葉 夢 賈冰冰 梁晨思 霍麗蓉

神經(jīng)纖維瘤病是一組常染色體顯性遺傳病，包括Ⅰ型神經(jīng)纖維瘤病(neurofibromatosis type 1，NF1)，2型神經(jīng)纖維瘤病(neurofibromatosis type 2，NF2)，神經(jīng)鞘瘤(schwannomatosis)。其中， NF2發(fā)病較少，發(fā)病基因Nf2位于22號染色體。神經(jīng)鞘瘤較為罕見，發(fā)病基因可能為INI1/SMARCB或LZTR1，兩者均位于22號染色體[1]。NF1最為常見，發(fā)病基因Nf1位于17號染色體。

一、Nf1基因與Nf1基因突變

Nf1(neurofibromatosis 1)基因定位于17q11.2，含60個外顯子，包含3個可變剪接(9a、23a、48a)，是人類基因組中最大的基因之一，其DNA全長超過280kb，翻譯產(chǎn)物——神經(jīng)纖維瘤蛋白(neurofibromin)相對分子質(zhì)量達350000。在功能上，Nf1屬于抑癌基因。由外顯子21～27a編碼的Ras-GTP酶激活蛋白相關(guān)結(jié)構(gòu)域(Ras-GTPase activating protein-related domain，GRD)能夠抑制Ras-GDP非活性形式轉(zhuǎn)化為Ras-GTP活性形式，并促進其相反過程[2]。因此，神經(jīng)纖維瘤蛋白是Ras信號轉(zhuǎn)導通路重要的負性調(diào)節(jié)因子。在Nf1-GRD區(qū)域上游，由外顯子11～17片段編碼的富含半胱氨酸/絲氨酸結(jié)構(gòu)域(cysteine-serine-rich domain, GSRD)編碼蛋白質(zhì)ATP結(jié)合位點以及3個潛在的cAMP依賴性蛋白激酶結(jié)合位點，可以調(diào)控cAMP-PKA通路。另外，由外顯子13～14區(qū)段編碼的微管相關(guān)蛋白(microtubule-associated-protein, MAP)，可與微管結(jié)合并調(diào)控微管功能。

Nf1基因結(jié)構(gòu)復雜，突變多發(fā)。據(jù)人類基因突變庫(Human Gene Mutation Database，HGMD)顯示，截至2015年，Nf1基因已有超過1400個突變，包括剪接突變、無義和錯義突變，以及缺失、插入、易位和移碼突變。其中無義突變占多數(shù)。Nf1基因突變患者中50%的患者為自發(fā)突變，包括散發(fā)病例及家族性患者。然而Nf1基因突變?nèi)狈ν蛔儫狳c，這使得臨床表型與基因突變位點的關(guān)系研究困難重重。

二、Ⅰ型神經(jīng)纖維瘤病及其相關(guān)血管病變

Nf1基因突變會導致Ⅰ型神經(jīng)纖維瘤病(NF1)，發(fā)生率約為1/3000～1/2500，無性別、民族與種族差異[3]。其臨床表現(xiàn)多樣，以皮膚多發(fā)牛奶-咖啡色斑(cafe′-au-lait macules)、皮膚神經(jīng)纖維瘤、虹膜錯構(gòu)瘤(iris lisch nodules)等為典型特征。一些Nf1患者還會發(fā)生骨骼異常、腦腫瘤、周圍神經(jīng)腫瘤、學習障礙和注意力缺陷等。部分患者的表現(xiàn)局限于身體的一部分，稱為“節(jié)段型”或“鑲嵌型”Ⅰ型神經(jīng)纖維瘤病(mosaic neurofibromatosis 1)，這可能是由Nf1基因發(fā)生的突變?yōu)樘浩诘捏w細胞突變所致。

Nf1突變還會導致血管病變，盡管屬于NF1罕見并發(fā)癥，但由于后果嚴重，在近年來也逐漸受到關(guān)注。在不同的統(tǒng)計結(jié)果顯示，NF1相關(guān)血管病變在NF1患者中的發(fā)生率在0.4%～8.0%[4, 5]。其發(fā)病多于兒童期或成年早期開始，主要累及腦、腎臟、腸系膜、冠狀動脈及外周小血管，且多數(shù)患者受累血管不止一處，可導致血管狹窄、閉塞、動脈瘤、動脈瘤破裂及血管瘺[6]。在這些血管病變中，腎動脈病變最為常見(41%)，是導致NF1患者高血壓的主要原因。

約1/2 NF1相關(guān)血管病變死亡患者是由腦血管病導致。腦血管異常多是由頸內(nèi)動脈、大腦中動脈及大腦前動脈的狹窄或閉塞引起，狹窄血管周圍形成的擴張的毛細血管，在腦血管造影中顯示煙霧狀，即為煙霧病(moya-moya syndrome，MMS)，是兒童NF1患者最常見的腦血管病[7]。雖然NF1為單基因遺傳病，但有研究表明NF1相關(guān)MMS與同樣位于17號染色體上的RNF213 基因有密切關(guān)聯(lián)[8]。除了出現(xiàn)MMS外，NF1患者還會出現(xiàn)頸內(nèi)動脈、椎動脈、枕動脈的動脈瘤以及動靜脈瘺，但較為少見，且可以出現(xiàn)在老年患者中。腦部血管病變的臨床癥狀多為因缺血導致的乏力、不自主運動、頭痛及癲癇發(fā)作，兒童多見。成人也可出現(xiàn)類似癥狀，需與顱內(nèi)出血鑒別診斷。

三、NF1相關(guān)血管病變的發(fā)病機制

神經(jīng)纖維瘤蛋白在血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)、內(nèi)皮細胞(endothelial cells, ECs)和施萬細胞(schwann cells)等中均有表達。Nf1基因突變會導致神經(jīng)纖維瘤蛋白表達發(fā)生改變，進而導致血管病變的發(fā)生。NF1相關(guān)血管病變發(fā)病機制十分復雜，根據(jù)已發(fā)表論著，整理如下：

1.神經(jīng)纖維瘤蛋白對于心血管的正常發(fā)育有關(guān)鍵作用:Nf1基因敲除小鼠因嚴重的心血管發(fā)育缺陷而發(fā)生胚胎致死，這曾被認為是由于神經(jīng)嵴細胞Nf1基因的異常。但Aaron等發(fā)現(xiàn)，特異性敲除神經(jīng)嵴細胞Nf1基因，并不會導致小鼠胚胎心臟心內(nèi)膜墊和心肌發(fā)育異常，而特異性敲除ECs的Nf1基因卻能夠得到這樣的結(jié)果，揭示了ECs表達的神經(jīng)纖維瘤蛋白在心臟發(fā)育過程中有重要作用；另外，他們還在Nf1-/-小鼠心臟的心內(nèi)膜墊上發(fā)現(xiàn)了大量磷酸化的MAPK，這意味著MAPK重要激活通路——Ras-MAPK通路的上調(diào)。神經(jīng)纖維瘤蛋白在心外膜EMT過程中也起關(guān)鍵調(diào)控作用。心外膜在發(fā)育的過程中發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，這是冠狀動脈平滑肌細胞和成纖維細胞的主要來源。Baek等[9]特異性地敲除心外膜Nf1基因后，發(fā)現(xiàn)會導致心臟更早地、自發(fā)地發(fā)生心外膜EMT，從而促進成纖維細胞、冠狀動脈平滑肌細胞的增殖，進而導致血管發(fā)育不良。

2.神經(jīng)纖維瘤蛋白的缺乏導致多種血管生長因子增加:腫瘤的進展多是由于各種血管生長因子的過表達。研究表明NF1患者VEGF及bFGF水平明顯升高。VEGF家族是脈管系統(tǒng)的重要調(diào)節(jié)因子，能夠誘導血管、淋巴管的生成，血管內(nèi)膜重排并能趨化VSMCs、ECs，這些都能促進新血管的形成。而NF1患者VEGF表達上調(diào)是由Nf1基因單倍體不足直接導致，而不是由 mTOR-HIF-1α-VEGF信號通路介導[10]。bFGF與VEGF相似，在介導損傷后新生血管的生成具有重要作用。Muir等的研究也從NF+/-小鼠血管內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)了過量bFGF的表達。

3.血管細胞及骨髓源性細胞的異常增殖與遷移導致血管的狹窄與阻塞

(1)VSMCs及ECs的異常增殖與遷移:NF1相關(guān)血管病變的典型病理表現(xiàn)就是VSMCs及ECs的異常增殖與遷移。盡管不同血管病變的病理改變不完全相同，如動脈狹窄是平滑肌細胞增殖和向內(nèi)重塑的結(jié)果，動脈瘤則是血管平滑肌細胞凋亡和向外重塑的結(jié)果。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)NF1雜合小鼠血管ECs對有絲分裂元的反應(yīng)十分敏感，ECs增殖及遷移明顯增多，新血管生成增加。他們還在增殖的血管中發(fā)現(xiàn)了大量炎性細胞的浸潤，包括巨噬細胞與肥大細胞，并認為這種變化發(fā)生在血管增生之后。Bajaj等[2]的研究則表明Nf1基因的缺失會直接導致受損ECs自動進入細胞周期。Li的科研團隊發(fā)現(xiàn)給予Nf1+/-小鼠格列衛(wèi)(Gleevec，PDGF-BB-Ras-Erk通路抑制劑)能夠減少VSMCs的增殖與遷移及Erk的激活，提示神經(jīng)纖維蛋白通過PDGF-BB-Ras-Erk信號軸維持著血管壁的穩(wěn)定。Jousma等[11]研究表明， Erk抑制劑不能阻止神經(jīng)纖維瘤的生長，但是能夠抑制腫瘤早期的生長，減少腫瘤血供。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)VSMCs Nf1基因特異性敲除小鼠的血管尚能夠正常生長，在血管損傷時，平滑肌細胞才表現(xiàn)出內(nèi)膜的異常，表現(xiàn)為內(nèi)膜增厚及新血管生成。這是由于血管損傷后，Ras及其下游效應(yīng)物異常激活，而GRD結(jié)構(gòu)域的表達能夠挽救這種變化。另有研究表明，神經(jīng)纖維瘤內(nèi)的干細胞因子(stem cell factor, SCF，也稱KitL)過量表達，并發(fā)現(xiàn)其主要由施萬細胞(schwann cells)產(chǎn)生;在Nf1+/-肥大細胞中，KitL是促進其遷移的主要因子。在Nf1-/-造血干細胞中轉(zhuǎn)染GAP 相關(guān)結(jié)構(gòu)域(GAP related domain, GRD)發(fā)現(xiàn)，造血干細胞的增殖顯著減少。

(2)單核-吞噬細胞參與的炎癥、氧化應(yīng)激機制：Li等[13]研究發(fā)現(xiàn)單獨雜合VSMCs或ECs的Nf1基因均不會引起損傷后心血管的生成和血管壁的增厚，但骨髓源性細胞(bone marrow-derived cells，BMDCs)Nf1基因缺失則會導致這樣的后果，且在新生血管內(nèi)80%以上的BMDCs為巨噬細胞，另外VSMCs能夠促進巨噬細胞的浸潤，進一步加重血管病變，這樣的發(fā)現(xiàn)也符合臨床無任何血管病變臨床癥狀的NF1患者外周血炎性細胞(如巨噬細胞、肥大細胞)及炎性因子(如IL-6、IL-1、Fractalkine)增多的現(xiàn)象，提示單核-吞噬細胞在NF1患者中血管病變中起到的核心作用[12]。Li等[13]還發(fā)現(xiàn)髓系細胞Nf1基因雜合小鼠動脈瘤形成增加、髓系細胞(myeloid cells)增多以及氧化應(yīng)激增強。

Bessler等[14]通過一系列實驗闡述了炎癥及氧化應(yīng)激在NF1血管損傷中的作用機制。巨噬細胞能夠直接產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species, ROS)，Ras活性增高也能提高細胞內(nèi)ROS水平。使用NADPH氧化酶-2抑制劑能夠抑制Nf1+/-小鼠新內(nèi)膜的形成及VSMCs的增殖與遷移。很多NF1患者盡管無血管病癥狀，但是外周血單核細胞增多，細胞核DNA氧化損傷增加，即慢性暴露于氧化應(yīng)激狀態(tài)，從而導致SMCs的增殖與遷移。Bessler等[15]進一步研究發(fā)現(xiàn)，僅敲除單核-吞噬細胞的Nf1基因即可構(gòu)造NF1相關(guān)血管病變模型，且能夠動員單核細胞趨化因子受體-2(CCR-2)進入外周血。CCR-2是單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)的主要受體，MCP-1是募集和活化單核細胞最重要的趨化因子。MCP-1越多，Nf1+/-巨噬細胞增殖與遷移越多，Ras激酶表達越多。巨噬細胞自身也分泌VEGF，另外，VSMCs也表達CCR2，進一步促進血管的再生。給予Nf1+/-小鼠CCR2拮抗劑，能夠有效減少新內(nèi)膜的形成。這表明MCR-1/CCR-2信號軸對單核-吞噬細胞的募集作用在新內(nèi)膜的形成及血管損傷中有重大作用，為NF1血管病的治療提供了可行的靶點。Debra等[16]研究也證實了氧化應(yīng)激在NF1患者新血管形成過程中的重要作用，并且抗氧化治療能夠挽救Nf1+/-小鼠血管表型。另外，Nf1基因突變的施萬細胞分泌KIT 配體增多，促進巨噬細胞分泌轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor-β,TGF-β)[17]。TGF-β對巨噬細胞也有極強的趨化作用，進一步證明炎性細胞在血管形成過程中的重要作用。

總之，Nf1基因?qū)τ谘艿陌l(fā)育及生長極其重要，作為Ras轉(zhuǎn)導通路的重要負性調(diào)節(jié)因子，神經(jīng)纖維瘤蛋白的減少直接或間接促進各種生長因子和炎性因子的激活,從而導致血管壁的增厚和新血管的形成，造成血管的各種病變。

四、動物模型

隨著研究的深入，NF1相關(guān)血管病變動物模型不斷建立，每一種新模型的建立都意味著對NF1相關(guān)血管病變形成機制更深入、更全面的理解。1990年，Nf1基因被成功克隆，隨后成功構(gòu)建Nf1基因的突變體。1994年發(fā)現(xiàn)Nf1-/-小鼠由于心臟發(fā)育異常導致胚胎致死。2003年，Aaron等通過cre/loxp系統(tǒng)，特異性敲除血管內(nèi)皮Nf1基因(Nf1 ec)，也發(fā)現(xiàn)Nf1 ec小鼠及Nf1基因敲除小鼠胚胎致死，并且發(fā)現(xiàn)兩者心臟出現(xiàn)了相同的改變，由此構(gòu)建了NF1血管病的小鼠模型，并證明內(nèi)皮細胞在血管形成中有重要作用。有相關(guān)研究通過Nf1+/-小鼠的頸總動脈內(nèi)皮剝離及血管拉伸，成功構(gòu)造Nf1+/-小鼠血管損傷模型。Bessler等[15]還通過敲除單核-吞噬細胞Nf1基因，也成功構(gòu)造了小鼠NF1相關(guān)血管病變模型。

除了小鼠模型，Padmanabhan等[18]在斑馬魚15號染色體(Nf1a)和10號染色體(Nf1b)中發(fā)現(xiàn)了與人類Nf1基因十分相似的基因片段。而斑馬魚的結(jié)構(gòu)特點允許對其血管異常的進展情況從胚胎期開始進行觀測，便于對NF1相關(guān)血管病變的結(jié)構(gòu)-功能進行分析及遺傳篩選。

另外，小型豬具有與人類十分相似的心血管系統(tǒng)，可以作為研究NF1相關(guān)血管病變發(fā)病機制及藥物篩選的理想動物模型。然而國內(nèi)外對此仍研究較少，Meyerholz等[19]通過對NF1可能的生物標記進行免疫組化，包括β-tubulin Ⅲ， PCNA及caspase-3等15種生物標記，填補了Nf1轉(zhuǎn)化豬研究的空白。

五、展 望

隨著研究的深入，人們對Ⅰ型神經(jīng)纖維瘤病血管病變的臨床、病理特點及發(fā)病機制的了解在過去的25年發(fā)生了突破性的進展，也為其治療帶來了眾多指導性建議，例如口服辛伐他汀或抗氧化夾竹桃麻素(antioxidant apocynin)能夠減少Nf1+/-小鼠動脈瘤形成；給予Nf1+/-小鼠NO合酶(NOS)拮抗劑NG-硝基-L-精氨酸甲酯或抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸能夠改善小鼠NF1血管表型等。另外，也有很多關(guān)于NF1相關(guān)血管病變外科治療成功的報道，例如通過使用血管內(nèi)栓塞線圈和醫(yī)用黏合劑(N-丁基-2-氰基丙烯酸酯)成功治療腰動脈動脈瘤破裂，Bargiela等也證實血管內(nèi)治療(包括栓塞線圈、血管內(nèi)支架、球囊擴張器等)對于不同年齡段NF1相關(guān)血管病變患者是安全而有效的。

盡管這些治療手段多停留在實驗階段或只是少數(shù)的病例報道，但隨著對NF1相關(guān)血管病變發(fā)病機制不斷深入地了解，必將揭開NF1相關(guān)血管病變的神秘面紗，從而獲得有效的治療途徑。