王惠敏，戶佩，蔡甜甜，徐淑麗，洪晶,汪少蕓

(福州大學 生物科學與工程學院，福建 福州，350108)

自由基理論指出，活性氧自由基及其他自由基會對DNA、蛋白質和其他大分子如脂類產生氧化損傷[1],還有誘發(fā)多種疾病如糖尿病、心血管疾病甚至癌癥等的發(fā)生[2]。因而抗氧化劑對清除人體自由基以及預防和治療各類疾病具有重要意義。目前市場上以化學合成的抗氧化劑如BHT、BHA應用最為廣泛，抗氧化效果良好，但有研究表明BHT、BHA等化學合成的抗氧化劑對人體肝臟、脾肺有潛在的毒性作用[3]，因而其使用量有嚴格限制。所以開發(fā)高效無毒的抗氧化劑已成為國內外的研究熱點。

抗氧化肽具有清除自由基活性和抑制脂質過氧化的作用，同時抗氧化肽又可以為人體提供額外的營養(yǎng)價值。目前已有很多研究者從各類動植物源蛋白中提取并純化得到特定氨基酸序列的抗氧化肽，如HIMANI等[4]從珍珠栗蛋白中提取并純化得到抗氧化肽SDRDLLGPNNQYLPK；趙曉蕾等[5]從大米渣中提取并純化得到氨基酸序列為LQPY的抗氧化肽；DAVALOS等[1]通過水解雞蛋白得到抗氧化肽YAEERYPIL，具有良好的活性氧自由基清除活性。

本文以胡蘿卜籽蛋白為原料，通過酶解法制備獲得較高活性的抗氧化肽，采用Sephadex G-25 凝膠過濾色譜和反向高效液相色譜對胡蘿卜籽抗氧化肽進行分離純化，測定其氨基酸序列，并對其抗氧化活性進行了研究。研究結果為胡蘿卜籽的綜合開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

胡蘿卜籽，購于福州種子市場；堿性蛋白酶，購于Notlas生物科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)，購于美國Sigma公司；谷胱甘肽(GSH)，乙腈，三氟乙酸，購于國藥集團；Sephadex G-25常壓凝膠色譜柱，購于美國GE Healthcare公司；半制備型C18高效液相色譜柱，購于上海通威公司。

1.2 實驗儀器

數(shù)顯恒溫水浴搖床(HH-4)，國華電器有限公司；高速冷凍離心機(XZ21K)，長沙湘智離心機儀器有限公司；pH計(pH700),美國Eutech公司；自動收集器(BS-160A),上海滬西分析儀器廠有限公司；真空冷凍干燥器(FD-1C-50)，北京博醫(yī)康試驗儀器有限公司；高效液相色譜系統(tǒng)(LC-20A)，日本島津；質譜儀(Aglient 6500)，美國安捷倫科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 胡蘿卜籽蛋白含量的測定及提取

采用凱式定氮法測定胡蘿卜籽中總蛋白含量，參照戶佩等[6]研究得出的最優(yōu)提取工藝制備胡蘿卜籽蛋白。

1.3.2 胡蘿卜籽抗氧化肽的制備

以胡蘿卜籽蛋白為原料，利用堿性蛋白酶進行酶解制備抗氧化肽。酶解工藝流程為：胡蘿卜籽蛋白溶液→調pH→酶解→滅酶→離心取上清→真空冷凍干燥→抗氧化肽。

配制質量濃度為5.28%的蛋白質溶液，調pH為10.0，添加酶量為419.36 U/g，45 ℃水浴酶解3.5 h，酶解結束后于沸水浴滅酶10 min，迅速冷卻至室溫，于4 ℃條件下12 000 r/min離心30 min。

1.3.3 胡蘿卜籽抗氧化肽的分離純化與結構鑒定

1.3.3.1 Sephadex G-25 凝膠過濾色譜分離

將Sephadex G-25凝膠進行預處理后裝柱(大小Φ100×2.0 cm),抗氧化肽凍干粉以超純水復溶，配制為50 mg/mL的溶液，經0.22 μm微濾膜過濾后上樣，以超純水為流動相以0.3 mL/min的速度洗脫，每10 min收集1管。洗脫液于220nm波長處測定吸光值，繪制洗脫曲線，收集各洗脫組分，真空冷凍干燥備用。

1.3.3.2 反相高效液相色譜(RP-HPLC)

將Sephadex G-25分離組分中有較高活性的組分以超純水復溶，經0.22μm微濾膜過濾，通過半制備型C18反相高效液相色譜柱(10 mm×250 mm)進行進一步分離純化，采用分析型C18反相高效液相色譜柱對組分進行純度鑒定。液相色譜洗脫條件：洗脫液A為超純水(含0.05%體積分數(shù)三氟乙酸)；洗脫液B為乙腈(含0.05%體積分數(shù)三氟乙酸)；0～5 min，5%乙腈水溶液；5～55 min，5%～40%乙腈水溶液；55～65 min，40%乙腈水溶液；流速為2 mL/min;檢測波長為220 nm。收集具有較高活性的洗脫峰，真空冷凍干燥備用。

1.3.3.3 氨基酸序列測定與分析

經RP-HPLC純化后的樣品，采用液相色譜-串聯(lián)質譜聯(lián)用法(HPLC-ESI-Q-TOF/MS)進行氨基酸序列測定及分析。色譜條件為：色譜柱為BEH C18(Φ2.1 mm×100 mm)；流動相為100%乙腈；流速：0.3 mL/min；檢測波長為220nm。質譜參數(shù)：離子方式為ESI+；錐孔電壓為40 V；毛細管電壓為3.5 kV；檢測器電壓為1 700 V；碰撞能量為6 eV；質量范圍為200～3 000m/z。

1.3.4 抗氧化活性檢測

1.3.4.1 DPPH自由基清除活性檢測

DPPH自由基清除活性參考ASOODEH等[7]描述的方法稍作修改。以無水乙醇配制DPPH溶液(0.1 mmol/L)，取500μL樣品溶液與等體積的DPPH自由基溶液混合，常溫避光反應30 min，于517 nm波長處測定吸光值。分別以水和GSH為空白對照和陽性對照，同時設置內參對照組。DPPH自由基清除率計算公式如下：

(1)

式中：Ai為樣品組(自由基+樣品)；Aj為內參對照組(乙醇+樣品)；A0為空白對照組(自由基+水)。

1.3.4.2 ABTS自由基清除活性檢測

ABTS自由基清除活性參照AHMED等[8]報道的方法進行測定。7 mmol/L的ABTS溶液與2.45 mmol/L 的過硫酸鉀溶液以體積比1∶1混合，室溫避光反應12～16 h產生ABTS自由基離子，以磷酸鹽溶液(5 mmol/L，pH 7.4)稀釋至于734 nm波長處的吸光值為0.7±0.02，將稀釋液與樣品溶液等體積混勻反應10 min后于734 nm波長處測定吸光值，分別以水和GSH為空白對照和陽性對照。ABTS自由基清除率計算公式為：

(2)

式中：As為樣品組；A0為空白對照組。

1.3.4.3 超氧陰離子自由基清除活性檢測

超氧陰離子自由基清除活性參考SISWOYO等[9]描述的方法。采用鄰苯三酚法進行測定。樣品與Tris-HCl緩沖液(50 mmol/L,pH 8.3)等體積(400 μL)混勻，于25 ℃條件下靜置10 min，加入100 μL的焦棓酸溶液(1.5 mmol/L,溶于1.0 mmol/L的HCl中)反應5 min。于320 nm處測定吸光值，每隔30 s測定1次，分別以水和GSH作為空白對照和陽性對照。超氧陰離子自由基清除活性的計算公式如下：

超氧陰離子自由基清除率/%=

(3)

式中:ΔAo/min為空白組的吸光值曲線斜率；ΔAs/min為樣品組的吸光值曲線斜率。

1.3.4.4 抑制亞油酸過氧化能力

亞油酸自氧化體系建立參照ZHANG等[10]的方法稍作修改，以無水乙醇配制亞油酸(體積分數(shù)為2.5%),將1.0 mL的多肽樣品(1.0 mg/mL)、1.0 mL亞油酸、2.0 mL磷酸鹽溶液(50 mmol/L, pH 7.0)和1.0 mL超純水置于具塞試管中，于37 ℃條件下，避光反應7 d，分別以水和Vc作為空白對照和陽性對照。每隔1 d測定1次亞油酸的氧化程度，亞油酸氧化程度依照硫氰酸鉀(FTC)法[11]測定。

2 結果與討論

2.1 胡蘿卜籽蛋白含量測定結果

采用凱式定氮法測得胡蘿卜籽中總蛋白含量為(23.57±0.14)%。

2.2 Sephadex G-25 凝膠過濾色譜分離

胡蘿卜籽抗氧化肽凍干粉用超純水復溶，采用Sephadex G-25 凝膠過濾色譜初步分離，分離后的洗脫峰曲線及各洗脫峰的抗氧化活性如圖1所示[12]，胡蘿卜籽抗氧化肽粗品被分為4個組分(F1，F(xiàn)2，F(xiàn)3，F(xiàn)4)，其中組分F1的DPPH自由基清除活性最高，組分F3次之。由于組分F1收集液顏色較深，推測其中可能含有其他物質具有較高的抗氧化活性，而組分F3在柱中保留時間較長，其分子質量較小，有報道指出，小分子多肽具有更強的抗氧化活性[13]，故收集組分F3進行進一步的高效液相色譜分離。

A-抗氧化肽粗品Sephadex G-25色譜圖;B-各組分DPPH自由基清除率圖1 抗氧化肽粗品Sephadex G-25色譜圖以及各組分DPPH自由基清除率Fig.1 Separation of peptide by Sephadex G-25 and DPPH radical scavenging activity of fractions obtained by gel filtration chromatography

2.3 組分F3高效液相色譜分離

采用半制備型C18柱RP-HPLC色譜對組分F3進一步分離純化，結果見圖2。

組分F3成分復雜，對各洗脫峰進行活性測定，結果表明其中有2個洗脫峰活性較高，分別將其命名為F3-a、F3-b。當樣品質量濃度為0.5 mg/mL時, F3-a和F3-b的DPPH自由基清除率分別為(90.66±2.71)%、(84.47±0.19)%。此外，經分析型C18RP-HPLC進行純度鑒定得F3-a和F3-b呈單一峰(圖3)，說明已達到色譜純，故收集F3-a和F3-b兩個洗脫組分進行氨基酸序列分析。

圖2 組分F3高效液相色譜圖Fig.2 RP-HPLC chromatogram of component F3

圖3 組分F3-a和F3-b純度鑒定Fig.3 Evaluation the purity of fraction F3-a and F3-b from RP-HPLC

2.4 抗氧化肽的分子質量及序列測定

采用液質聯(lián)用儀對組分F3-a和F3-b進行分子質量及氨基酸序列的測定，質譜圖結果如圖4所示。

由質譜圖分析得：F3-a為一個六肽，氨基酸序列為Lys-Asp-Asn-Phe-Leu-Phe(KDNFLF),分子質量為782.32 Da；F3-b為一個二肽，氨基酸序列為Leu-Phe(LF),分子質量為278.16 Da。有研究指出，含2～20個氨基酸的活性肽可以穿過膜屏蔽并在組織水平上發(fā)揮多種生物活性[14]。分子質量越小越容易穿過屏障，靠近缺電子基團，增強肽的活性[15-16]。有報道表明分子質量小于1 kDa的肽表現(xiàn)出較強抗氧化活性[17]，JE等[18]以阿拉斯加鱈魚蛋白為原料進行酶解得到的抗氧化肽，發(fā)現(xiàn)分子質量小于1 kDa的多肽抗氧化活性最強。本文從胡蘿卜籽蛋白中分離鑒定得到的兩條肽鏈KDNFLF和LF分子質量均小于1 kDa，因而可能具有較強的抗氧化活性。此外，抗氧化肽的活性大小也受其氨基酸組成的影響，有研究認為，一些具有特殊結構的氨基酸對抗氧化活性貢獻最大，如芳香族氨基酸(Phe,Tyr,Trp),側鏈含咪唑基的組氨酸(His),以及含硫的氨基酸(Cys,Met)等[11,19-20]。本文中的2條多肽均在C端含有一個Phe, Phe側鏈含有苯環(huán)使得Phe具有供氫能力，增強了多肽的抗氧化活性。

A-KDNFLF;B-LF圖4 抗氧化肽質譜圖及結構式Fig.4 Mass spectra of antioxidant peptides and their structural formula

2.5 合成肽的體外抗氧化活性檢測

由質譜鑒定得到的抗氧化肽KDNFLF和LF委托上海吉爾生化公司合成，其純度達98%以上。以還原型谷胱甘肽(GSH)為陽性對照，考察KDNFLF和LF的抗氧化活性，結果見圖5。

A-ABTS自由基清除活性；B-超氧陰離子自由基清除活性;C-抑制亞油酸氧化能力圖5 抗氧化肽的活性表征Fig.5 Activity characterization of antioxidant peptides

圖5-A、圖5-B分別為不同濃度多肽對ABTS自由基及超氧陰離子自由基的清除活力，多肽對自由基的清除活性均具有濃度依賴性，濃度增大抗氧化活性也隨之增加。結果表明與KDNFLF相比，LF具有更強的抗氧化活性。LF的ABTS自由基清除率為(87.38±0.25)%(250 μg/mL)，活性接近陽性對照GSH(93.21±0.46)%，超氧陰離子自由基清除率為(61.84±0.029)%(2 mg/mL)。SUETSUNA等[21]對抗氧化活性肽段YFYPEL進行不同結構設計，發(fā)現(xiàn)二肽EL的活性要高于原活性肽段，本實驗結果與之相似。這可能是因為較大分子質量的多肽與自由基反應時存在空間位阻，導致多肽的抗氧化活性下降。KDNFLF的C端含有LF肽段，說明LF肽段組合在自由基清除中起重要作用，與長肽鏈相比，短肽具有更強的抗氧化活性。

圖5-C為抑制亞油酸自氧化能力的測定結果，由圖可知，在第2天到第7天肽LF對亞油酸的氧化抑制效果微弱，與空白組無顯著性差異(P>0.05),而肽KDNFLF幾乎不具備脂質過氧化抑制能力。有研究指出疏水性氨基酸能夠加強肽與脂質中自由基的相互作用，阻斷脂質自氧化的鏈式反應[21]。本研究實驗結果中，LF為疏水性多肽，脂質過氧化抑制能力卻較弱。說明抗氧化肽對脂質過氧化的抑能力除與肽的疏水性有關外，還與氨基酸組成和順序有關。

3 結論與展望

本文以胡蘿卜籽蛋白為原料，以DPPH自由基清除率為指標，采用堿性蛋白酶進行酶解制得抗氧化肽；通過Sephadex G-25 凝膠過濾色譜、半制備型RP-HPLC對制得的抗氧化肽進行分離純化，最終篩選出2個抗氧化肽F3-a和F3-b。利用液質聯(lián)用儀對F3-a和F3-b進行分子質量及氨基酸序列測定，測定結果為：F3-a，序列為Lys-Asp-Asn-Phe-Leu-Phe(KDNFLF),分子質量為782.32 Da；F3-b，序列為Leu-Phe(LF),分子質量為278.16 Da。通過ABTS自由基清除率和超氧陰離子自由基清除率2個指標檢測2個肽的抗氧化活力，同時考察了2個肽的脂質過氧化抑制能力。結果表明LF和KDNFLF均具有較強的自由基清除活性，LF表現(xiàn)出微弱的脂質過氧化抑制效果。LF的抗氧化活性高于KDNFLF，說明肽段LF組合在抗氧化中起重要作用。

本文僅研究了胡蘿卜籽抗氧化肽的體外模型的抗氧化活力，可進一步將純化肽進行動物體內模型試驗，更全面體現(xiàn)抗氧化肽的抗氧化活力，為胡蘿卜籽抗氧化肽在醫(yī)藥及食品中的應用提供一定的科學依據(jù)。