趙方圓，李靜媛

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島，266109)

葡萄醋是利用葡萄酒或者葡萄果汁等作為原料發(fā)酵釀造的食醋[1]。葡萄醋中不僅含有白藜蘆醇、花青素等多酚類(lèi)抗氧化活性成分[2]，具有抗衰老、抗氧化、保護(hù)心臟等功效[3～5]，還富含氨基酸、維生素和礦物質(zhì)等，具有保健功能[6]。

傳統(tǒng)葡萄醋發(fā)酵工藝多以固態(tài)發(fā)酵為主，但發(fā)酵周期較長(zhǎng)，勞動(dòng)強(qiáng)度大，占地面積廣，原材料利用率低[7]。新型葡萄醋生產(chǎn)工藝主要是采用液態(tài)發(fā)酵法，通過(guò)酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵，最終得到的產(chǎn)品不但擁有果醋的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，同時(shí)兼?zhèn)淦咸丫频娘L(fēng)格與特征。本研究采用巨峰葡萄為原料，以液態(tài)發(fā)酵技術(shù)，參考葡萄酒酒精發(fā)酵工藝中的相關(guān)技術(shù)來(lái)改進(jìn)葡萄醋的釀造工藝，以期最大化地增加葡萄醋中的營(yíng)養(yǎng)成分和改善風(fēng)味。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

巨峰鮮食葡萄，購(gòu)于青島大潤(rùn)發(fā)超市；活性干酵母，購(gòu)于法國(guó)萊蒙特公司；巴氏醋桿菌，購(gòu)于北京豫鼎鑫捷科技有限公司。

1.1.2 試劑

酒石酸、DL-蘋(píng)果酸、乳酸、檸檬酸、琥珀酸標(biāo)準(zhǔn)品、白藜蘆醇和沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；乙腈購(gòu)自德國(guó)merck公司；果膠酶、葡萄糖、酵母膏、瓊脂粉、NaOH、CaCO3、H2SO3等常規(guī)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

液相色譜儀，日本島津公司；PEN3型便攜式電子鼻，德國(guó)Airsense公司；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，尤尼柯(上海)儀器有限公司；電子分析天平，奧豪斯國(guó)際貿(mào)易(上海)有限公司；TGL-16M高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；pH計(jì)，奧豪斯儀器(上海)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 釀造方法

生產(chǎn)工藝流程：

葡萄→除梗、破碎→入罐→浸漬(12 h)→酒精發(fā)酵→分離、壓榨→調(diào)整酒精度(8%)→醋酸發(fā)酵(30 ℃)→過(guò)濾、離心→滅菌→成品。

在浸漬溫度、酒精發(fā)酵溫度2個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行了對(duì)比試驗(yàn)，參數(shù)設(shè)置見(jiàn)表1。

表1 不同葡萄醋釀造工藝的參數(shù)設(shè)定Table 1 Parameter setting of different grape vinegar brewing process

葡萄破碎：稱(chēng)取1 kg巨峰葡萄，經(jīng)過(guò)除梗破碎后，裝入到2.5 L玻璃罐中，添加30 mg/L SO2，20 mg/L 果膠酶。

酒精發(fā)酵：葡萄破碎浸漬結(jié)束恢復(fù)常溫后，將活化后的酵母加入罐中進(jìn)行發(fā)酵。每天測(cè)定其溫度、比重和糖度，當(dāng)比重和糖度不再變化時(shí)，發(fā)酵結(jié)束。

醋酸發(fā)酵：將部分原酒酒度調(diào)至8%，接入5% 醋酸發(fā)酵種子液，于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)，隨時(shí)測(cè)定醋酸含量的變化，直至醋酸含量不再增加。

后處理：將發(fā)酵完成的原醋于70 ℃下滅菌10 min， 離心(6 000 r/min, 10 min)得到澄清葡萄醋樣品。

1.3.2 檢測(cè)方法

電子鼻檢測(cè)：準(zhǔn)確量取10 mL不同樣品，注入進(jìn)樣瓶中密封30 min后，在室溫(20 ℃)條件下使用電子鼻進(jìn)行檢測(cè)。電子鼻檢測(cè)條件：采樣時(shí)間為3 s/組，檢測(cè)時(shí)間為60 s，傳感器自清洗時(shí)間為180 s。電子鼻傳感器所對(duì)應(yīng)的香氣類(lèi)型見(jiàn)表2。

表2 電子鼻傳感器對(duì)應(yīng)的香氣類(lèi)型Table 2 Aroma types corresponding to sensors of E-nose

色度的測(cè)定：參考陳孜銅等[8]方法測(cè)定色度。

總酸的測(cè)定：參考國(guó)標(biāo)GB/T 15038—2006[9]。

酒精度的測(cè)定：參考國(guó)標(biāo)GB/T 10345—2007[10]。

可溶性固形物的測(cè)定：使用手持折光儀進(jìn)行測(cè)定。

總酚的測(cè)定：采用福林-肖卡試劑比色法[11]測(cè)定。

有機(jī)酸的測(cè)定：利用高效液相色譜，參考陸燕等[12]方法。色譜條件：色譜柱為C18柱，流動(dòng)相為乙腈-0.01 mol/L NH4H2PO4(2∶98)溶液，用磷酸調(diào)pH值至2.70。流速：1.0 mL/min，進(jìn)樣量為30 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，柱溫25 ℃，流動(dòng)相使用前用0.45 μm濾膜過(guò)濾，超聲脫氣。

白藜蘆醇的測(cè)定：利用高效液相色譜，參考劉慶等[13]方法。色譜條件：色譜柱為C18柱，流動(dòng)相為乙腈∶水 =70∶30。流速：1.0 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)306 nm，柱溫30 ℃，流動(dòng)相使用前超聲脫氣。

感官評(píng)價(jià)：選取10名有經(jīng)驗(yàn)的品嘗員對(duì)不同工藝釀造得到的葡萄醋產(chǎn)品進(jìn)行感官評(píng)價(jià)得分，感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)如表3所示。

表3 感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)Table 3 The standard of sensory assessment

1.3.3 數(shù)據(jù)分析

每組設(shè)置3個(gè)平行，使用Microsoft Excel、WinMuster 等軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同釀造工藝對(duì)于酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵的影響

按照1.3.1設(shè)定的3種釀造工藝發(fā)酵葡萄醋，獲得酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵的相關(guān)數(shù)據(jù)如表4所示。

表4 不同釀造工藝對(duì)酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵的影響Table 4 Effects of different fermentation processes on alcohol fermentation and acetic acid fermentation

由于2號(hào)酒精發(fā)酵溫度低，酵母啟動(dòng)酒精發(fā)酵的時(shí)間長(zhǎng)，其酒精發(fā)酵的時(shí)間也較長(zhǎng)，但從表4來(lái)看，3種樣品在最終酒度上無(wú)明顯差異。在醋酸發(fā)酵方面，可以明顯看出，進(jìn)行過(guò)高溫浸漬的2和3號(hào)樣品，雖然醋酸發(fā)酵時(shí)間略長(zhǎng)于常溫浸漬的1號(hào)樣品，但最終產(chǎn)酸量卻明顯高于1號(hào)樣品。分析原因可能是高溫浸漬樣品中較高濃度的酚類(lèi)物質(zhì)抑制了醋酸菌的活動(dòng)，使其發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，但較長(zhǎng)的發(fā)酵時(shí)間提高了醋酸的產(chǎn)量。

2.2 不同釀造工藝的葡萄醋樣品的電子鼻檢測(cè)分析

2.2.1 電子鼻對(duì)不同葡萄醋樣品中香氣成分的特征響應(yīng)

利用電子鼻對(duì)1～3號(hào)葡萄醋樣品進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果如圖1所示。

圖1 1～3號(hào)葡萄醋樣品傳感器響應(yīng)圖Fig.1 Graphs of response of 10 sensors to aroma of 1～3 grape vinegar sample

由圖1可以看出， 1～3葡萄醋樣品的傳感器響應(yīng)譜圖曲線形態(tài)分布很接近，說(shuō)明不同的釀造工藝并沒(méi)有根本改變葡萄醋的香氣類(lèi)型。3種葡萄醋中香氣成分較明顯的，依次為芳香成分、有機(jī)硫化物(9號(hào)傳感器)、醇類(lèi)(8號(hào)傳感器)、甲烷(6號(hào)傳感器)、硫化物(7號(hào)傳感器)和氮氧化合物(2號(hào)傳感器)。從信號(hào)強(qiáng)度來(lái)看，常溫浸漬、常溫發(fā)酵的1號(hào)樣品的香氣濃度明顯高于其他兩種高溫浸漬工藝發(fā)酵的2號(hào)和3號(hào)樣品。由此可知高溫浸漬的釀造工藝，會(huì)導(dǎo)致葡萄汁香氣成分散失較多，從而降低了葡萄醋的香氣。

2.2.2 不同葡萄醋樣品的PCA主成分分析

圖2為不同釀造工藝的葡萄醋香氣的主成分分析(principal component analysis，PCA)圖中不同顏色的橢圓分別代表3種釀造工藝的葡萄醋樣品的數(shù)據(jù)采集點(diǎn)。通過(guò)PCA分析知，第一主成分區(qū)分貢獻(xiàn)率為99.77%，第二主成分區(qū)分貢獻(xiàn)率為0.23%，第一、第二主成分總的區(qū)分貢獻(xiàn)率為100.00%，則這兩個(gè)主成分基本代表了樣品的主要特征信息。通過(guò)圖2主成分PC1和PC2兩個(gè)主軸上看，3種食醋分布在不同區(qū)域，能很好地被區(qū)分開(kāi)。說(shuō)明不同的釀造工藝對(duì)葡萄醋香氣產(chǎn)生明顯影響。

圖2 不同釀造工藝的葡萄醋香氣的PCA主成分分析圖Fig.2 PCA analysis for aroma of different brewing process of grape vinegar

2.2.3 不同葡萄醋樣品的LDA線性判別分析

由圖3發(fā)現(xiàn)，按照線性判別分析法(linear discrimination analysis， LDA)，第一主成分區(qū)分貢獻(xiàn)率高達(dá)100.00%，基本代表了樣品的主要特征信息。通過(guò)LDA分析，3種食醋非常集中地分布在3個(gè)不同區(qū)域，說(shuō)明不同的釀造工藝釀出的葡萄醋具有明顯差異，能夠被明顯區(qū)分。

圖3 不同釀造工藝的葡萄醋的LDA線性判別分析Fig.3 LDA analysis for aroma components of different brewing process of grape vinegar

2.3 不同釀造工藝對(duì)葡萄醋樣品營(yíng)養(yǎng)成分的影響

2.3.1對(duì)可溶性固形物含量的影響

對(duì)1～3號(hào)葡萄醋樣品中可溶性固形物進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖4所示。

圖4 不同釀造工藝對(duì)葡萄醋中可溶性固形物含量的影響Fig.4 Effects of different brewing processes on the content of soluble solids in grape vinegar

由圖4可知，使用低溫發(fā)酵高溫浸漬工藝的2號(hào)樣品中可溶性固形物含量明顯高于其他2組常溫發(fā)酵樣品。由此推測(cè)：較低的發(fā)酵溫度，可能降低了酵母菌代謝消耗所需能量，從而減少可溶性固形物(如葡萄糖或果糖)的損失。此外，同樣是常溫發(fā)酵的1號(hào)樣品和3號(hào)樣品，高溫浸漬的3號(hào)樣品中可溶性固形物的含量較高。由此得出：較高的浸提溫度可以從葡萄汁中浸提出更多可溶性物質(zhì)，從而最終葡萄醋產(chǎn)品中的可溶物含量也更高。

2.3.2 對(duì)色度、多酚、白藜蘆醇含量的影響

利用紫外分光光度儀、高效液相色譜儀對(duì)1～3號(hào)葡萄醋樣品的色度、多酚、白藜蘆醇含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 不同釀造工藝中的葡萄醋色度、多酚和白藜蘆醇含量Table 5 Effects of different brewing processes on chromaticity, polyphenol and resveratrol content in grape vinegar

葡萄醋色度值的大小，主要是由葡萄醋中的酚類(lèi)物質(zhì)如花色素苷、單寧等決定，酚類(lèi)物質(zhì)含量越高，葡萄醋的色度也就越高。通過(guò)表5可以看出：對(duì)于色度來(lái)說(shuō)，高溫浸漬、低溫發(fā)酵樣品(2號(hào))>常溫浸漬、常溫發(fā)酵樣品(1號(hào))>高溫浸漬、常溫發(fā)酵樣品(3號(hào))，因此高溫浸漬、低溫發(fā)酵最有利于葡萄醋色度的提高。由圖2還可以看出，多酚和白藜蘆醇的含量由多到少依次是：高溫浸漬、低溫發(fā)酵樣品(2號(hào))>高溫浸漬、常溫發(fā)酵樣品(3號(hào))>常溫浸漬、常溫發(fā)酵樣品(1號(hào))。這與色度結(jié)果的規(guī)律基本吻合，可以得出結(jié)論：酒精發(fā)酵過(guò)程中，使用高溫浸漬的方法可以更多地融入葡萄皮中的酚類(lèi)物質(zhì)，色度也越深；而較低發(fā)酵的溫度，延長(zhǎng)了酒精發(fā)酵的時(shí)間，這可能也會(huì)導(dǎo)致酚類(lèi)物質(zhì)含量的明顯增加。

2.3.3 對(duì)有機(jī)酸種類(lèi)和含量的測(cè)定及分析

通過(guò)液相色譜儀對(duì)酒石酸、DL-蘋(píng)果酸、乳酸、檸檬酸和琥珀酸5種有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行色譜分析獲得圖5。色譜圖中存在6個(gè)主峰，從左至右依次為酒石酸、L-蘋(píng)果酸、乳酸、檸檬酸、D-蘋(píng)果酸、琥珀酸。由于葡萄醋中存在的蘋(píng)果酸主要為L(zhǎng)-蘋(píng)果酸，所以本次研究只對(duì)L-蘋(píng)果酸進(jìn)行分析。通過(guò)對(duì)圖5的分析，確定5種有機(jī)酸的出峰時(shí)間。將1～3號(hào)樣品進(jìn)行色譜分析，以樣品3的色譜圖(圖6)為例，根據(jù)出峰時(shí)間，可知圖6中峰1為酒石酸、峰2為L(zhǎng)-蘋(píng)果酸、峰3為乳酸、峰4為檸檬酸、峰5為琥珀酸。

圖5 5種有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.5 The chromatograms of 5 kinds of organic acid standard

圖6 3號(hào)樣品中有機(jī)酸色譜圖Fig.6 The organic acid chromatogram of No.3 sample

通過(guò)對(duì)1～3號(hào)樣品的色譜圖分析，根據(jù)5種有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間及線性回歸方程(R2=0.996 1～0.999)，計(jì)算出3種葡萄醋樣品中5種有機(jī)酸的含量如圖7所示。高溫浸漬的2號(hào)和3號(hào)樣品各項(xiàng)有機(jī)酸含量明顯高于常溫浸漬的1號(hào)樣品。分析原因可能是高溫浸漬使更多有機(jī)酸溶解到葡萄汁中，從而最終葡萄醋樣品中有機(jī)酸含量較高。

圖7 不同釀造工藝對(duì)葡萄醋中5種有機(jī)酸濃度的影響Fig.7 Effects of different brewing processes on the concentration of five organic acids in vinegar

此外，低溫發(fā)酵、高溫浸漬的2號(hào)樣品中乳酸和檸檬酸含量均高于常溫發(fā)酵、高溫浸漬的3號(hào)樣品，酒石酸和蘋(píng)果酸低于3號(hào)樣品，琥珀酸差異不明顯。分析原因可能是低溫發(fā)酵過(guò)程中，一部分酸如酒石酸等，會(huì)由于發(fā)酵溫度較低導(dǎo)致溶解度下降。由于酒石酸和蘋(píng)果酸同屬于二元酸，在口感上顯得尖酸刺口，過(guò)多的蘋(píng)果酸和酒石酸會(huì)導(dǎo)致葡萄醋口感粗糙，不夠柔和。由此推測(cè)，2號(hào)樣品在口感上會(huì)優(yōu)于3號(hào)樣品。

2.4 不同釀造工藝的葡萄醋樣品的質(zhì)量感官評(píng)定

對(duì)3種葡萄醋樣品的質(zhì)量感官評(píng)價(jià)見(jiàn)表6。常溫浸漬、常溫發(fā)酵的1號(hào)樣品的香氣最濃郁、厚重，但酸感較弱、較平淡。通過(guò)高溫浸漬的2號(hào)和3號(hào)樣品風(fēng)味口感較常溫浸漬(1號(hào))樣品更豐富，多樣。但3號(hào)樣品的口感略顯酸澀、較粗糙，且色澤較暗淡。而低溫發(fā)酵的2號(hào)樣品在口感的柔和度和協(xié)調(diào)性上要優(yōu)于常溫發(fā)酵的1號(hào)和3號(hào)樣品。因此2號(hào)葡萄醋樣品的感官評(píng)價(jià)得分最高，質(zhì)量最好。

表6 不同釀造工藝葡萄醋樣品質(zhì)量感官評(píng)定表Table 6 The quality sensory evaluation table of different brewing process grape vinegar samples

3 結(jié)論

本研究以巨峰葡萄為原料，參考葡萄酒酒精發(fā)酵工藝中的相關(guān)技術(shù)，采用不同的浸漬溫度和酒精發(fā)酵溫度的釀造方法來(lái)改進(jìn)葡萄醋的發(fā)酵工藝。結(jié)果表明：采用電子鼻系統(tǒng)中的PCA和LDA分析，發(fā)現(xiàn)這2種方法均能準(zhǔn)確分區(qū)開(kāi)3種不同釀造工藝的葡萄醋樣品，由此說(shuō)明不同的釀造工藝確實(shí)對(duì)葡萄醋的香氣產(chǎn)生了較大的影響。對(duì)葡萄醋樣品中各成分的進(jìn)一步分析、品評(píng)獲得采用高溫浸漬、低溫發(fā)酵的葡萄醋樣品：含有最多的可溶性固形物及酚類(lèi)物質(zhì)，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值；各類(lèi)有機(jī)酸含量適宜——口感較柔和的乳酸含量較高，而口感較尖銳的蘋(píng)果酸、酒石酸含量較低；具有最柔和的口感和酸爽的口味，且香氣宜人。由此得出，與常溫浸漬和常溫酒精發(fā)酵工藝相比，高溫浸漬、低溫酒精發(fā)酵的葡萄醋釀造工藝可以較好地實(shí)現(xiàn)葡萄醋中的營(yíng)養(yǎng)成分的增加和風(fēng)味的改善。