陳林娜 張 鵬 王漢民

近年來(lái)，隨著我國(guó)居民生活水平逐步提高、飲食方式的改變和人口老齡化趨勢(shì)的加劇，糖尿病以及糖尿病腎病的發(fā)生率和病死率呈逐年上升趨勢(shì)，目前糖尿病腎病已成為導(dǎo)致尿毒癥的最主要病因之一[1]。糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，可能涉及遺傳因素、氧化應(yīng)激、糖代謝異常、血流動(dòng)力學(xué)異常、炎性損傷等多種機(jī)制，但以上因素尚不能完全解釋糖尿病腎病的發(fā)生機(jī)制[2]。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)表觀遺傳變異可能在糖尿病腎病的發(fā)生、發(fā)展中扮演了關(guān)鍵角色。其中DNA甲基化目前研究較為深入，本文現(xiàn)就DNA甲基化的研究進(jìn)展及其與糖尿病腎病之間的關(guān)系做一綜述，以期為糖尿病腎病的臨床診治提供新的理論依據(jù)。

一、代謝記憶、表觀遺傳變異和糖尿病腎病

Zoungas等[3]研究發(fā)現(xiàn)，針對(duì)2型糖尿病患者，給予強(qiáng)化血糖管理，其益處可以持續(xù)到干預(yù)停止后的相當(dāng)長(zhǎng)一段時(shí)間，存在 “遺贈(zèng)效應(yīng)”；而早期暴露于高血糖水平的患者，即使疾病后期接受強(qiáng)化血糖控制，糖尿病導(dǎo)致的微血管并發(fā)癥仍持續(xù)進(jìn)展，存在 “代謝記憶”現(xiàn)象，而這種“代謝記憶”現(xiàn)象與表觀遺傳修飾密切相關(guān)。表觀遺傳變異(epigenetic variation)是指在基因的DNA序列沒有發(fā)生改變的情況下，基因功能發(fā)生了可遺傳的變化，并最終導(dǎo)致了表型的變化。

表觀遺傳修飾涉及DNA甲基化、非編碼RNA、基因組記憶、基因沉默、組蛋白轉(zhuǎn)錄后修飾等，目前DNA甲基化研究較為深入。

二、DNA甲基化與糖尿病腎病

1.啟動(dòng)子區(qū)DNA 甲基化與糖尿病腎病有關(guān)：DNA甲基化是指通過(guò)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltranferase，DNMT)催化S-腺苷甲硫氨酸 (S-adenosy-methionine，SAM)作為甲基供體，再將胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)?-甲基胞嘧啶的過(guò)程。在哺乳動(dòng)物中，DNA甲基化主要發(fā)生在胞嘧啶-鳥嘌呤(CpG)雙核苷酸序列的胞嘧啶上。DNA甲基化可以引起DNA構(gòu)象、染色體結(jié)構(gòu)、翻譯過(guò)程發(fā)生改變，最終可以在不改變基因組堿基序列的前提下實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控。CpG的甲基化與否起著十分重要的作用，CpG雙核苷酸雖只占人類基因組的10%，但約>80%的CpG雙核苷酸處于甲基化狀態(tài)，未發(fā)生甲基化的余下的 CpG 雙核苷酸分布在啟動(dòng)子區(qū)和第一外顯子區(qū)。啟動(dòng)子區(qū) DNA 甲基化可以抑制基因的表達(dá)，進(jìn)而影響轉(zhuǎn)錄和選擇性剪切。此外，啟動(dòng)子區(qū)的DNA甲基化還可影響沉默子和增強(qiáng)子等轉(zhuǎn)錄活性因子的活性[4]。文利等[5]報(bào)道了糖尿病腎病患者中微小RNA(miRNA)中l(wèi)et-7a家族基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平存在異常，通過(guò)檢測(cè)甲基化位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)let-7a-3 啟動(dòng)子區(qū)域高度甲基化很可能是糖尿病腎病患者let-7a-3及l(fā)et-7a低表達(dá)的一個(gè)重要因素，并促進(jìn)了糖尿病腎病的發(fā)生和發(fā)展。還有研究者發(fā)現(xiàn)，結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)是推動(dòng)糖尿病腎病患者腎間質(zhì)纖維化進(jìn)程的關(guān)鍵細(xì)胞因子。糖尿病腎病患者腎小球CTGF的表達(dá)明顯升高，與持續(xù)高血糖水平降低了CTGF相關(guān)基因啟動(dòng)子區(qū) CpG甲基化水平有關(guān)[6]。總之，啟動(dòng)子區(qū) DNA 甲基化能通過(guò)多種機(jī)制導(dǎo)致基因沉默，廣泛參與了多種生理過(guò)程如細(xì)胞周期調(diào)控、基因印記、X染色體失活等。

2.糖尿病腎病患者全基因組甲基化整體水平明顯增加：Maghbooli等[7]通過(guò)反向高效液相色譜法(RP-HPLC)研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病腎病患者相比于單純糖尿病患者的基因組整體甲基化水平明顯升高。近年來(lái)還有研究發(fā)現(xiàn)糖尿病患者基因組異常的DNA 甲基化修飾可使胰島素相關(guān)基因的表達(dá)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)生改變，從而影響整個(gè)疾病進(jìn)程。有研究對(duì)單純糖尿病與糖尿病腎病患者全基因組的甲基化水平進(jìn)行了比較，兩組患者的基因組甲基化水平呈現(xiàn)出顯著性差異，其中單純糖尿病患者的基因甲基化程度相對(duì)較低，提示 DNA甲基化可能與糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)[8]。此外，王曉楠等[9]利用全基因組甲基化測(cè)序進(jìn)一步證實(shí)了DNA甲基化與糖尿病腎病的關(guān)系密切。實(shí)驗(yàn)收集了糖尿病腎病患者、糖尿病非腎病患者和正常人腎臟組織標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，糖尿病腎病患者全基因組CpG 甲基化水平明顯高于其他兩組患者，進(jìn)一步對(duì)3組患者差異甲基化區(qū)域(DMR)數(shù)關(guān)聯(lián)到的差異基因進(jìn)行差異基因功能分類注釋(GO)分析和差異基因生物學(xué)路徑(KEGG)分析，整合素相關(guān)差異基因(FOXC1、ITGA8、MYLK3、FGF9、COL4A3、FLT1、MYC)等62個(gè)基因甲基化水平與表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，并通過(guò)絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)等信號(hào)通路發(fā)揮作用。以上表明了DNA甲基化可能在糖尿病腎病的發(fā)生、發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。

3.DNA甲基化與炎性損傷:有研究發(fā)現(xiàn),腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素1β(IL-1β)等炎性因子啟動(dòng)子區(qū)的甲基化水平與其表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-17、IL-10、IL-11啟動(dòng)子區(qū)的低甲基化可以上調(diào)上述炎性因子的表達(dá)水平，從而促進(jìn)炎性反應(yīng)的發(fā)生或提高炎性水平；有些炎性因子可以增加DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的活性，進(jìn)而引起DNA異常甲基化。Bomsztyk等[10]更進(jìn)一步研究證實(shí)，糖尿病腎病患者的IL-1β、TNF-α 和IL-17啟動(dòng)子的區(qū)低甲基化可能直接與腎組織炎性水平有關(guān)。還有研究認(rèn)為，糖尿病腎病患者中，促炎轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)活性增加，而表觀遺傳修飾對(duì)高糖誘導(dǎo)的NF-κB的激活、糖尿病并發(fā)癥相關(guān)炎性基因在血管細(xì)胞和單核細(xì)胞中的表達(dá)均有作用。此外，叉形頭轉(zhuǎn)錄因子3(FOXP3)是促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)成熟和調(diào)節(jié)其功能的重要因子，在維持機(jī)體免疫耐受和免疫抑制中扮演了關(guān)鍵角色。Fontenot等[11]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXP3基因過(guò)度甲基化可能是糖尿病腎病免疫失調(diào)的重要原因之一，F(xiàn)OXP3基因啟動(dòng)子區(qū)的高度甲基化可以下調(diào)FOXP3蛋白的表達(dá)，繼而削弱了Treg細(xì)胞的免疫抑制功能，加劇了糖尿病腎病患者的免疫失調(diào)和炎性損傷。上述研究表明DNA甲基化與糖尿病腎病的炎性損傷有密切關(guān)系。

4.DNA甲基化與氧化應(yīng)激：持續(xù)高血糖和TGF表達(dá)水平升高均可導(dǎo)致過(guò)氧化應(yīng)激，從而損傷腎小球和腎小管細(xì)胞，糖代謝紊亂還可使機(jī)體維生素C、維生素E和谷胱甘肽(GSH)等抗氧化劑水平下降，削弱了機(jī)體抗氧化能力。此外，氧化應(yīng)激還可上調(diào)一系列炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，提高機(jī)體炎性水平，而炎性反應(yīng)水平的升高也會(huì)反過(guò)來(lái)刺激氧化應(yīng)激水平進(jìn)一步增加，形成惡性循環(huán)[12]。凝固酶活性蛋白C可通過(guò)抗氧化作用而起到降低腎組織氧化應(yīng)激損傷的作用，原癌基因shc編碼的蛋白(p66shc蛋白)其水平升高可加劇高血糖所致的細(xì)胞損害，Shahzad等[13]研究發(fā)現(xiàn)，凝固酶活性蛋白C水平下降可使p66shc基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平下降并使p66shc蛋白表達(dá)上調(diào)，提示凝固酶活性蛋白C可能調(diào)節(jié)p66shc基因甲基化水平，從而影響糖尿病腎病的發(fā)生和發(fā)展。Swan等[14]比較了單純1型糖尿病患者與糖尿病腎病患者的基因組跨越450K和27K甲基化序列，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩組患者線粒體功能相關(guān)基因(PMPCB、TSFM、AUH)的甲基化水平差異顯著，而線粒體應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與糖尿病腎病的發(fā)生、發(fā)展有一定關(guān)系，表明基因甲基化異常與1型糖尿病腎病密切相關(guān)。但總體而言，關(guān)于DNA甲基化與氧化應(yīng)激損傷在糖尿病腎病中關(guān)系的研究報(bào)道尚不多見，二者的聯(lián)系需要更多的研究進(jìn)一步證實(shí)。

5.DNA甲基化與腎臟纖維化：糖尿病腎病主要病理改變表現(xiàn)為腎小球基膜增厚、腎小管間質(zhì)纖維化、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白沉積增多、系膜擴(kuò)張，最終導(dǎo)致腎小球完全硬化[15]。有研究者發(fā)現(xiàn)，糖尿病腎病、慢性腎衰竭患者腎小管細(xì)胞全基因組DNA中纖維化相關(guān)基因甲基化水平與正常人比較差異顯著，提示DNA甲基化在腎臟組織纖維化過(guò)程中扮演了重要角色[16]。研究證實(shí)，持續(xù)的高血糖水平可誘導(dǎo)腎臟固有細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)表達(dá)上調(diào)，病理?xiàng)l件下，TGF-β1 可誘導(dǎo)多種細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化和異常增殖，趨化成纖維細(xì)胞和單核細(xì)胞，繼而增加細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的沉積，促進(jìn)纖維化進(jìn)程[17]。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1 基因低甲基化水平是 TGF-β1 蛋白高表達(dá)的分子基礎(chǔ)，TGF-β1 基因調(diào)控區(qū)存在一個(gè)橫跨啟動(dòng)子及第一外顯子區(qū)的 CpG序列，而對(duì)該CpG序列的甲基化修飾主要發(fā)生于第一外顯子區(qū)。張倩等[18]研究證實(shí)，糖尿病腎病患者TGF-β1第一外顯子區(qū)甲基化水平較健康人群和單純糖尿病患者顯著下降，這種DNA甲基化水平的異常下降與TGF-β1的過(guò)度表達(dá)存在一定的因果關(guān)系，并最終參與了腎臟纖維化過(guò)程。調(diào)控蛋白水解活性與細(xì)胞外基質(zhì)蛋白沉淀的酶系(NMMPs)通過(guò)降解腎細(xì)胞外基質(zhì)中膠原和非膠原成分而對(duì)腎細(xì)胞外基質(zhì)沉淀-降解的動(dòng)態(tài)平衡發(fā)揮調(diào)控作用。馮詩(shī)雅[19]研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病腎病患者的基質(zhì)金屬蛋白酶家族相關(guān)基因(MMP-9)啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平明顯降低，而MMP-9的表達(dá)水平則顯著升高，且患者的MMP-9啟動(dòng)子區(qū)去甲基化程度與其腎病病程呈正相關(guān)，并與腎小球?yàn)V過(guò)率(GFR)呈負(fù)相關(guān)，上述研究結(jié)果證明MMP-9啟動(dòng)子區(qū)甲基化促進(jìn)了MMP-9蛋白的表達(dá)，從而推動(dòng)了糖尿病腎病患者腎臟纖維化進(jìn)程。上述研究表明，DNA甲基化可能與糖尿病腎病的腎臟纖維化密切相關(guān)。

6.DNA甲基化與細(xì)胞凋亡：腎小管上皮細(xì)胞、腎小球固有細(xì)胞、足細(xì)胞凋亡均屬于糖尿病腎病的重要特征，并參與了糖尿病腎病的發(fā)病及進(jìn)展。腎病相關(guān)基因(UNC13B基因)介導(dǎo)了高血糖水平下腎小球固有細(xì)胞的凋亡，有研究證實(shí)，1型糖尿病腎病患者UNC13B基因啟動(dòng)子CpG島的甲基化水平出現(xiàn)了異常降低，同時(shí)觀察到UNC13B呈高表達(dá)，由此推測(cè)，UNC13B基因的甲基化異?？赡艽龠M(jìn)了腎小球細(xì)胞的凋亡，從而參與了糖尿病腎病的發(fā)病與進(jìn)展[20]。

7.DNA甲基化與非編碼RNA：非編碼RNA(ncRNA)是指不被翻譯成蛋白質(zhì)的一類功能性RNA，可粗略分成兩類：(1)短鏈ncRNA：主要為微小RNA(miRNA)，其他的有Piwi蛋白相互作用的RNA(piRNA)、小干擾RNA(siRNA)等。(2)長(zhǎng)鏈ncRNA(lncRNA)。 miRNA是一類長(zhǎng)度約21～23個(gè)核苷酸的非編碼小RNA，它參與多種疾病的進(jìn)程，其中包括糖尿病腎病的發(fā)生和發(fā)展。Gondaliya等[21]利用腎近端小管上皮細(xì)胞模擬建立了體外糖尿病腎病微環(huán)境的模型證實(shí)了miR29b可以靶向結(jié)合DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)。在高糖條件下，miR29b的表達(dá)下調(diào)，使得DNA甲基化特異性標(biāo)志物(DNMT3A、DNMT3B、DNMT1)的表達(dá)水平提高，提示miR29b與糖尿病腎病發(fā)病機(jī)制中的DNA甲基化存在相關(guān)性。研究還進(jìn)一步證實(shí)了miR29b可以顯著抑制糖尿病腎病中腎近端小管上皮細(xì)胞的腎損傷，具有一定的腎臟保護(hù)作用。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)，在妊娠期糖尿病腎病患者胎盤組織中miR-98基因表達(dá)上調(diào)或下調(diào)后，DNA甲基化的水平隨后也發(fā)生了相關(guān)性的變化，通過(guò)進(jìn)一步原位雜交檢測(cè)、定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶連鎖反應(yīng)(qRT-PCR)、蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)以及免疫組化檢測(cè)等驗(yàn)證了miR-98可結(jié)合甲基cpG結(jié)合蛋白2(MeCP2)的3′-非翻譯區(qū) (UTR)來(lái)抑制Mecp2的表達(dá)，從而使與葡萄糖攝取相關(guān)的基因TrPC3表達(dá)失調(diào)[22]。

綜上所述，DNA甲基化與糖尿病腎病的發(fā)病密切相關(guān)，現(xiàn)已證實(shí)DNA甲基化與糖尿病腎病發(fā)病過(guò)程中炎性損傷、氧化應(yīng)激、腎臟纖維化、細(xì)胞凋亡、非編碼RNA等機(jī)制有關(guān)，對(duì)DNA甲基化的進(jìn)一步研究有助于加深對(duì)于糖尿病腎病發(fā)病機(jī)制的理解。此外，由于表觀遺傳學(xué)修飾具有可逆性，DNA甲基化的相關(guān)研究為糖尿病腎病的防治提供了新的思路，有利于提高糖尿病腎病的臨床診治水平。