生物物證DNA污染的成因與預(yù)防

張飛，黎波

（新疆警察學(xué)院，新疆烏魯木齊 830000）

生物物證作為證據(jù)物證的一種，主要包括人源性生物物證和非人源性生物物證[1]。人源性物證主要包括骨片、毛發(fā)、組織塊、血痕等組織器官，精液（精斑）、唾液（唾液斑）、糞便、尿、羊水、嘔吐物等分泌物和排泄物，此外還有指紋、唇紋、咬痕、足跡（赤足）等。非人源性生物物證主要有動(dòng)物、植物、昆蟲(chóng)和微生物等物證，如某些動(dòng)物的血液（痕）、體液（斑），某些植物的液汁或其斑痕及其提取物等，一些可用以推斷死后間隔時(shí)間和所到區(qū)域的昆蟲(chóng)或土壤中含有的包括各種細(xì)菌、真菌在內(nèi)的微生物等群體。

生物物證技術(shù)是在傳統(tǒng)法醫(yī)物證檢驗(yàn)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一門(mén)新興學(xué)科，廣泛應(yīng)用于刑事、民事案件的偵查檢驗(yàn)、鑒定。該學(xué)科涉及生物化學(xué)、分子生物學(xué)、基因工程、法醫(yī)學(xué)、人類學(xué)等多門(mén)自然學(xué)科[2]。因此，生物物證在自然科學(xué)技術(shù)發(fā)展的基礎(chǔ)上，在刑事案件中對(duì)于人源性生物檢材的種屬認(rèn)定起到關(guān)鍵性作用。隨著DNA提取技術(shù)以及二代測(cè)序技術(shù)的不斷完善，高通量測(cè)序在刑事案件人源性生物檢材的分析越來(lái)越受到重視[3-6]。然而，在實(shí)際生物物證DNA的提取和檢測(cè)過(guò)程中經(jīng)常會(huì)發(fā)生檢材污染的問(wèn)題，無(wú)論是勘查提取人員的污染還是分析檢驗(yàn)人員的污染都不可避免，嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。本文針對(duì)DNA樣品提取分析過(guò)程常見(jiàn)的污染進(jìn)行分析討論，并提出可行性建議，以期減少檢驗(yàn)過(guò)程的樣品污染。

1 生物物證DNA的污染

造成DNA實(shí)驗(yàn)污染的因素主要分為外因和內(nèi)因，外因主要有:（1）自然形成的污染，主要是生物檢材暴露在環(huán)境中受到雜物的污染；（2）勘察人員在發(fā)現(xiàn)、運(yùn)輸、提取時(shí)造成的污染；（3）發(fā)生在物證流轉(zhuǎn)過(guò)程中導(dǎo)致的污染。內(nèi)因主要有實(shí)驗(yàn)室內(nèi)使用試劑污染、氣溶膠污染、核心設(shè)備污染，此類污染發(fā)生在物證檢驗(yàn)過(guò)程中，不易發(fā)現(xiàn)。

1.1 環(huán)境對(duì)生物檢材的污染

環(huán)境對(duì)生物檢材的污染是最普遍也是不可避免的，由于勘查人員勘查的是靜態(tài)的現(xiàn)場(chǎng)，是經(jīng)過(guò)作案人干擾過(guò)或作案人處理過(guò)的現(xiàn)場(chǎng)，有很多的不確定因素在里面，例如掉在血泊中的煙蒂、帶血的手套、水中的衣物、拋棄在垃圾桶中的物證等等，這些生物檢材在檢測(cè)過(guò)程中都會(huì)受到周圍環(huán)境的污染和干擾。特別是微生物細(xì)胞，或少量的人體脫落細(xì)胞等的污染，研究結(jié)果顯示，至少20個(gè)口腔上皮細(xì)胞或30個(gè)精子細(xì)胞檢測(cè)運(yùn)用Identifiler plus PCR試劑盒（美國(guó)AB公司）檢測(cè)，可以獲得全部分型。因此，越微量的物證越容易被污染。此類污染即使是微生物DNA片段在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)也會(huì)被擴(kuò)增出來(lái)無(wú)法去除，導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果從而干擾分析。

1.2 生物檢材勘查提取過(guò)程造成的污染

現(xiàn)場(chǎng)勘察人員徒手提取物證，或使用未經(jīng)過(guò)消毒滅菌的器具提取物證，以及未及時(shí)更換一次性手套、剪刀、鑷子等情況都容易使樣品污染，另外勘察人員使用吸附性較好棉手套提取造成的吸附性污染，現(xiàn)場(chǎng)物證在運(yùn)輸時(shí)使用的包裝袋混裝、包裝袋破損泄露、包裝袋反復(fù)使用，物證袋生產(chǎn)環(huán)節(jié)出現(xiàn)污染等因素，都可以使檢材受到干擾，誤導(dǎo)檢驗(yàn)結(jié)果。

提取過(guò)程造成的污染，主要是生物物證在實(shí)驗(yàn)室提取檢驗(yàn)時(shí)，操作人員操作不規(guī)范或者環(huán)境不達(dá)標(biāo)等。例如物證進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室后，檢驗(yàn)人員初檢不認(rèn)真，使用不潔器具操作，或者未及時(shí)更換PE離心管、移液槍槍頭等一次性耗材，未清洗或未按規(guī)定更換上樣膠墊等，都容易造成樣本提取時(shí)交叉污染。或者是檢測(cè)人員在檢測(cè)過(guò)程中不小心將自己的唾液或皮屑混入到檢材中，導(dǎo)致“烏龍檢材”的出現(xiàn)，也會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成影響。

1.3 DNA純化試劑、氣溶膠的污染

試劑在配制分裝過(guò)程造成的污染，尤其是移液器操作不當(dāng)，最容易造成污染。特別在PCR擴(kuò)增中最容易導(dǎo)致污染，因?yàn)樵赑CR擴(kuò)增過(guò)程中，擴(kuò)增的DNA產(chǎn)量是呈指數(shù)上升的，經(jīng)過(guò)n個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增，一個(gè)DNA分子的產(chǎn)量便達(dá)到2n個(gè)拷貝。PCR產(chǎn)物一般為 1013拷貝 /mL，取 0.1 mL 即為 109拷貝，而 1 mg人基因組DNA才含1.4×106拷貝的單拷貝基因片段。PCR反應(yīng)具有強(qiáng)大的擴(kuò)增效率，使得極微量的污染便可導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果。

另一種是氣溶膠的污染，主要是由固體或液體小質(zhì)點(diǎn)分散并懸浮在氣體介質(zhì)中形成的膠體，又稱氣體分散體系。分散相為固體或液體小質(zhì)點(diǎn)，其大小為10-3～10-7cm，分散介質(zhì)為氣體。氣溶膠污染的一般原因是離心管管蓋松懈導(dǎo)致泄露，在PCR反應(yīng)中，有高溫、低溫的周期性循環(huán)，高溫時(shí)，擴(kuò)增反應(yīng)液蒸汽溢出，擴(kuò)增儀頂蓋密封不嚴(yán)，多次擴(kuò)增不斷累積，達(dá)到足夠濃度時(shí)造成污染。此類污染難以清除，難以預(yù)測(cè)[7]。

1.4 核心設(shè)備污染

在提取、純化、擴(kuò)增生物檢材DNA時(shí)，常用的儀器設(shè)備有高速冷凍離心機(jī)、恒溫振蕩儀、PCR擴(kuò)增儀、3030XL遺傳學(xué)分析儀等設(shè)備。不按規(guī)定及時(shí)清洗，造成DNA產(chǎn)物分子級(jí)別堆積，形成設(shè)備內(nèi)部污染。比如，有些檢驗(yàn)人員在使用PCR擴(kuò)增儀時(shí)，剛擴(kuò)增完成就急于打開(kāi)設(shè)備取樣，由于PCR擴(kuò)增儀溫度還未降下來(lái)，反應(yīng)體系也處于高溫狀態(tài)下，高溫膨脹使管蓋蹦出，會(huì)形成交叉污染。

2 生物檢材DNA污染對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果的影響

DNA污染可能導(dǎo)致假陽(yáng)性的出現(xiàn)，干擾DNA分型圖譜的分析，誤導(dǎo)偵查人員。DNA污染可能會(huì)產(chǎn)生原本沒(méi)有的DNA信息，也可能會(huì)抑制、消除或完全覆蓋原有的DNA信息，從而造成嚴(yán)重后果[7]。比如可能在原本沒(méi)有犯罪嫌疑人DNA樣本的檢材上檢測(cè)出他的DNA，錯(cuò)誤地刻畫(huà)犯罪嫌疑人，導(dǎo)致錯(cuò)誤的案件定性，錯(cuò)誤地推斷作案人數(shù)、作案人的性別等。這些都會(huì)誤導(dǎo)偵查方向，延誤破案時(shí)間。

3 預(yù)防生物檢材DNA污染的策略

在生物檢材DNA降低污染過(guò)程中，要做好“人防”和“物防”兩方面的工作，“人防”主要指在現(xiàn)場(chǎng)勘查中進(jìn)行生物檢材提取時(shí)，勘察人員首先應(yīng)樹(shù)立防污染的意識(shí)，首先做好自我保護(hù)，做到不污染樣品的同時(shí)也不讓樣品污染自己，勘查提取前先戴好口罩、帽子、防護(hù)服等必要措施，檢查勘查提取工具是否潔凈，確保樣品在源頭無(wú)污染，尤其是防止外來(lái)人源性污染。檢材越微量，越應(yīng)防止外來(lái)人源性污染；因?yàn)闄z材越微量，PCR檢驗(yàn)對(duì)外來(lái)人源性污染越敏感?！拔锓馈敝饕冈趯?shí)驗(yàn)室檢測(cè)過(guò)程中防止實(shí)驗(yàn)試劑、實(shí)驗(yàn)室環(huán)境、核心設(shè)備等對(duì)樣品的污染。

3.1 遵守行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，按程序進(jìn)行提取與檢驗(yàn)

現(xiàn)場(chǎng)勘查人員、檢材送檢人員、物證鑒定人員在生物檢材提取、送檢、檢驗(yàn)過(guò)程中，必須按照中華人民共和國(guó)公共安全行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《法醫(yī)學(xué)物證檢材的提取、保存與送檢》（GA/T169—1997）規(guī)定的相關(guān)內(nèi)容進(jìn)行操作。在實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中嚴(yán)格按照儀器的操作規(guī)程進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)試劑的使用要符合標(biāo)準(zhǔn)，不可使用過(guò)期或污染的試劑。特別是DNA提取過(guò)程使用的試劑，比如酶、超純水、提取液等，都應(yīng)該進(jìn)行分裝和隔離保管。最應(yīng)注意的是移液槍槍頭的使用，必須是一次性的，按照一種試劑一個(gè)槍頭、一個(gè)樣品一個(gè)槍頭的原則，不可重復(fù)使用，交叉使用。

3.2 做好污染監(jiān)測(cè)設(shè)置對(duì)照

必須要時(shí)刻注意污染的監(jiān)測(cè)，監(jiān)測(cè)樣品是否受到污染。通過(guò)有效的監(jiān)測(cè)，采取正確的相應(yīng)措施，防止或消除污染。另外對(duì)照試驗(yàn)也是監(jiān)測(cè)DNA污染的重要手段，所以無(wú)論是擴(kuò)增還是遺傳學(xué)分析都應(yīng)設(shè)置陰性和陽(yáng)性對(duì)照。陰性對(duì)照是每次PCR實(shí)驗(yàn)都必須做的，它包括了標(biāo)本對(duì)照與試劑對(duì)照，通過(guò)對(duì)照確認(rèn)樣本和試劑是否受到污染。陽(yáng)性對(duì)照是對(duì)預(yù)期結(jié)果而設(shè)置的，它是PCR反應(yīng)是否成功的一個(gè)重要的參考標(biāo)志。

3.3 人才培養(yǎng)與培訓(xùn)，提高行業(yè)人員能力

定期對(duì)相關(guān)人員包括現(xiàn)場(chǎng)勘查人員、檢材送檢人員、物證鑒定人員，進(jìn)行業(yè)務(wù)培訓(xùn)和專業(yè)知識(shí)學(xué)習(xí)，提高現(xiàn)場(chǎng)勘查能力和防污染意識(shí)，改變以往的“老牌作風(fēng)”和“經(jīng)驗(yàn)主義”，加強(qiáng)規(guī)范操作，確保檢材質(zhì)。

3.4 實(shí)驗(yàn)室布局與環(huán)境要求要達(dá)標(biāo)

生物物證受理室要和檢驗(yàn)區(qū)完全隔離開(kāi)，初步處理室物品要按照受理順序排好序，并保持潔凈，檢驗(yàn)人員在進(jìn)行物證初級(jí)處理室做好防護(hù)，這是保證樣品不污染的第一道程序。原始試劑混配室應(yīng)為正壓間，操作過(guò)程在超凈臺(tái)內(nèi)完成，須防止其他程序功能間對(duì)本操作間的污染[8]。PCR擴(kuò)增室應(yīng)為微負(fù)壓區(qū)域，必須設(shè)置排風(fēng)系統(tǒng)，以防止大量擴(kuò)增產(chǎn)物擴(kuò)散污染其他程序功能間。檢測(cè)室也應(yīng)為微負(fù)壓間，也必須設(shè)置排風(fēng)系統(tǒng)，以防止擴(kuò)增產(chǎn)物在電泳測(cè)序過(guò)程中的擴(kuò)散污染；整個(gè)區(qū)域要注意溫度控制，因?yàn)镈NA分析儀及其他分析設(shè)備散熱量較大，會(huì)提高室內(nèi)溫度3～5 ℃，所以應(yīng)做好溫度檢測(cè)。

所有實(shí)驗(yàn)區(qū)域要進(jìn)行定期消毒滅菌，紫外燈滅菌在開(kāi)展實(shí)驗(yàn)的2 h前進(jìn)行，檢驗(yàn)區(qū)域溫度控制在23℃左右。定時(shí)清洗維護(hù)核心設(shè)備，確保結(jié)果準(zhǔn)確。

4 結(jié)語(yǔ)

生物物證檢材是DNA分析的原材料，避免檢材的污染問(wèn)題必須做好“人防”和“物防”兩方面的工作，這是做好防止污染的第一步，防止DNA檢材污染，必須引起基層公安機(jī)關(guān)物證提取人員的高度重視，這不僅是相關(guān)檢驗(yàn)人員的責(zé)任，也是整個(gè)法庭科學(xué)從業(yè)人員和刑事科學(xué)技術(shù)人員的責(zé)任[9-10]。相關(guān)從業(yè)人員應(yīng)該提高自身技能、積極參加培訓(xùn)，在實(shí)際現(xiàn)場(chǎng)勘查過(guò)程和檢驗(yàn)中，嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)操作，嚴(yán)控管理實(shí)驗(yàn)室環(huán)境衛(wèi)生，才能保障DNA鑒定結(jié)論的真實(shí)客觀，才能為法庭科學(xué)提供可靠依據(jù)。本文重點(diǎn)介紹了生物物證檢材在現(xiàn)場(chǎng)勘查和分析提取過(guò)程中常見(jiàn)的DNA污染途徑和環(huán)節(jié)，并針對(duì)各個(gè)環(huán)節(jié)提出了可行性的建議，有望為檢驗(yàn)人員在生物物證提取、保存、送檢和檢驗(yàn)等過(guò)程中提供參考。