蘇純潔，何前進(jìn)，毛偉明，張喜華，岑紅兵，張松柏

(1荊門市第一人民醫(yī)院，湖北荊門448000；2黃岡市中心醫(yī)院)

肝癌是我國(guó)常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率均居世界第一[1]。近年來盡管肝癌的診斷和治療有了長(zhǎng)足進(jìn)步，但肝癌的預(yù)后并未得到明顯改善，主要原因在于肝癌的肝內(nèi)和肝外轉(zhuǎn)移[2]。肝癌較易轉(zhuǎn)移的原因和相關(guān)機(jī)制尚不清楚。我們前期研究顯示血清甲胎蛋白(AFP)水平和肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)。血清AFP>400 μg/L的肝癌患者較易出現(xiàn)腫瘤侵犯和術(shù)后轉(zhuǎn)移[3]。AFP是肝細(xì)胞合成并分泌到血液中的一種糖蛋白，被視為肝癌診斷的血清標(biāo)志物，在肝癌的篩查、臨床診斷、術(shù)后復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)過程中發(fā)揮重要作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)AFP同肝癌預(yù)后密切相關(guān)，具有復(fù)雜的生物學(xué)功能[4,5]。研究發(fā)現(xiàn)，AFP可影響肝癌細(xì)胞的增殖,抑制細(xì)胞凋亡[4,5]。AFP同肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的研究不多，相關(guān)機(jī)制尚不清楚?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是最重要的一組蛋白酶，與肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。2018年3～9月，我們探討了沉默AFP表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 肝癌細(xì)胞系Hep3B細(xì)胞由武漢同濟(jì)醫(yī)院肝臟外科董漢華副主任醫(yī)師饋贈(zèng)。兔抗人AFP單克隆抗體購(gòu)于Cell signaling公司，鼠抗人β-actin單克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz公司。Transwell小室購(gòu)于美國(guó)Corning公司。Matrigel購(gòu)于美國(guó)BD公司。轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體Lipofectamine2000購(gòu)于美國(guó)Life Technologies公司,DMEM、胎牛血清由Hyclone公司提供,PCR 引物購(gòu)于Invitrogen公司。AFP干擾的慢病毒載體購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司。

1.2 細(xì)胞分組及慢病毒轉(zhuǎn)染 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hep3B細(xì)胞隨機(jī)分為Hep3B/shRNA-AFP組、Hep3B/shRNA-control組，消化后種于6孔板中，用含有5%的胎牛血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，待生長(zhǎng)至65%融合時(shí)，將AFP干擾的慢病毒載體和對(duì)照病毒載體，按照感染復(fù)數(shù)為30(感染復(fù)數(shù)=病毒活性單位數(shù)/細(xì)胞數(shù))的比例滴加到細(xì)胞培養(yǎng)液中。感染16 h后，吸出含慢病毒顆粒的培養(yǎng)液，更換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)5 d后的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 AFP蛋白表達(dá)檢測(cè)方法 采用Western blotting法。裂解并提取腫瘤組織蛋白，用BCA法測(cè)定蛋白濃度，進(jìn)行蛋白定量后在12%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)上以每孔20 μL蛋白上樣，進(jìn)行電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，用1∶1 000稀釋的兔抗人AFP抗體，4 ℃孵育過夜，β-actin作為內(nèi)參。第2天，分別用1∶3 000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗兔或抗鼠的二抗進(jìn)行孵育后，用化學(xué)發(fā)光法在暗室內(nèi)進(jìn)行曝光、顯影和定影。

1.4 細(xì)胞侵襲能力檢測(cè) 進(jìn)行細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)。分別將感染AFP干擾慢病毒和對(duì)照慢病毒載體的 Hep3B細(xì)胞按每孔2×105個(gè)細(xì)胞均勻接種在6孔板上，次日觀察細(xì)胞完全貼壁后用10 μL的無菌槍頭在細(xì)胞表面劃一橫線，PBS洗滌3次去除脫落細(xì)胞脆片，加入無血清DMEM培養(yǎng)基。放回37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，分別于0、8和24 h在顯微鏡下觀察拍照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。Image J軟件分析劃痕細(xì)胞擴(kuò)增速度，統(tǒng)計(jì)空白區(qū)域占原始劃痕區(qū)域面積的百分比。

1.5 細(xì)胞侵襲能力檢測(cè) 進(jìn)行Transwell實(shí)驗(yàn)。使用具有孔徑為8.0 μm的聚碳酸酯膜過濾器的Transwell小室評(píng)估肝癌細(xì)胞侵襲能力。Transwell小室用Matrigel 1∶100比例稀釋預(yù)處理，37 ℃培養(yǎng)箱中放置2 h。之后，將小室放入24孔板中，細(xì)胞按1×105個(gè)/室的密度接種于上室中，上室液體總體積為200 μL。下室加入含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基600 μL，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后取出Transwell小室，PBS沖洗，多聚甲醛室溫下固定20 min，結(jié)晶紫染液染色5 min，蒸餾水沖洗。顯微鏡下對(duì)侵襲至微孔膜下層的細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.6 沉默AFP前后Hep3B細(xì)胞中MMPs mRNA的表達(dá)檢測(cè) 采用real-time PCR方法。RNA提取試劑TRIzol提取細(xì)胞總RNA，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度和純度。取相同量的 mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以基因引物加熒光染料復(fù)合物SYBR Green Mix(2×)進(jìn)行定量PCR，每個(gè)反應(yīng)做3個(gè)復(fù)孔。熒光定量 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為：cDNA模板1.5 μL，10 μmol/L的正向和反向引物各1 μL，SYBR Green Mix 10 μL，ddH2O 6.5 μL，總反應(yīng)體系為20 μL。每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔。反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min，1個(gè)循環(huán);然后94 ℃ 1 min，58 ℃ 1 min，72 ℃1 min，33個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸10 min，1個(gè)循環(huán)。選用β-actin做為內(nèi)參引物。MMP1正向引物5′-CTGCTTACGAATTTGCCGACAGA-3′，反向引物5′-GTTCTAGGGAAGCCAAAGGAGCTG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度130 bp；MMP2正向引物5′-GTTCATTTGGCGGACTGTGACG-3′，反向引物5′-ATTCATTCCCTGCAAAGAACACAGC-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度146 bp；MMP3正向引物5′-GGACAAAGGATACAACAGGGACCA-3′，反向引物5′-GAACCGAGTCAGGTCTGTGAGTG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度140 bp；MMP7正向引物5′-GATGGGCCAGGAAACACGC-3′，反向引物5′-CCTAGACTGCTACCATCCGTCCA-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度107 bp；MMP9正向引物5′-CACGACGTCTTCCAGTACCGAGA-3′，反向引物5′-CATAGGTCACGTAGCCCACTTGGT-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度115 bp；MMP10正向引物5′-TCTGTTCCTTCGGGATCTGAGATG-3′，反向引物5′-TGAAATTCAGGTTCAGGGTTCCAGT-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度146 bp；MMP11正向引物5′-ACCTGGACTATCGGGGATGA-3′，反向引物5′-GGCTGGCCATATAGGTGTTG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度188 bp；MMP14正向引物5′-CAGAGAAGGCACACAAACGA-3′，反向引物5′-CACTGGTGAGACAGGCTTGA-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度172 bp；MMP15正向引物5′-GGCCGACATCATGGTACTCT-3′，反向引物5′-GAGGTTGTTTCCATGCAGGT-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度178 bp；MMP17正向引物5′-GGTGCGTGCACTCATGTACT-3′，反向引物5′-GAAGGGGTAGCCGTCGTTAT-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度136 bp；MMP21正向引物5′-TCAAAGGCAATGCATACTGG-3′，反向引物5′-CGAAGTCCTATGACCCTCCA-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度186 bp；MMP24正向引物5′-AGTTTGTGACCGTCCTCCAC-3′，反向引物5′-AGCCATCTCTGCCTCACCTA-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度112 bp；MMP25正向引物5′-TTAACTAGTCGCGGGGATTG-3′，反向引物5′-ACTGAGGCTGGACAGCAACT-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度172 bp；β-actin正向引物5′-AGTTGCGTTACACCCTTTCTTGAC-3′，反向引物5′-GCTCGCTCCAACCGACTGC-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度 171 bp。

2 結(jié)果

2.1 Hep3B/shRNA-control、Hep3B/shRNA-AFP細(xì)胞中AFP mRNA和蛋白表達(dá)比較 real-time PCR結(jié)果顯示，Hep3B/shRNA-AFP組細(xì)胞中AFP mRNA表達(dá)量為Hep3B/shRNA-control組的(0.12±0.02)倍。Western blotting檢測(cè)結(jié)果和real-time PCR結(jié)果一致，顯示Hep3B/shRNA-AFP組細(xì)胞中AFP蛋白表達(dá)低于Hep3B/shRNA-control組。shRNA-AFP的干擾效率符合下一步實(shí)驗(yàn)要求。

2.2 沉默AFP表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞Hep3B細(xì)胞侵襲能力的影響 Hep3B/sh-AFP組24h后空白區(qū)域占原始劃痕區(qū)域面積百分比為77.1%±1.5%，Hep3B/shRNA-control組為51.3%±1.5%，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 沉默AFP表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞Hep3B轉(zhuǎn)移能力的影響 Hep3B/sh-AFP組、Hep3B/shRNA-control組穿透濾膜的細(xì)胞數(shù)分別為(463±47)、(718±23)個(gè)/HP，與Hep3B/shRNA-control組相比，Hep3B/sh-AFP組穿透濾膜的細(xì)胞數(shù)減少(P<0.05)。

2.4 沉默AFP表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞Hep3B中MMPs基因表達(dá)的影響 Hep3B/sh-AFP組、Hep3B/shRNA-control組MMP1相對(duì)表達(dá)量分別為1.04±0.09、0.92±0.39，MMP2相對(duì)表達(dá)量分別為0.83±0.72、0.98±0.86，MMP3相對(duì)表達(dá)量分別為0.95±0.41、0.94±0.17，MMP7相對(duì)表達(dá)量分別為0.97±0.39、0.98±0.38，MMP9相對(duì)表達(dá)量分別為0.84±0.16、1.01±0.13，MMP10相對(duì)表達(dá)量分別為0.99±0.09、1.01±0.10，MMP11相對(duì)表達(dá)量分別為0.24±0.29、1.00±0.88，MMP14相對(duì)表達(dá)量分別為0.98±0.10、0.99±0.10，MMP15相對(duì)表達(dá)量分別為0.84±0.43、0.98±0.08，MMP17相對(duì)表達(dá)量分別為0.63±0.23、1.02±0.26，MMP21相對(duì)表達(dá)量分別為5.44±0.72、1.23±0.46，MMP24相對(duì)表達(dá)量分別為0.98±0.41、0.97±0.25，MMP25相對(duì)表達(dá)量分別為0.32±0.21、1.00±0.07，兩組MMP2、MMP9、MMP11、MMP15、MMP17和MMP25表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。

3 討論

肝細(xì)胞癌占原發(fā)性肝癌的90%左右,其較易發(fā)生肝內(nèi)和肝外轉(zhuǎn)移。肝癌根治性切除是目前最有效的治療手段，但研究發(fā)現(xiàn)即使接受根治性手術(shù)，50%的患者仍會(huì)在5年內(nèi)出現(xiàn)轉(zhuǎn)移[2]。我們前期研究結(jié)果顯示患者血清中AFP水平和肝癌侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。AFP>400 μg/L的肝癌患者中,28.2%(31/110)的患者腫瘤組織侵犯了血管；在AFP≤400 μg/L的肝癌患者中,16.5%(44/266)的患者腫瘤組織侵犯了血管，兩者間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。AFP>400 μg/L的肝癌患者中根治術(shù)后1、3、5年轉(zhuǎn)移率分別為17.6%(12/68)、38.2%(26/68)、45.6%(31/68)； AFP≤400 μg/L的肝癌患者中根治術(shù)后1、3、5年轉(zhuǎn)移率分別為7.6%(13/171)、23.4%(40/171)、31.6%(54/171)，兩者間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[3]。上述結(jié)果表明AFP和肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，此與文獻(xiàn)報(bào)道一致[4,5]。

本研究先在細(xì)胞水平上觀察了AFP對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲能力和轉(zhuǎn)移能力的影響，與體內(nèi)結(jié)果一致。因MMPs是目前已知間質(zhì)膠原蛋白惟一的基質(zhì)降解酶，能降解除多糖外的細(xì)胞外基質(zhì)所有成分，故我們檢測(cè)了AFP對(duì)MMP基因家族的影響。本研究結(jié)果顯示，AFP表達(dá)下調(diào)可引起Hep3B細(xì)胞中MMP2、MMP9、MMP11、MMP15、MMP17和MMP25表達(dá)下調(diào)。

目前研究發(fā)現(xiàn)MMP家族成員已增加到26個(gè)，基因間具有較高同源性[6～11]。研究顯示MMP1、MMP2、MMP3、MMP7、MMP9、MMP10、MMP11、MMP12、MMP13、MMP14、MMP16均在肝癌組織中高表達(dá)，其同肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[6～12]。本研究結(jié)果顯示AFP選擇性地調(diào)控部分MMP基因表達(dá)，而對(duì)另一部分MMP基因如MMP1、MMP3、MMP7、MMP10、MMP14、MMP24表達(dá)無明顯影響，原因有待進(jìn)一步研究。有文獻(xiàn)[12]報(bào)道AFP可通過上調(diào)MMP2和MMP9促進(jìn)HLE細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，與本研究結(jié)果一致。

本研究表明AFP是一個(gè)潛在有生物學(xué)功能的蛋白。AFP表達(dá)升高后可激活PI3K/AKT信號(hào),進(jìn)而誘導(dǎo)Ras基因和Src基因表達(dá),最終引起肝細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。AFP還可通過調(diào)控細(xì)胞內(nèi)第二信使遞質(zhì)Ca2+和cAMP的濃度,使蛋白酶A活性上升，從而促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)DNA等物質(zhì)的合成[4,5]。

綜上所述，沉默AFP表達(dá)可降低肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，其機(jī)制可能與抑制MMP2、MMP9、MMP11、MMP15、MMP17和MMP25表達(dá)有關(guān)。