王旦旦，呂 琳，陳智如，饒進(jìn)軍

(南方醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣州 510515)

2018年全國(guó)癌癥報(bào)告顯示，卵巢癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其病死率高居?jì)D科腫瘤之首，其中卵巢上皮癌約占60%[1]。肺癌則是我國(guó)各地區(qū)男性發(fā)病率及病死率最高的惡性腫瘤[2]，而肺腺癌是最常見的肺癌類型，約占50%[3]。在晚期卵巢上皮癌及肺腺癌患者中，以順鉑等鉑類藥物為基礎(chǔ)的化學(xué)療法常被用于一線治療[4]，而腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑產(chǎn)生耐藥性是影響其臨床治療效果和患者預(yù)后的一大難題[5]。研究表明，腫瘤一旦對(duì)順鉑形成耐藥性，則第二代的卡鉑及第三代的奧沙利鉑臨床治療效果也明顯減弱。鑒于以上事實(shí)，逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性是當(dāng)前抗腫瘤研究的一個(gè)重要方向。腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑耐藥的形成是一個(gè)由多種因素共同參與調(diào)控的復(fù)雜過程[6]，其產(chǎn)生的基礎(chǔ)是基因的差異表達(dá)。因此，通過高通量的基因芯片技術(shù)和生物信息學(xué)方法全面檢測(cè)與腫瘤順鉑耐藥相關(guān)的基因?qū)Τ醪教骄宽樸K耐藥的發(fā)生機(jī)制具有非常重要的意義[7]。

以往有關(guān)順鉑耐藥機(jī)制的研究往往只針對(duì)一種腫瘤細(xì)胞，由于卵巢上皮癌和肺腺癌均選用順鉑作為其一線化療藥物且都容易導(dǎo)致耐藥，因此本研究基于已發(fā)表的人卵巢上皮癌及肺腺癌順鉑耐藥基因芯片數(shù)據(jù)，利用生物信息學(xué)方法分析共同差異基因并運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)進(jìn)行驗(yàn)證，同時(shí)分析差異基因表達(dá)對(duì)患者預(yù)后的影響，旨在篩選出在不同腫瘤細(xì)胞順鉑耐藥形成中共同起作用的關(guān)鍵基因，為臨床尋找逆轉(zhuǎn)順鉑耐藥和改善患者預(yù)后的新靶標(biāo)提供理論基礎(chǔ)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1基因芯片數(shù)據(jù)收集 從基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)GEO(www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)中下載得到ID號(hào)為GSE33482的卵巢上皮癌mRNA芯片數(shù)據(jù)及ID號(hào)為GSE108214的肺腺癌mRNA芯片數(shù)據(jù)，其中GSE33482包含6例人卵巢上皮癌順鉑耐藥細(xì)胞株A2780/DDP標(biāo)本和6例人卵巢上皮癌親本敏感細(xì)胞株A2780標(biāo)本；GSE108214包含5例人肺腺癌順鉑耐藥細(xì)胞株A549/DDP標(biāo)本和4例人肺腺癌親本敏感細(xì)胞株A549標(biāo)本。

1.2方法

1.2.1共同差異基因篩選 將GSE33482和GSE108214中的芯片數(shù)據(jù)導(dǎo)入R語言(https://www.r-project.org/)軟件中，使用affy包對(duì)上述兩個(gè)芯片的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾和標(biāo)準(zhǔn)化處理，并運(yùn)用Limma包中的經(jīng)驗(yàn)貝葉斯方法分別篩選出差異表達(dá)基因，篩選閾值設(shè)為校正后P<0.05，差異表達(dá)倍數(shù)|logFC|≥1，然后使用edgeR包繪制差異基因的熱圖。運(yùn)用VENNY2.1(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)在線工具，分別對(duì)在卵巢上皮癌及肺腺癌耐藥株中表達(dá)均為上調(diào)或下調(diào)的差異基因取交集得到共同差異基因。下述的生物信息學(xué)分析均只對(duì)共同差異基因進(jìn)行分析。

1.2.2共同差異基因富集分析 將共同差異基因分別導(dǎo)入Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)(http://metascape.org/gp/index.html)中進(jìn)行GO功能和KEGG通路富集分析(設(shè)定參數(shù)：Overlap≥3，Enrichment≥1.5)。通過Fisher Exact Test計(jì)算P值，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2.3蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析 運(yùn)用String10.5(https://string-db.org)構(gòu)建共同差異基因的蛋白相互作用(protein-protein interaction network，PPI)網(wǎng)絡(luò)，將最低互作分值設(shè)置成高度可信(high confidence=0.7)，并將分析結(jié)果轉(zhuǎn)入Cytoscape軟件中進(jìn)行可視化處理，然后通過軟件中的Network analyzer插件篩選出節(jié)點(diǎn)較多的關(guān)鍵基因并構(gòu)建PPI核心網(wǎng)絡(luò)。

1.2.4qRT-PCR驗(yàn)證基因表達(dá) 分別收集本實(shí)驗(yàn)室保存的卵巢上皮癌順鉑耐藥細(xì)胞株A2780/DDP及親本敏感株A2780與肺腺癌順鉑耐藥細(xì)胞株A549/DDP及親本敏感株A549，運(yùn)用Trizol提取總RNA。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser,Takara)說明書合成cDNA，然后根據(jù)SYBR定量PCR試劑盒(TB GreenTMPremix Ex TaqTM,Takara)操作步驟配制反應(yīng)體系，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)儀(LightCycler96,Roche)上進(jìn)行反應(yīng)。選用甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)基因作為內(nèi)參基因，各基因引物序列見表1。分別以A2780及A549中各基因的mRNA表達(dá)水平為對(duì)照，根據(jù)2-△△Ct值計(jì)算關(guān)鍵差異基因在A2780/DDP及A549/DDP中mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.5生存分析 使用Kaplan-Meier Plotter(http://kmplot.com/analysis/)分析關(guān)鍵差異基因的表達(dá)對(duì)卵巢癌和肺腺癌患者生存率的影響，采用Kaplan-Meier法分析并繪制生存曲線，通過Log-rank檢驗(yàn)法比較生存曲線的差異，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1篩選的共同差異基因 在A2780/DDP與A2780之間共篩選得到2 457個(gè)在耐藥細(xì)胞株中表達(dá)上調(diào)和1 496個(gè)表達(dá)下調(diào)的差異基因；在A549/DDP與A549之間共篩選得到1 718個(gè)在耐藥株細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)和1 512個(gè)表達(dá)下調(diào)的差異基因(校正后P<0.05，|logFC|≥1)。差異基因的熱圖見圖1A、B。分別對(duì)在兩種耐藥細(xì)胞株中表達(dá)上調(diào)和下調(diào)的差異基因取交集，最終得到295個(gè)表達(dá)上調(diào)和176個(gè)表達(dá)下調(diào)的共同差異基因，見圖1C、D。

表1 qRT-PCR引物序列

A：芯片GSE33482差異基因熱圖；B：芯片GSE108214差異基因熱圖；C：表達(dá)上調(diào)差異基因韋恩圖；D：表達(dá)下調(diào)差異基因韋恩圖

圖1篩選的共同差異基因熱圖及韋恩圖

表2 共同差異基因的GO功能和KEGG通路富集分析(部分)

2.2共同差異基因的GO功能和KEGG通路富集分析 富集分析結(jié)果(P<0.05和FDR<0.05)顯示，在耐藥株中表達(dá)上調(diào)的共同差異基因主要富集于損傷修復(fù)、輔助性T淋巴細(xì)胞17(Th17)細(xì)胞分化和磷脂酰肌醇-3-激酶/絲蘇氨酸蛋白激酶(PI3K-AKT)信號(hào)通路等；表達(dá)下調(diào)的共同差異基因則主要富集于細(xì)胞黏附、軸突導(dǎo)向和細(xì)胞因子間受體相互作用等，見表2。

2.3蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析 蛋白互作分析得到包含273個(gè)節(jié)點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)。其中，PPI核心網(wǎng)絡(luò)由相互作用關(guān)系較高的10個(gè)關(guān)鍵基因RIPK4、JUN、PRKCA、JAK1、HSPA1A、HSPB1、PLCB1、GNG4、SHC1和CXCL1構(gòu)成。PPI核心網(wǎng)絡(luò)與其他節(jié)點(diǎn)有較多連接，提示上述基因可能起關(guān)鍵作用，見圖2。

A：共同差異基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖；B：關(guān)鍵差異基因核心網(wǎng)絡(luò)圖

2.4qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果 運(yùn)用qRT-PCR驗(yàn)證10個(gè)關(guān)鍵差異基因的mRNA表達(dá)情況。RIPK4、JUN、PRKCA、JAK1、HSPA1A、PLCB1、GNG4、SHC1基因在A2780/DDP及A549/DDP細(xì)胞中的mRNA表達(dá)水平均分別高于A2780及A549細(xì)胞(P<0.05)，CXCL1基因在A2780/DDP及A549/DDP細(xì)胞中的mRNA表達(dá)水平低于A2780及A549細(xì)胞 (P<0.05)，與芯片結(jié)果一致。但HSPB1在A2780/DDP中的mRNA表達(dá)水平卻低于A2780，與芯片數(shù)據(jù)不一致，見圖3。

2.5生存分析 分析關(guān)鍵差異基因RIPK4、JUN、PRKCA、JAK1、HSPA1A、PLCB1、GNG4、SHC1和CXCL1基因的表達(dá)水平與卵巢癌和肺腺癌患者生存率之間的關(guān)系。僅GNG4和PRKCA基因的表達(dá)改變與兩種腫瘤患者的生存率呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，即GNG4和PRKCA高表達(dá)患者的生存率均明顯低于低表達(dá)患者，見圖4。

A：人卵巢上皮癌順鉑耐藥細(xì)胞株A2780/DDP;B：人肺腺癌順鉑耐藥細(xì)胞株A549/DDP；a：P<0.05，與A2780比較；b：P<0.01，與A2780比較；c：P<0.05，與A549比較；d：P<0.01，與A549比較

A：GNG4的表達(dá)與卵巢癌患者總生存率的Kaplan-Meier曲線；B：PRKCA的表達(dá)與卵巢癌患者總生存率的Kaplan-Meier曲線；C：GNG4的表達(dá)與肺腺癌患者總生存率的Kaplan-Meier曲線；D：PRKCA的表達(dá)與肺腺癌患者總生存率的Kaplan-Meier曲線

3 討 論

卵巢癌與肺癌是嚴(yán)重威脅人類生命健康的惡性腫瘤。在過去幾十年里，盡管分子靶向治療等新型治療方案的發(fā)展大大提高了患者的生存率，但靶向治療往往存在適用范圍小、治療費(fèi)用高等問題，因此以鉑類藥物為基礎(chǔ)的傳統(tǒng)化學(xué)療法仍然是大多數(shù)卵巢癌及肺癌患者最主要的治療手段。而腫瘤細(xì)胞順鉑耐藥性的產(chǎn)生，則是導(dǎo)致化療失敗最主要的原因?，F(xiàn)有研究顯示，腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑耐藥的形成是多方面的，包括鉑的聚集、鉑的失活、DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞衰老、凋亡、自噬及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等，幾乎涵蓋了調(diào)節(jié)細(xì)胞生存的所有方面，且往往是多因素同時(shí)存在的，這也是目前缺乏有效逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞對(duì)鉑類藥物耐藥的主要原因。研究表明，基因的表達(dá)改變是腫瘤細(xì)胞耐藥發(fā)生的重要基礎(chǔ)，因此，利用基因芯片篩選出與順鉑耐藥相關(guān)的關(guān)鍵基因，可作為初步闡明順鉑耐藥機(jī)制的重要手段。本研究通過GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中卵巢上皮癌及肺癌順鉑耐藥與親本敏感細(xì)胞株的基因芯片表達(dá)數(shù)據(jù)集篩選得到295個(gè)表達(dá)上調(diào)和176個(gè)表達(dá)下調(diào)的共同差異基因，提示這些基因可能與順鉑耐藥的形成相關(guān)。GO與KEGG富集分析結(jié)果顯示，共同差異基因主要富集于細(xì)胞損傷修復(fù)、Th17細(xì)胞分化、PI3K-Akt信號(hào)通路、細(xì)胞黏附、軸突導(dǎo)向和細(xì)胞因子間受體相互作用等主要與順鉑耐藥形成相關(guān)的DNA損傷修復(fù)和細(xì)胞凋亡等過程及通路。

本研究通過在線數(shù)據(jù)庫(kù)STRING對(duì)共同差異基因進(jìn)行蛋白互作分析，篩選得到節(jié)點(diǎn)較多的10個(gè)關(guān)鍵基因，其中9個(gè)在耐藥株中的表達(dá)高于其親本敏感株，分別為RIPK4、JUN、PRKCA、JAK1、HSPA1A、HSPB1、PLCB1、GNG4、SHC1，而CXCL1在耐藥株中的表達(dá)則低于敏感株。通過qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)除HSPB1外，其余9個(gè)關(guān)鍵基因表達(dá)情況與芯片結(jié)果一致。RIPK4是一個(gè)受體相互作用蛋白激酶，研究表明，RIPK4能增強(qiáng)Wnt信號(hào)通路從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的增殖能力并降低腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑等藥物的敏感性，減少順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡進(jìn)而導(dǎo)致耐藥[8]。JUN是AP1復(fù)合物的重要組成部分且在多種腫瘤細(xì)胞中過表達(dá)，它可通過不同機(jī)制拮抗p53的促凋亡活性，這也可能是高表達(dá)JUN導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑敏感性降低的重要原因[9]。PRKCA是蛋白激酶C家族的成員。FU等[10]研究表明，過表達(dá)PRKCA可通過激活粘著斑激酶(FAK)和下游信號(hào)如Ras和PI3K/AKT導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)順鉑耐藥。JAK1則屬于非受體酪氨酸激酶家族，它的底物為STAT，JAK/STAT通路的持續(xù)活化可通過上調(diào)抗凋亡基因的表達(dá)抑制順鉑誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞耐藥[11]。HSPA1A屬于熱休克蛋白家族，研究者發(fā)現(xiàn)它們的表達(dá)升高與腫瘤患者的不良預(yù)后及對(duì)順鉑的抗性相關(guān)[12]。PLCB1屬于PLC酶家族，SENGELAUB等[13]研究發(fā)現(xiàn)，PLCB1高表達(dá)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移。而GNG4被認(rèn)為是一個(gè)潛在的腫瘤治療靶點(diǎn)，PAL等[14]研究認(rèn)為其高表達(dá)同樣可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移。有關(guān)腫瘤細(xì)胞遷移與順鉑耐藥形成之間的關(guān)系尚未明確，但WACLAW等[15]研究指出，細(xì)胞的遷移性可能是影響腫瘤耐藥性的關(guān)鍵因素。SHC1在多種腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮致癌作用。AN等[16]研究表明，SHC1的過表達(dá)可顯著抑制凋亡，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的持續(xù)增殖和耐藥。以上結(jié)果初步表明，在耐藥株中高表達(dá)的關(guān)鍵基因都可能導(dǎo)致順鉑耐藥的產(chǎn)生。而低表達(dá)的CXCL1是一個(gè)趨化因子，ACHARYYA等[17]發(fā)現(xiàn)，阻斷CXCL1的表達(dá)能提高化療的有效性，而芯片結(jié)果卻顯示，CXCL1在敏感株細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于耐藥株，提示CXCL1在卵巢上皮癌及肺腺癌順鉑耐藥的形成中可能不起主要作用，這也充分說明了順鉑耐藥的形成是一個(gè)由多因素、多因子參與的復(fù)雜過程。

以上結(jié)果表明，在卵巢上皮癌及肺腺癌耐藥細(xì)胞株中RIPK4、JUN、PRKCA、JAK1、HSPA1A、PLCB1、GNG4、SHC1基因的高表達(dá)可能是其耐藥形成的重要原因。為了探究耐藥相關(guān)基因的表達(dá)是否影響卵巢癌及肺腺癌患者的生存率，本研究對(duì)上述8個(gè)耐藥相關(guān)基因進(jìn)行了生存分析，結(jié)果顯示，僅PRKCA和GNG4基因的表達(dá)與卵巢上皮癌及肺腺癌患者的總生存率呈負(fù)相關(guān)，表明當(dāng)靶向PRKCA和GNG4使其表達(dá)下調(diào)時(shí)，不但能提高卵巢上皮癌及肺腺癌對(duì)順鉑的敏感性，還能提高患者的生存率，改善患者的預(yù)后。而當(dāng)靶向其他高表達(dá)的關(guān)鍵基因時(shí)，雖具有逆轉(zhuǎn)順鉑耐藥的潛能，但并不能改善患者的預(yù)后。

綜上所述，本研究應(yīng)用生物信息學(xué)方法綜合分析并驗(yàn)證了卵巢上皮癌與肺腺癌順鉑耐藥的共同差異基因，結(jié)果得到了8個(gè)關(guān)鍵基因RIPK4、JUN、PRKCA、JAK1、HSPA1A、PLCB1、GNG4、SHC1，提示這8個(gè)基因可能在多種以順鉑為一線化療藥物的腫瘤耐藥形成中起關(guān)鍵作用，為從分子水平更深入探究順鉑耐藥發(fā)生、發(fā)展的共同機(jī)制提供了重要思路。此外，GNG4和PRKCA基因的表達(dá)還與提高卵巢癌及肺腺癌患者總生存率密切相關(guān)，提示其可能作為逆轉(zhuǎn)順鉑耐藥和改善患者預(yù)后的生物學(xué)新靶標(biāo)。