株的殺菌活性也會(huì)降低。

3 生物膜對(duì)抗菌藥物的耐藥性

與同一菌株的浮游細(xì)菌相比，在生物膜中生長(zhǎng)的細(xì)菌對(duì)抗菌劑的抵抗力提高10到1000倍，其具體機(jī)制可能包括：（1）抗菌劑通過(guò)生物膜基質(zhì)的滲透延遲；（2）生物膜生物的生長(zhǎng)速度改變；（3）由于生物膜生長(zhǎng)方式而導(dǎo)致的生理變化，包括“持久”細(xì)胞。另外，胞外多糖基質(zhì)的產(chǎn)生是區(qū)別生物膜的特征之一，它會(huì)與化合物反應(yīng)或者吸附進(jìn)而限制抗菌劑在生物膜內(nèi)地運(yùn)輸，最終破壞抗生素進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞的能力。因此，在成熟的生物膜中可以觀察到細(xì)菌的緩慢生長(zhǎng)，這也說(shuō)明生物膜中細(xì)菌對(duì)抗菌劑的敏感性降低。

4 抗生素對(duì)生物膜形成的影響

越來(lái)越多的證據(jù)表明，抗生素不僅對(duì)細(xì)菌生物膜的有效性不高，而且還可能刺激生物膜的形成。四環(huán)素、喹諾司汀-達(dá)福普汀和紅霉素等三類(lèi)抗生素使用時(shí)，可促進(jìn)表皮葡萄球菌中ICA基因的表達(dá)，進(jìn)而刺激生物膜的形成，亞抑制濃度的抗生素也會(huì)影響重要細(xì)菌毒力因子的表達(dá)，例如其他粘附分子或毒素。

5 生物膜與乳腺炎

在急性和慢性感染的乳腺組織中，細(xì)菌主要粘附在乳腺腺泡和乳腺導(dǎo)管的上皮細(xì)胞上，并侵入間質(zhì)組織中，這些細(xì)菌簇往往在暴露病原體后24h出現(xiàn)，同時(shí)乳腺內(nèi)部發(fā)生感染，而且，金黃色葡萄球菌乳腺炎分離株中ica基因的表達(dá)率最高。另外，抗菌敏感性的轉(zhuǎn)變?cè)谝欢ǔ潭壬现С至巳橄俑腥九c生物膜形成有關(guān)的假說(shuō)。在牛原代乳腺上皮細(xì)胞測(cè)定實(shí)驗(yàn)中，非粘附性金黃色葡萄球菌，對(duì)新霉素、青霉素、桿菌肽和四環(huán)素的敏感性高于粘附葡萄球菌。金黃色葡萄球菌在豆湯或脫脂牛奶中生長(zhǎng)形成生物膜的研究表明，抗生素對(duì)年輕生物膜（6h）和在牛奶中生長(zhǎng)的生物膜的影響大于對(duì)較老生物膜（18h）和在肉湯中生長(zhǎng)的生物膜的影響，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)慶大霉素和紅霉素是對(duì)抗金黃色葡萄球菌生物膜最不有效的抗生素[2]。

在乳腺炎的演變過(guò)程中，牛乳房的生理變化以及細(xì)菌基因表達(dá)的變化主要發(fā)生在亞臨床向臨床的過(guò)渡期，從而促進(jìn)了毒力基因的上調(diào)以及病原體的“防御性”生物膜生長(zhǎng)轉(zhuǎn)變，進(jìn)入一個(gè)細(xì)菌的有害生長(zhǎng)和分布階段，最終導(dǎo)致炎癥發(fā)生和臨床體征出現(xiàn)。但是，相變過(guò)程中刺激生物膜形成的確切機(jī)制有待進(jìn)一步闡明。

6 結(jié)語(yǔ)

隨著奶牛場(chǎng)乳腺炎防控力量的加強(qiáng)，乳腺炎的發(fā)病率和體細(xì)胞數(shù)量在一定程度上有所下降，但是乳腺炎仍然是奶牛最重要的疾病之一，研究生物膜的形成和抗藥機(jī)制仍是未來(lái)解決乳腺炎防控的重要基礎(chǔ)之一。