陶林林，李國(guó)臻，楊志偉，段新崇，耿亞松，鄭波

(邢臺(tái)不孕不育?？漆t(yī)院/邢臺(tái)生殖與遺傳?？漆t(yī)院，邢臺(tái) 054000)

在體外受精-胚胎移植(IVF-ET)中，隨著促排卵技術(shù)及實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)環(huán)境的改善，獲得胚胎的數(shù)量和質(zhì)量都有了一定的提高，大多數(shù)周期能夠獲得可用胚胎進(jìn)行移植，但部分周期移植后種植率較低[1]，影響IVF的成功率[2]。在可用胚胎數(shù)目有限的情況下，如何選擇發(fā)育潛能更高的胚胎進(jìn)行移植，即選擇怎樣的胚胎移植策略是目前生殖領(lǐng)域醫(yī)生共同關(guān)注的問(wèn)題。大部分生殖中心在取卵后第3天(D3)卵裂胚階段或D5囊胚階段進(jìn)行胚胎移植，有的生殖中心會(huì)為反復(fù)種植失敗的患者進(jìn)行D2/D3或D3/D5的序貫移植[3]。D3移植和D5移植各有優(yōu)勢(shì)和弊端，而D4移植鮮有報(bào)道，本研究回顧性分析了兩種不同的移植策略的妊娠結(jié)局，一種是僅進(jìn)行D3移植；另一種是為了避免因得不到囊胚而取消移植，根據(jù)患者D3胚胎質(zhì)量進(jìn)行D3D4D5移植。探討不同移植策略對(duì)IVF-ET臨床結(jié)局的影響，為IVF助孕治療中移植胚胎的選擇提供參考。

資料與方法

一、研究對(duì)象與分組

回顧性分析本院生殖中心2017年1月至2018年5月行新鮮周期IVF/ICSI-ET患者的臨床資料，共1 048個(gè)周期。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)血清基礎(chǔ)FSH<10 U/L；(2)所有患者均采用黃體期長(zhǎng)方案降調(diào)節(jié)，達(dá)到降調(diào)標(biāo)準(zhǔn)后，進(jìn)行控制性促排卵；(3)均為第1次促排卵周期。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)卵巢功能減退、卵巢早衰；(2)HCG日E2≥29 280 pmol/L或P≥5.706 nmol/L；(3)合并遺傳性疾病者。

根據(jù)不同的移植策略分成兩組，A組(693個(gè)周期)：D3移植組，新鮮移植周期全部行D3胚胎移植，剩余胚胎全部繼續(xù)培養(yǎng)囊胚。B組(355個(gè)周期)：根據(jù)胚胎質(zhì)量行D3、D4或D5移植，即D3D4D5胚胎移植組。D3可用胚胎數(shù)≤2枚，則D3移植；D3可用胚胎數(shù)≥3枚，則D4擇優(yōu)移植2枚；若D3優(yōu)質(zhì)胚胎≥4枚，則全部胚胎培養(yǎng)囊胚行D5移植。再根據(jù)年齡的不同將A、B組各分為3個(gè)不同亞組，A1組(≤30歲,371個(gè)周期)：D3移植組；B1組(≤30歲,207個(gè)周期)：D3D4D5胚胎移植組；A2組(30歲<年齡≤35歲,187個(gè)周期)：D3移植組；B2組(30歲<年齡≤35歲,108個(gè)周期)：D3D4D5胚胎移植組；A3組(>35歲,135個(gè)周期)：D3移植組；B3組(>35歲,40個(gè)周期)：D3D4D5胚胎移植組。分別比較不同年齡段兩種移植策略對(duì)妊娠結(jié)局的影響。

二、研究方法

1.卵母細(xì)胞獲取及培養(yǎng)：所有患者采用常規(guī)長(zhǎng)方案促排卵，B超監(jiān)測(cè)卵泡發(fā)育情況，卵泡成熟時(shí)，注射HCG(珠海麗珠制藥)5 000～10 000 U，36.5 h經(jīng)陰道超聲引導(dǎo)下穿刺取卵。卵丘復(fù)合物取出充分洗滌后置三氣培養(yǎng)箱(37℃、6%CO2、5%O2)中培養(yǎng)，取卵當(dāng)日行常規(guī)IVF或ICSI授精。次日評(píng)估卵母細(xì)胞受精情況，并記錄原核(PN)數(shù)目：2PN為正常受精；受精后D2和D3評(píng)估卵裂期胚胎質(zhì)量。

2.本中心可用優(yōu)質(zhì)胚胎評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)卵裂球數(shù)目、形態(tài)、碎片情況對(duì)卵裂期胚胎進(jìn)行評(píng)分：1級(jí)：卵裂球大小均勻，形態(tài)規(guī)則，胞質(zhì)均勻清晰，無(wú)碎片或碎片<10%；2級(jí)：卵裂球大小均勻或略不均勻，形態(tài)欠規(guī)則，無(wú)碎片或碎片10%～20%；3級(jí)：卵裂球大小不均，形態(tài)欠規(guī)則，碎片20%～50%；4級(jí)：卵裂球大小嚴(yán)重不均，碎片>50%。

D3可用胚胎標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞數(shù)≥6個(gè)，評(píng)分為1級(jí)、2級(jí)和3級(jí)。D3優(yōu)質(zhì)胚胎標(biāo)準(zhǔn)[4]：D1為正常受精(2PN)，6個(gè)≤細(xì)胞數(shù)≤10個(gè)，評(píng)分為1級(jí)和2級(jí)。

D4可用胚胎標(biāo)準(zhǔn)：胚胎開(kāi)始出現(xiàn)部分融合。D4優(yōu)質(zhì)胚胎標(biāo)準(zhǔn)：胚胎已經(jīng)完全融合或者開(kāi)始出現(xiàn)囊胚腔。

可用囊胚標(biāo)準(zhǔn)：囊胚至少發(fā)育到囊胚腔完全擴(kuò)張充滿整個(gè)胚胎；內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞數(shù)目多而均勻，連接緊密或細(xì)胞數(shù)目相對(duì)較少或連接分散；滋養(yǎng)層細(xì)胞數(shù)目少或僅有少量大細(xì)胞即可。優(yōu)質(zhì)囊胚標(biāo)準(zhǔn)[4]：D1為2PN，囊胚腔及內(nèi)細(xì)胞團(tuán)達(dá)到可用囊胚標(biāo)準(zhǔn)，滋養(yǎng)層細(xì)胞數(shù)目多，大小均勻，呈鐮形，或細(xì)胞數(shù)目較多，但有大細(xì)胞或不均勻。

3.黃體支持方案：取卵后給予黃體酮(浙江仙琚制藥，20 mg/ml)80 mg，每天肌肉注射，行黃體支持。根據(jù)不同的移植策略于取卵術(shù)后D3、D4、D5移植，移植日視HCG日E2水平給予戊酸雌二醇(補(bǔ)佳樂(lè)，拜耳醫(yī)藥，德國(guó))2～6 mg口服。

4.胚胎移植：用棉簽蘸取培養(yǎng)液清洗宮頸表面，若宮頸分泌物過(guò)多，則用卵圓鉗去除。按照常規(guī)操作進(jìn)行胚胎移植：通過(guò)移植外管將含有胚胎的軟內(nèi)管置入距宮底約1.0 cm處，緩慢推注留管30 s后輕輕取出，確認(rèn)無(wú)胚胎殘留。胚胎移植后常規(guī)給予黃體支持。移植后14 d測(cè)血β-HCG水平，陽(yáng)性者于第28日行陰道B超檢查，見(jiàn)到妊娠囊者確定為臨床妊娠。

5.觀察指標(biāo)：治療周期移植率=移植周期數(shù)/取卵周期數(shù)×100%；種植率=B超下見(jiàn)到孕囊數(shù)/移植胚胎數(shù)×100%；妊娠率=妊娠患者數(shù)/移植患者數(shù)×100%；流產(chǎn)率=流產(chǎn)患者數(shù)/妊娠患者數(shù)×100%。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、患者基本情況分析

≤30歲和30～35歲兩個(gè)亞組患者的年齡、不孕年限、基礎(chǔ)激素值、HCG日激素值、體重指數(shù)(BMI)、胚胎移植數(shù)量以及子宮內(nèi)膜厚度和治療周期移植率等比較均無(wú)顯著性差異(P>0.05)；>35歲中A3組的移植胚胎數(shù)顯著高于B3組(P<0.05)，詳見(jiàn)表1。

表1 三個(gè)亞組患者的基本資料比較[(-±s)，%]

注：與A3組比較，*P<0.05

二、不同亞組的妊娠結(jié)局比較

各個(gè)不同亞組的2PN受精率、2PN卵裂率、可用胚胎率及優(yōu)胚率比較均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。≤30歲年齡段中B1組的臨床妊娠率顯著高于A1組(P<0.05)；兩組的種植率比較雖沒(méi)有顯著性差異(P>0.05)，但B1組有高于A1組的趨勢(shì)；兩組的流產(chǎn)率比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)。30歲<年齡≤35歲中兩亞組和>35歲兩亞組的臨床妊娠率、種植率和流產(chǎn)率比較均無(wú)顯著性差異(P>0.05)，詳見(jiàn)表2。

表2 各不同亞組妊娠結(jié)局比較 (%)

注：與A1組比較，*P<0.05

討 論

目前大多數(shù)的D3胚胎移植是根據(jù)形態(tài)學(xué)評(píng)分來(lái)挑選胚胎的，但大量研究表明形態(tài)學(xué)很難準(zhǔn)確地評(píng)估胚胎發(fā)育潛能以選擇出較高發(fā)育潛能的胚胎進(jìn)行移植[5]。在人類胚胎發(fā)育的早期階段，胚胎發(fā)育由儲(chǔ)存在卵母細(xì)胞內(nèi)的母源基因所調(diào)控，當(dāng)胚胎發(fā)育至D3(4～8細(xì)胞)階段時(shí)，胚胎基因組開(kāi)始被激活，開(kāi)始調(diào)控胚胎的繼續(xù)發(fā)育[6]，發(fā)生致密化并形成囊胚。如果胚胎基因組無(wú)法正常激活或胚胎具有遺傳學(xué)異常，則胚胎會(huì)發(fā)生發(fā)育停滯、無(wú)法形成囊胚或凋亡。因此，在胚胎選擇中，具有激活胚胎基因組的桑椹胚與囊胚比卵裂階段胚胎具有更好的選擇價(jià)值，體外培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)有助于判斷胚胎的質(zhì)量[7]，可以淘汰部分有遺傳缺陷及發(fā)育潛能差的卵裂期胚胎[8]。輔助生殖技術(shù)模擬體內(nèi)胚胎發(fā)育的微環(huán)境，但與體內(nèi)環(huán)境必然存在一定的差異，早期胚胎對(duì)于培養(yǎng)環(huán)境特別敏感，延長(zhǎng)體外培養(yǎng)的過(guò)程中，實(shí)驗(yàn)室的微環(huán)境如PH值、滲透壓、溫度等發(fā)生細(xì)微改變均可能影響胚胎質(zhì)量，增加移植周期取消的風(fēng)險(xiǎn)[9]。什么時(shí)候是最合適的移植時(shí)間，目前尚沒(méi)有明確的定論。

大量研究證明與卵裂胚相比，囊胚移植能夠獲得較高的臨床妊娠率和活產(chǎn)率，所需移植數(shù)目較少，且能降低多胎妊娠率[10-11]。近年來(lái)，生殖領(lǐng)域?qū)＜覀冊(cè)絹?lái)越傾向于囊胚移植。Kang等[12]報(bào)告，胚胎在哺乳動(dòng)物受精后的3～4 d內(nèi)移動(dòng)到子宮腔，與卵裂期胚胎移植相比，D4桑葚胚/致密胚移植和囊胚移植與體內(nèi)生殖過(guò)程更為同步。Li等[13]報(bào)道D4胚胎移植組的足月出生率顯著高于D5胚胎移植組，兩組的臨床妊娠率、持續(xù)妊娠率、流產(chǎn)率和活產(chǎn)率均無(wú)顯著差異，表明D4胚胎移植成功率與囊胚D5移植相似。有回顧性研究結(jié)果顯示，D4移植與D3移植相比能顯著提高胚胎種植率(46.4% vs. 21.4%，P<0.01)，且D4移植胚胎數(shù)顯著低于D3移植胚胎數(shù)[14]。以上研究表明桑椹胚與囊胚具有相似的優(yōu)勢(shì)，因?yàn)樗鼈兙哂屑せ畹呐咛セ蚪M，且與D2、D3的卵裂期胚胎相比，它們與子宮內(nèi)膜環(huán)境有更好的同步性[15]。但不是所有的患者都適合囊胚移植及D4移植，與D3移植相比，囊胚移植和D4移植會(huì)增加周期取消的風(fēng)險(xiǎn)，囊胚及D4胚胎培養(yǎng)能夠選擇出具有較高質(zhì)量和發(fā)育潛能的胚胎，但有胚胎發(fā)育停滯及凋亡的風(fēng)險(xiǎn)，給患者帶來(lái)精神打擊和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，不適合獲卵數(shù)較少及胚胎質(zhì)量較差的患者，囊胚及D4胚胎培養(yǎng)的前提是要有一定數(shù)量的優(yōu)質(zhì)胚胎[16]。D4移植與D5移植相比，周期取消的風(fēng)險(xiǎn)要低一些，有研究表明59.2%的D3優(yōu)質(zhì)胚胎能夠發(fā)育成D4優(yōu)質(zhì)胚胎，47%的D3優(yōu)質(zhì)胚胎在D5發(fā)育成囊胚[12]，在D3優(yōu)質(zhì)胚胎不夠多，沒(méi)有把握培養(yǎng)成囊胚而又有多于移植數(shù)目的胚胎的情況下，為了篩選發(fā)育潛能高的胚胎進(jìn)行移植同時(shí)避免因得不到囊胚而取消移植，而進(jìn)行D4移植；在優(yōu)質(zhì)胚胎足夠多的情況下可以繼續(xù)培養(yǎng)成囊胚后進(jìn)行移植。Jones等[17]研究表明，囊胚形成數(shù)量與D3 8-細(xì)胞胚胎數(shù)量有關(guān)，D3 8-細(xì)胞胚胎≥3個(gè)時(shí)可避免因無(wú)囊胚形成而取消移植的風(fēng)險(xiǎn)。本研究中B組移植策略與其相似，D3可用胚胎數(shù)≤2枚，則D3移植；D3可用胚胎數(shù)≥3枚，則D4擇優(yōu)移植2枚；若D3優(yōu)質(zhì)胚胎≥4枚，則全部胚胎培養(yǎng)至囊胚，D5移植。由于B組研究策略較靈活，根據(jù)D3胚胎質(zhì)量行D3、D4或D5移植，對(duì)于優(yōu)質(zhì)胚胎較少可能養(yǎng)不成囊胚的情況則進(jìn)行D3或D4移植，因此目前尚沒(méi)有因未形成囊胚而取消移植的周期；各亞組治療周期的移植率沒(méi)有顯著差異，提示D3/D4/D5移植策略并未增加取消移植周期，當(dāng)然也可能是研究周期數(shù)較少的緣故。對(duì)于有多個(gè)優(yōu)質(zhì)囊胚的周期，本研究并沒(méi)有減少移植數(shù)目，少數(shù)周期只形成1枚囊胚則行單囊胚移植，本中心尚沒(méi)有全面開(kāi)展單囊胚移植。

在本研究中，各個(gè)亞組的2PN受精率、2PN卵裂率、可用胚胎率和優(yōu)胚率比較均沒(méi)有顯著性差異，提示繼續(xù)培養(yǎng)至D4、D5移植并沒(méi)有降低優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)量?！?0歲組行D3D4D5移植策略(B1組)比D3移植策略(A1組)臨床妊娠率有顯著提高(P<0.05)，而31歲<年齡≤35歲和>35歲組中均沒(méi)有顯著性差異(P>0.05)；各組的種植率D3D4D5移植策略比D3移植策略從數(shù)值上有增高趨勢(shì)，但亞組間的臨床妊娠率和種植率仍沒(méi)有顯著性差異(P>0.05)，從另一個(gè)角度提示D3D4D5移植策略比單純D3移植可能有一定的優(yōu)勢(shì)。這與其他研究者結(jié)果[18-19]相似，Blake等[18]的薈萃分析表明對(duì)年輕、預(yù)后較好的患者行囊胚移植能夠顯著改善妊娠結(jié)局。年齡是影響卵母細(xì)胞質(zhì)量及妊娠結(jié)局的重要因素，也是卵巢反應(yīng)性的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子[20]。本研究數(shù)據(jù)表明不管是A組還是B組，隨著年齡增加，妊娠率呈降低的趨勢(shì)。年輕人群卵母細(xì)胞質(zhì)量和胚胎發(fā)育潛能較高，繼續(xù)培養(yǎng)選擇胚胎的意義更大一些，因此，對(duì)于年齡≤30歲的年輕患者可根據(jù)D3胚胎質(zhì)量靈活選擇移植天數(shù)，胚胎質(zhì)量及數(shù)量較高時(shí)繼續(xù)培養(yǎng)篩選發(fā)育潛能較高的胚胎進(jìn)行移植?！?5歲女性卵母細(xì)胞及胚胎非整倍體率增高，優(yōu)質(zhì)胚胎較少，妊娠率較低。朱靜等[21]研究表明對(duì)于≥35歲、卵巢功能較差的患者卵裂期胚胎在移植胚胎數(shù)、胚胎種植率及妊娠率等方面均高于囊胚期胚胎，本研究對(duì)>35歲患者卵裂期胚胎繼續(xù)培養(yǎng)后妊娠結(jié)局與D3移植沒(méi)有顯著差異，因此對(duì)>35歲患者仍建議卵裂期胚胎移植，但需要大樣本量進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

綜上所述，對(duì)于年齡≤30歲的年輕且有足夠多胚胎的患者，可根據(jù)D3胚胎質(zhì)量靈活選擇移植天數(shù)，其與單純D3胚胎移植相比能夠顯著改善臨床妊娠結(jié)局，且并不增加周期移植取消率。但對(duì)于30歲以上患者，該移植策略的優(yōu)勢(shì)并不明顯。