張樂(lè),劉波,吳軍

軍事醫(yī)學(xué)研究院 生物工程研究所，北京100071

呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）是世界范圍內(nèi)引起嬰幼兒病毒性急性下呼吸道疾?。╝cute lower respiratory tract illness，ALRI）最重要的病原體[1]。每年約有3400萬(wàn)兒童感染RSV，其中約340萬(wàn)須住院治療，約導(dǎo)致20萬(wàn)人死亡，且99%的死亡發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家[2]。針對(duì)阿根廷56 560名兒童的研究顯示，有1293名兒童患有呼吸道感染，61.6%感染了RSV，其中13%已威脅了生命[3]。在美國(guó)，5歲以下兒童門診患者中也有很大比例系由RSV引起[4]。此外，RSV感染的目標(biāo)人群還包括老年人及免疫抑制人群。對(duì)于免疫功能低下患者，尤其是患有血液系統(tǒng)惡性疾病和接受人體干細(xì)胞移植的患者，面臨著患嚴(yán)重RSV相關(guān)疾病的風(fēng)險(xiǎn)[5]。目前對(duì)于RSV的防治主要采用被動(dòng)免疫，1996年獲批的RSV免疫球蛋白（RSV-IVIG，RespiGam）可顯著降低高危兒童的住院率[6]，但因其需要靜脈注射以及存在血液傳播病原體的潛在風(fēng)險(xiǎn)，從2004年開(kāi)始逐漸退出市場(chǎng)。帕利珠單抗（palivizumab）Synagis（MedImmune公司）是惟一獲得美國(guó)食品藥品管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）認(rèn)可的人源化單克隆抗體，然而由于高成本，使得帕利珠單抗的使用目前僅限于高危嬰兒的小眾群體[7]。帕利珠單抗的突變體Motavizumab（MedImmune-AstraZeneca公司），雖被證明比帕利珠單抗具有更高的病毒中和作用[8]，但由于少數(shù)治療的嬰兒出現(xiàn)皮膚過(guò)敏反應(yīng)，未能得到美國(guó)FDA的批準(zhǔn)[9]。而廣譜的抗病毒臨床藥物利巴韋林因出現(xiàn)不良反應(yīng)且毒性高，也較少用于RSV感染的治療。因此，研制安全有效的RSV疫苗十分重要，世界衛(wèi)生組織也將研制RSV疫苗列為全球疫苗計(jì)劃的優(yōu)先發(fā)展計(jì)劃之一[10]。

1 呼吸道合胞病毒的生物學(xué)特征

呼吸道合胞病毒屬副黏病毒科肺炎病毒屬，病毒粒子直徑為150～300 nm，是不分節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA，由編碼3種跨膜表面蛋白（F、G和SH）、2種基質(zhì)蛋白（M和M2）、3種核殼蛋白（N、P和L）及2種非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1和NS2）的15 222個(gè)核苷酸組成[11]。

基因組由核殼蛋白（N）包裹，通過(guò)聚合酶（L）催化RNA的合成并對(duì)mRNA進(jìn)行加帽、加多聚腺苷酸尾。P蛋白是一個(gè)與N、L和M2-1蛋白相互作用的同源四聚體，是聚合酶的必要輔助因子，其C端與N蛋白的C端相互作用以打開(kāi)核糖核蛋白結(jié)構(gòu)，使聚合酶結(jié)合到病毒RNA上；此外，P蛋白與新合成的N結(jié)合，阻止錯(cuò)誤裝配[12]。M2-1和M2-2是RNA合成因子，M2-1是轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，當(dāng)其缺失時(shí)轉(zhuǎn)錄會(huì)提前終止[13]。非結(jié)構(gòu)蛋白NS1和NS2通過(guò)阻斷干擾素的誘導(dǎo)和信號(hào)傳遞，抑制宿主的免疫應(yīng)答[14-15]。SH蛋白形成陽(yáng)離子通道的五聚體結(jié)構(gòu)并抑制感染的細(xì)胞凋亡[16]。RSV感染主要由糖蛋白F和G介導(dǎo)，黏附蛋白（G）與宿主細(xì)胞膜黏附，促使病毒吸附于細(xì)胞表面[17]，融合蛋白（F）介導(dǎo)病毒包膜與宿主細(xì)胞膜融合，使病毒進(jìn)入細(xì)胞，在病毒融合和進(jìn)入期間，F(xiàn)蛋白從亞穩(wěn)定的融合前構(gòu)象（pre-F）轉(zhuǎn)變?yōu)榉€(wěn)定的融合后構(gòu)象（post-F）[18]。F蛋白和G蛋白具有較高的免疫原性，可刺激機(jī)體產(chǎn)生血清中和抗體。由于F蛋白在病毒包膜外，具有特異性抗原決定簇；亞型間序列較為保守以及膜融合過(guò)程中具有關(guān)鍵作用，可引起膜融合的顯著構(gòu)象變化等[19]，使得F蛋白成為RSV抗病毒藥物及疫苗研發(fā)的重要靶點(diǎn)。

2 呼吸道合胞病毒的流行病學(xué)研究

RSV是一種高度傳染性的病毒，在人一生中會(huì)重復(fù)感染。雖然病毒很容易在非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物體內(nèi)感染，且可能引起嚴(yán)重疾病，但人類是RSV的惟一天然宿主。RSV感染流行主要發(fā)生在溫帶地區(qū)的深秋、冬季和早春，以及部分熱帶地區(qū)的雨季[20]，我國(guó)北方RSV感染主要發(fā)生在春冬季，南方多發(fā)生在夏秋季。大多數(shù)兒童在出生的第1年就感染了RSV，第2年幾乎全部感染。反復(fù)感染RSV在生命的最初幾年頻繁發(fā)生。有研究顯示，在1歲以內(nèi)感染的兒童中，47%會(huì)在第2年再次感染，再次感染不依賴于抗原差異，下呼吸道感染會(huì)在首次及再次感染期間發(fā)生，但是在隨后的感染中發(fā)病的嚴(yán)重程度顯著降低，這可能反映了獲得性免疫的增加。RSV感染出現(xiàn)嚴(yán)重住院最常見(jiàn)的是6周至6個(gè)月齡的嬰兒，其中在2～3月齡的嬰兒中發(fā)病率最高[21]。

3 呼吸道合胞病毒疫苗發(fā)展

安全有效的RSV疫苗應(yīng)能防止高危人群因感染RSV而出現(xiàn)下呼吸道疾病，降低住院率及死亡率。20世紀(jì)60年代初研制的RSV-福爾馬林滅活 疫 苗（formalin-inactivated RSV vaccine，F(xiàn)IRSV），對(duì)2月齡嬰兒及7歲兒童肌肉注射并進(jìn)行觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)并無(wú)保護(hù)作用，相反，2名接種的嬰兒因感染野毒株型RSV而導(dǎo)致死亡，具體原因尚未完全明確。研究認(rèn)為，福爾馬林處理RSV，改變了病毒上的膜蛋白，誘導(dǎo)了非中和抗體應(yīng)答反應(yīng)，該滅活疫苗未能誘導(dǎo)有效的CD8+T細(xì)胞，致使RSV不易被清除。同時(shí)，由于沒(méi)有有效的中和抗體和CD8+T細(xì)胞，RSV在下呼吸道中持續(xù)存在并誘導(dǎo)侵襲性的CD4+T細(xì)胞和細(xì)胞因子應(yīng)答，介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致病情加重，即增強(qiáng)的RSV疾?。╡nhanced RSV disease，ERD）[22]。RSV復(fù)制和持續(xù)炎癥導(dǎo)致嬰兒氣道阻塞，造成了一定的發(fā)病率和死亡率。FI-RSV疫苗事件及動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)中觀察到的疾病增加，提示對(duì)于血清反應(yīng)陰性的嬰兒和兒童，RSV疫苗應(yīng)能誘導(dǎo)保護(hù)性的中和抗體及CD8+T細(xì)胞，并誘發(fā)與野毒株相似的CD4免疫反應(yīng)，即復(fù)制型疫苗適合該類人群；對(duì)于高危大齡兒童、老年人可采用非復(fù)制型RSV疫苗。

在開(kāi)發(fā)有效的RSV疫苗方面，另一個(gè)挑戰(zhàn)涉及到免疫原性的問(wèn)題，嬰兒免疫系統(tǒng)不成熟，同時(shí)存在母體抗RSV的抗體；老年人免疫力低，降低了對(duì)疫苗的反應(yīng)，因此應(yīng)針對(duì)不同人群研制相應(yīng)的RSV疫苗，并選擇合適的受試人群。目前RSV疫苗的研究主要集中在減毒活疫苗、病毒載體疫苗及亞單位疫苗等方面。

3.1 減毒活疫苗

相對(duì)于非復(fù)制性疫苗，減毒活疫苗有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)，尤其是對(duì)于從未接觸過(guò)RSV的嬰兒和低齡兒而言：鼻內(nèi)接種減毒活疫苗可誘導(dǎo)產(chǎn)生全身和局部免疫，因此可同時(shí)對(duì)抗上、下呼吸道感染；人體對(duì)活疫苗的免疫反應(yīng)和自然感染十分相似，因此暴露于野毒株后不會(huì)發(fā)生更嚴(yán)重的疾病[23]；與其他鼻內(nèi)給藥的呼吸道減毒活疫苗一樣，鼻內(nèi)給藥的RSV侯選苗在存在母?jìng)骺贵w的低齡兒體內(nèi)可以復(fù)制，這對(duì)于RSV減毒活疫苗在低齡嬰兒體內(nèi)取得成功十分關(guān)鍵。

RSV減毒活疫苗的研究策略主要包括構(gòu)建宿主范圍突變體、低溫傳代（cp）突變體[24]和溫度敏感（ts）突變體[25]等疫苗。但這些疫苗要么減毒不夠（cp RSV和RSV ts-1）[26]導(dǎo)致傳播RSV，引起感染；要么減毒過(guò)度（RSV ts-2）[27]導(dǎo)致缺失免疫原性。幸運(yùn)的是當(dāng)接種了cp RSV和RSV ts-1的嬰幼兒自然感染RSV野毒株時(shí)，并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)病情加重，在此基礎(chǔ)上，研究者利用化學(xué)誘變使cp RSV進(jìn)一步減毒，從而獲得一系列針對(duì)RSV A亞型的cps減毒活疫苗，其效果正在研究中。

一些鼻內(nèi)給藥的減毒活疫苗在成年人和兒童身上都通過(guò)了Ⅰ期臨床試驗(yàn)評(píng)估，其中一種（cpts248/404）還在1月齡兒童身上進(jìn)行了評(píng)估[28]，這些嬰兒使用的cpts248/404疫苗雖已高度減毒，但還是引起一些嬰兒鼻塞，以致妨礙了嬰兒的飲食和睡眠，該結(jié)果提示cpts248/404疫苗對(duì)低齡兒而言沒(méi)有充分減毒，同時(shí)評(píng)估報(bào)告提供了在母?jìng)骺贵w存在時(shí)RSV減毒活疫苗在復(fù)制和免疫原性、cpts疫苗表型穩(wěn)定性等方面的重要信息。

研究者通過(guò)反向遺傳學(xué)設(shè)計(jì)了對(duì)RSV基因組的2個(gè)主要修飾：缺失M2-2基因，體外研究表明M2-2基因缺失導(dǎo)致病毒RNA復(fù)制減少，但同時(shí)通過(guò)轉(zhuǎn)錄增加F和G蛋白的表達(dá)，這意味著病毒充分減毒，但可能導(dǎo)致增強(qiáng)中和抗體反應(yīng)[29]；或缺失NS2基因，已知NS2基因促進(jìn)上皮細(xì)胞脫落，并抑制宿主細(xì)胞抗病毒Ⅰ型IFN誘導(dǎo)和應(yīng)答[30]，因此缺失NS2基因可增強(qiáng)先天性免疫應(yīng)答。候選疫苗RSV LIDΔM2-2于2016年6月至2017年7月進(jìn)行了Ⅰ期臨床試驗(yàn)，該疫苗作為鼻滴劑遞送至6～24個(gè)月的RSV血清反應(yīng)陰性嬰兒，成功免疫受試者，但抗體滴度高于理想水平，因此該研究提前終止[28]。在此經(jīng)驗(yàn)基礎(chǔ)上，為了獲得比RSV LIDΔM2-2更減毒的突變株，研究者篩選出具有溫度敏感性的突變株LIDΔM2-2 1030s，并在6～24個(gè)月齡的血清陰性嬰兒中進(jìn)行Ⅰ期安慰劑對(duì)照試驗(yàn)。減毒活疫苗研究的另一個(gè)策略：缺失NS2基因的候選疫苗ΔNS2/Δ1313/1314L，具有遺傳穩(wěn)定性和中等溫度敏感性，目前正在Ⅰ期安慰劑對(duì)照試驗(yàn)中進(jìn)行評(píng)估，該試驗(yàn)在12～59個(gè)月齡的RSV血清陽(yáng)性兒童和6～24個(gè)月齡的RSV血清陰性嬰兒中進(jìn)行。

3.2 病毒載體疫苗

目前，RSV病毒載體疫苗侯選株多采用腺病毒作為載體，通過(guò)腺病毒表達(dá)F、N、M2-1或其他編碼免疫增強(qiáng)效應(yīng)的非致病性病毒蛋白[31]，N和M2-1蛋白富含T細(xì)胞識(shí)別位點(diǎn)，可更好地激發(fā)針對(duì)RSV的特異性免疫應(yīng)答[32]。與活病毒相似，載體疫苗能夠增加呼吸道黏膜的IgA抗體和細(xì)胞免疫反應(yīng)，同時(shí)載體的佐劑性質(zhì)可提高疫苗的免疫原性[33]。GlaxoSmithKline公司來(lái)源于黑猩猩腺病毒載體疫苗ChAd155-RSV（GSK3389245A）和GSK3003891A現(xiàn)已進(jìn)行多項(xiàng)Ⅱ期臨床試驗(yàn)，受試者為18～45歲和/或12～17個(gè)月的血清陽(yáng)性的嬰兒。另一種由Janssen公司研發(fā)的來(lái)源于人腺病毒載體疫苗Ad26.RSV.preF（FA2）也正針對(duì)老年人及嬰幼兒進(jìn)行臨床試驗(yàn)，該侯選疫苗表達(dá)的pre-F蛋白進(jìn)行了5個(gè)氨基酸位點(diǎn)的突變，具有一定的熱穩(wěn)定性[34]，所進(jìn)行的Ⅱ期臨床試驗(yàn)于2017年11月開(kāi)始，預(yù)計(jì)2019年3月結(jié)束，期望該候選疫苗能夠誘導(dǎo)出針對(duì)pre-F的高滴度中和抗體。

非復(fù)制型的安卡拉病毒（MVA）作為病毒載體在其他傳染病的疫苗研究中被廣泛使用，并已被證明其安全性[35]，現(xiàn)也應(yīng)用于RSV疫苗的研究。Bavarian Nordic公司針對(duì)老年人的MVA-BN RSV候選疫苗就是采用MVA病毒載體，表達(dá)F、G蛋白（A、B亞型）及N、M2蛋白，已進(jìn)入Ⅱ期臨床試驗(yàn)。此侯選苗旨在誘導(dǎo)針對(duì)2種RSV亞型的保護(hù)性免疫應(yīng)答，其研究結(jié)果表明：與接受安慰劑的受試者相比，在單次加強(qiáng)免疫接種后2周觀察到抗體顯著增強(qiáng)（2～4倍），包括針對(duì)RSV的中和抗體（IgG）及IgA抗體，在單次加強(qiáng)免疫接種后1周，在大多數(shù)受試者中觀察顯著T細(xì)胞應(yīng)答（5～10倍）。同時(shí)，2種劑量水平下，疫苗均顯示出良好的耐受性和免疫原性。目前正在檢測(cè)Ⅱ期臨床接種后6個(gè)月的血液樣品，接受任一劑量單次疫苗接種的受試者將在今年晚些時(shí)候再次接種加強(qiáng)免疫，以觀察疫苗接種后12個(gè)月的免疫反應(yīng)和再次強(qiáng)免疫接種的效果。

3.3 RSV亞單位疫苗

減毒活疫苗及載體疫苗對(duì)嬰兒最有希望，對(duì)于孕婦和老年人，這類人群不像嬰兒那樣易出現(xiàn)ERD，因此基于RSV蛋白的疫苗可能是最有效的候選疫苗。RSV中和抗體可從母體經(jīng)胎盤轉(zhuǎn)移到胎兒，從而通過(guò)被動(dòng)免疫對(duì)子宮內(nèi)的胎兒進(jìn)行免疫。因此，母體免疫可以增加經(jīng)胎盤轉(zhuǎn)移的抗體水平[36]。此外，實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，妊娠期間RSV感染會(huì)改變后代的出生后免疫力和氣道高反應(yīng)性[37]。這些發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步闡明了母體免疫在嬰兒期預(yù)防RSV感染和感染后遺癥的重要性。

RSV的F和G蛋白可以誘導(dǎo)中和性抗體及保護(hù)性抗體，已作為有希望的候選疫苗進(jìn)行了評(píng)估。GlaxoSmithKline公司的亞單位疫苗RSV F（GSK3003891A）就是針對(duì)F蛋白的，其表達(dá)的可溶性分泌F蛋白主要是pre-F構(gòu)象，Ⅰ期臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示具有一定的安全性和免疫原性[38]，然而，由于生產(chǎn)期間pre-F抗原的不穩(wěn)定性，于2017年進(jìn)行的Ⅱ期臨床試驗(yàn)宣布停止。

Novavax公司的RSV F蛋白重組納米顆粒候選疫苗表達(dá)的是帶有部分氨基酸突變?nèi)L(zhǎng)post-F蛋白，該疫苗顯示在豚鼠模型中能夠提高經(jīng)胎盤傳遞的抗體，同時(shí)在18～35歲女性中無(wú)疫苗相關(guān)的不良反應(yīng)，針對(duì)不同人群的疫苗已分別進(jìn)入Ⅲ期及Ⅰ期臨床試驗(yàn)。但2016年9月該公司宣布針對(duì)老年人的RSV F蛋白納米顆粒疫苗Ⅲ期臨床試驗(yàn)失敗，原因主要是沒(méi)有達(dá)到預(yù)先指定的主要和次要療效指標(biāo)，沒(méi)有證明疫苗的有效性。

另一種正在開(kāi)發(fā)的亞單位候選疫苗RSV F DS-Cav1是利用結(jié)構(gòu)生物學(xué)的方法對(duì)F蛋白進(jìn)行改造，包括促進(jìn)三聚體的穩(wěn)定性、引入半胱氨酸殘基以形成二硫鍵，以及在空腔處填充疏水殘基等方式[39]，獲得穩(wěn)定的pre-F構(gòu)象。該疫苗能夠保留病毒表面F蛋白pre-F構(gòu)象的中和敏感性表位，目前正在進(jìn)行Ⅰ期臨床試驗(yàn)[40]，評(píng)估RSV F DSCav1在孕婦及老年人群急性呼吸道患者中的安全性和免疫原性。

RSV中和抗體主要針對(duì)F蛋白的pre-F構(gòu)象，但在生產(chǎn)或溶液儲(chǔ)存過(guò)程中pre-F構(gòu)象很可能過(guò)早地重新形成穩(wěn)定的post構(gòu)象。MEDI-7510是由post構(gòu)象的F蛋白與吡喃葡萄糖脂質(zhì)A（一種合成的TLR-4激動(dòng)劑）佐劑[41]構(gòu)成的亞單位RSV疫苗，Ⅰ期臨床試驗(yàn)研究評(píng)估了在60歲或以上人群中的安全性和免疫原性，結(jié)果顯示，接受MEDI-7510治療的受試者的免疫反應(yīng)顯著高于安慰劑，疫苗的安全性與安慰劑相似[42]。Ⅱ期試驗(yàn)于2016年11月終止，具體原因未說(shuō)明。

4 結(jié)語(yǔ)

目前大部分RSV疫苗的研究主要針對(duì)F蛋白，由于Novavax公司的RSV F納米顆粒疫苗（post-F構(gòu)象）Ⅲ期臨床試驗(yàn)的失敗，使得人們將更多希望放在了pre-F構(gòu)象的研究上。減毒活疫苗的開(kāi)發(fā)要注意避免疫苗接種后引起的不良反應(yīng)，以及避免因接種疫苗出現(xiàn)免疫反應(yīng)不平衡而帶來(lái)的疾病，這些限制使得疫苗在減毒同時(shí)又保持適當(dāng)?shù)拿庖咴苑浅＠щy。RSV病毒載體疫苗通過(guò)腺病毒、安卡拉病毒、新城疫病毒等病毒載體主要表達(dá)F蛋白或G蛋白，具有良好的前景，但大都處于開(kāi)發(fā)的早期。而亞單位疫苗適合已經(jīng)建立非致病性免疫反應(yīng)的人群，但這種應(yīng)答需要多次刺激，包括添加佐劑等，由于具有一定的安全性及免疫原性，亞單位疫苗被認(rèn)為是最具有發(fā)展?jié)摿Φ腞SV候選疫苗。

數(shù)十年來(lái)，人們對(duì)RSV相關(guān)疾病帶來(lái)的社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)有了越來(lái)越深的認(rèn)識(shí)，使得更多的關(guān)注度落在其疫苗的開(kāi)發(fā)上。盡管RSV疫苗的研究設(shè)計(jì)存在多重困難，諸如疫苗接種后可能會(huì)出現(xiàn)ERD；缺乏相關(guān)的免疫機(jī)理研究；面對(duì)不同目標(biāo)人群，尚未有一致的臨床試驗(yàn)終點(diǎn)等，但結(jié)構(gòu)生物學(xué)等新方法和新技術(shù)的應(yīng)用，為盡早闡明RSV的免疫保護(hù)機(jī)制提供了可能，拓寬了預(yù)防RSV感染的前景，前期臨床研究結(jié)果也為該領(lǐng)域的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)，一批針對(duì)不同人群的疫苗候選株已進(jìn)入臨床試驗(yàn)，有望為RSV的防治做出貢獻(xiàn)。