袁 泉，趙 博，劉 戀，黎 梅，王雅楓，夏中元

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院麻醉科，武漢 430060)

生物的晝夜節(jié)律是生物體適應(yīng)周期性環(huán)境變化的先天性能力。晝夜節(jié)律能夠通過重置自己的節(jié)律適應(yīng)不斷變化的環(huán)境[1]，但晝夜節(jié)律的長(zhǎng)時(shí)間中斷也會(huì)對(duì)大腦的生理和生物學(xué)行為產(chǎn)生負(fù)面影響，甚至可能會(huì)導(dǎo)致代謝和心臟生理功能紊亂，最終導(dǎo)致腦血管事件[2]。事實(shí)上，一日內(nèi)腦卒中事件的發(fā)生率在不同時(shí)間點(diǎn)也具有差異性。盡管全天都有可能發(fā)生腦缺血事件，但研究表明，卒中的發(fā)生率在早上6點(diǎn)至下午2點(diǎn)增加，特別是患者清醒后的2 h內(nèi)；而在午夜至早上6點(diǎn)降低[2]。由此可見，生物的晝夜節(jié)律不僅影響著正常的生理活動(dòng)，而且對(duì)病理性改變也有影響。在哺乳動(dòng)物晝夜節(jié)律的核心負(fù)反饋環(huán)中，Bmal1-Clock復(fù)合體是關(guān)鍵的調(diào)控元件，其與Period(Per)基因上的E-box結(jié)合驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)錄激活和抑制是哺乳動(dòng)物內(nèi)源性晝夜節(jié)律性的主要基礎(chǔ)[3]。現(xiàn)就時(shí)鐘基因Bmal1在腦缺血再灌注損傷中的作用及其機(jī)制進(jìn)行討論。

1 時(shí)鐘基因Bmal1

生物鐘是由各種起調(diào)控作用的信號(hào)分子和自動(dòng)調(diào)節(jié)反饋生理活動(dòng)的各種回路共同作用形成的[4-5]。Bmal1-Clock復(fù)合體通過結(jié)合Per基因上的E-box啟動(dòng)子，激活Per和Cryptochrome(Cry)兩個(gè)時(shí)鐘基因的轉(zhuǎn)錄。反過來Per-Cry復(fù)合體也會(huì)抑制Bmal1-Clock復(fù)合體的活性，從而關(guān)閉負(fù)反饋環(huán)[5-7]，這一過程發(fā)生在晝夜節(jié)律的主觀白晝，也就是說在主觀白晝，Bmal1的表達(dá)量是減少的；而在主觀夜晚期間，Cry的降解可重新激活Bmal1-Clock復(fù)合體，并重新啟動(dòng)Cry和Per轉(zhuǎn)錄[8]。說明Bmal1轉(zhuǎn)錄翻譯的震蕩在晝夜節(jié)律的形成中起重要作用。

研究表明，Bmal1存在多種形式的翻譯后修飾，而這些調(diào)控對(duì)其功能轉(zhuǎn)變起重要作用[9]。Bmal1是SUMO(small ubiquitin-like modifier)化的底物，而這種修飾在生物鐘振蕩現(xiàn)象的形成中不可或缺[10]。研究證實(shí)，Bmal1也存在泛素化，并且Bmal1-Clock的活性與Bmal1泛素化的水平密切相關(guān)；Bmal1的磷酸化圖譜表現(xiàn)出強(qiáng)烈的晝夜節(jié)律[11-12]；Bmal1的乙酰化也存在節(jié)律性，研究表明，組蛋白去乙?；鞍准易宓幕钚砸泊嬖谝欢ǖ墓?jié)律性，并受煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴性去乙?；?sirtuin)家族的調(diào)控，而sirtuin家族與Clock結(jié)合并被招募到Clock-Bmal1染色質(zhì)復(fù)合物上，導(dǎo)致Bmal1的Lys9/Lys14位點(diǎn)被節(jié)律性地乙?；?，從而引起下游一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)[13]。以上研究表明，Bmal1受到多種形式的修飾，從而引起一系列重要的晝夜節(jié)律性改變，與生物體晝夜節(jié)律的形成密切相關(guān)。Bmal1也影響著生物體內(nèi)從代謝到細(xì)胞程序性死亡等多種重要的生理病理過程。

腦缺血損傷狀態(tài)下，生物體的晝夜節(jié)律發(fā)生紊亂，會(huì)失去其原有節(jié)律。在分子水平，時(shí)鐘基因的轉(zhuǎn)錄水平、翻譯后修飾水平的正常節(jié)律會(huì)發(fā)生變化[14]，而這些變化又會(huì)進(jìn)一步引起病理性變化。

2 Bmal1與腦缺血再灌注損傷

缺血再灌注損傷發(fā)生在組織血供被阻斷后再次恢復(fù)血供的各種臨床醫(yī)療環(huán)境中，如突發(fā)疾病(如心肌梗死、腦卒中)、擇期手術(shù)(如移植、血管手術(shù)或應(yīng)用止血帶的手術(shù))等。世界范圍內(nèi)，急性缺血性腦卒中因腦血流量減少而導(dǎo)致腦功能喪失是致殘和致死的主要原因之一，經(jīng)治療血運(yùn)重建后可能會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的并發(fā)癥，而缺血再灌注損傷便是其中之一。研究人員觀察腦卒中發(fā)生率時(shí)間變異性的同時(shí)發(fā)現(xiàn)，在Zeitgeber time(ZT)18時(shí)，時(shí)鐘蛋白PerⅠ、Clock、Bmal1的表達(dá)量顯著增加，腦卒中發(fā)生率降低與Bmal表達(dá)量增加這兩個(gè)事件在時(shí)間上有重合[2]。另有研究表明，與正常腦組織相比，發(fā)生缺血再灌注損傷的腦組織時(shí)鐘基因Bmal1表達(dá)的晝夜節(jié)律及轉(zhuǎn)錄、翻譯后修飾水平發(fā)生了變化[14]，這種缺血區(qū)與非缺血區(qū)之間生物鐘節(jié)律的不同步性會(huì)加劇腦缺血的發(fā)生和發(fā)展[15]。

腦缺血再灌注損傷的病理生理機(jī)制包括興奮性毒性神經(jīng)遞質(zhì)的釋放、細(xì)胞內(nèi)Ca2+的積累、自由基損傷、神經(jīng)元凋亡、神經(jīng)炎癥以及脂解作用[16-22]。Bmal1是通過何種途徑影響腦缺血再灌注損傷過程中的哪一環(huán)節(jié)仍在研究中。從目前的研究成果來看，Bmal1不僅僅作用于腦缺血再灌注損傷中的某一單一機(jī)制，而是多重影響腦缺血再灌注損傷的結(jié)果，并且損傷機(jī)制也會(huì)影響B(tài)mal1的轉(zhuǎn)錄和翻譯。

2.1Bmal1與氧化應(yīng)激 在腦缺血再灌注損傷復(fù)雜的病理生理機(jī)制中，自由基學(xué)說起到了關(guān)鍵作用。自由基分為活性氧類和活性氮兩大類。氧自由基過量導(dǎo)致的氧化應(yīng)激在腦缺血再灌注損傷中有重要作用。在組織缺血再灌注過程中有4種途徑可以產(chǎn)生過量的氧自由基：線粒體呼吸鏈，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化過程，環(huán)加氧酶2催化的花生四烯酸反應(yīng)，黃嘌呤和次黃嘌呤氧化過程[23]。過量的氧自由基可引起氧化應(yīng)激并造成DNA損傷、脂質(zhì)過氧化以及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的改變，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。雖然大腦僅占人體體重的2%，但腦組織耗氧量占人體總耗氧量的20%，故產(chǎn)生的自由基遠(yuǎn)多于其他器官。此外，腦組織含有大量脂質(zhì)、不飽和脂肪酸以及高水平的鐵離子[24]，因此大腦更易受氧自由基的損傷[25-26]。另外，活性氧類還可以調(diào)控細(xì)胞凋亡和壞死的信號(hào)通路，如p53和Bcl-2家族蛋白(Bax、Bid以及p53上調(diào)凋亡調(diào)節(jié)因子)等；調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡的促分裂原活化的蛋白激酶通路也受活性氧類的調(diào)節(jié)[27-28]。綜上，氧化應(yīng)激是腦缺血再灌注損傷的重要機(jī)制之一。

氧化應(yīng)激受時(shí)鐘基因Bmal1的調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，晝夜節(jié)律蛋白Bmal1及其二聚化伴侶Clock通過控制活性氧類的產(chǎn)生和氧化應(yīng)激參與組織穩(wěn)態(tài)的調(diào)控[28-30]。Bmal1轉(zhuǎn)錄水平下降會(huì)導(dǎo)致超氧自由基生成增加[31]。在缺血性腦卒中中活性氧類的表達(dá)水平升高，低氧誘導(dǎo)因子1α蛋白活化，對(duì)神經(jīng)元起保護(hù)作用，而Bmal1和Clock的過表達(dá)可導(dǎo)致在ZT18時(shí)低氧誘導(dǎo)因子1α被直接或間接激活，提示Bmal1可能直接或間接調(diào)控機(jī)體內(nèi)的氧化應(yīng)激[32]。Khapre等[28]研究發(fā)現(xiàn)，Bmal1-/-小鼠腎臟中活性氧類的水平升高，在心臟和脾臟中活性氧類的水平也隨著時(shí)間的推移而逐漸升高。給予抗氧化劑(N-乙酰-L-半胱氨酸)后，Bmal1-/-小鼠臟器內(nèi)的氧化應(yīng)激水平降低[33]。更有研究指出，Bmal1可調(diào)節(jié)大腦中氧化還原基因的表達(dá)，從而調(diào)控組織中氧化應(yīng)激的水平[28]。

神經(jīng)元的氧化應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞死亡和星形膠質(zhì)細(xì)胞變性。在小鼠原代神經(jīng)元中，抑制Bmal1的表達(dá)與用化學(xué)誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)氧化損傷都會(huì)促使神經(jīng)元死亡和紋狀體神經(jīng)變性；而Bmal1缺失會(huì)導(dǎo)致突觸末梢受損變性，進(jìn)而導(dǎo)致皮質(zhì)連接功能受損以及神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷加重，并誘導(dǎo)氧化還原防御基因的表達(dá)[9,33]。但在缺乏Per1和Per2的小鼠的大腦中并未觀察到星形膠質(zhì)細(xì)胞的增生[34]。在果蠅中，Per基因的缺失加劇了腦組織的神經(jīng)變性[35]。盡管Per已被證明可以促進(jìn)Bmal1-Cry的相互作用，但敲除Per基因后，Cry依舊能有效抑制Bmal1的轉(zhuǎn)錄[34,36]。所以在Per-Cry復(fù)合體中，Cry被認(rèn)為是主要的阻遏物。因此，之前提及的研究只能表明Bmal1對(duì)機(jī)體氧化應(yīng)激水平的調(diào)控不受Per的影響，但并不能表明Bmal1與機(jī)體氧化應(yīng)激水平的調(diào)控和生物節(jié)律沒有關(guān)系。因此，有關(guān)Cry對(duì)Bmal1蛋白功能的影響以及氧化應(yīng)激的晝夜節(jié)律還需進(jìn)一步研究。

2.2Bmal1與血管內(nèi)皮功能障礙及微血管重塑 血管功能障礙是很多心腦血管疾病的發(fā)病基礎(chǔ)。雖然氧化應(yīng)激在機(jī)體內(nèi)普遍存在，但血管內(nèi)皮NO依賴性血管舒張功能下降可導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞更易受氧自由基的損害。NO由內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生并釋放，但去向取決于氧自由基，如超氧化物(O2-)易與NO結(jié)合[37]。這種“清除”作用減少了可用于引起平滑肌細(xì)胞松弛的NO的量，導(dǎo)致NO依賴性血管舒張功能受損。因此，氧化應(yīng)激被認(rèn)為是降低NO生物利用度以及促進(jìn)內(nèi)皮功能障礙發(fā)展的主要原因。NO由谷氨酸代謝生成，在糖尿病患者體內(nèi)會(huì)逐漸累積，并在視網(wǎng)膜毛細(xì)血管變性中起重要作用；其次在超氧化物的存在下，NO會(huì)迅速形成強(qiáng)氧化劑——過氧亞硝酸鹽，其與蛋白質(zhì)快速作用，導(dǎo)致硝基酪氨酸形成[38]。來自Bmal1flox/flox; Tek-Cre小鼠(Bmal1特異性敲除的內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)特異性受體酪氨酸激酶的工具鼠)視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷模型的視網(wǎng)膜樣本顯示，硝基酪氨酸強(qiáng)烈染色，提示NO信號(hào)在介導(dǎo)缺血再灌注損傷中起關(guān)鍵作用[39]。研究表明，Bmal1敲除小鼠存在內(nèi)皮功能障礙，與正常小鼠相比，Bmal1基因敲除小鼠對(duì)乙酰膽堿及NO依賴性血管舒張反應(yīng)的能力嚴(yán)重受損，更重要的是，Bmal1基因敲除小鼠的血管會(huì)發(fā)生病理性重塑，在缺血情況下，血管損傷會(huì)增加[40]。推測(cè)NO與Bmal1之間形成了調(diào)控環(huán)路[40]。

細(xì)胞衰老可能參與血管內(nèi)皮功能障礙和心腦血管疾病的病理生理過程。研究顯示，腦細(xì)胞衰老與血管內(nèi)皮功能障礙的發(fā)生具有一定的聯(lián)系，其機(jī)制可能與機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)增加、間充質(zhì)干細(xì)胞增殖分化異常等相關(guān)[34]。在缺血再灌注臟器中，活性氧類的聚集以及脂質(zhì)代謝異常等促進(jìn)正常細(xì)胞進(jìn)入衰老程序，即應(yīng)激誘導(dǎo)性衰老，從而喪失正常的結(jié)構(gòu)和生理功能。因而，清除氧自由基、恢復(fù)氧化還原反應(yīng)平衡能減少血管內(nèi)皮功能障礙的發(fā)生，減輕灌注損傷和衰老等疾病的發(fā)生。研究表明，Bmal1-/-小鼠不僅表現(xiàn)出生物鐘節(jié)律紊亂，還存在早衰現(xiàn)象，表現(xiàn)為局部神經(jīng)細(xì)胞功能退化及連接功能喪失，具有激活炎癥和損傷的特征，同時(shí)還表現(xiàn)出異常血管重塑，增加了老年動(dòng)物頸動(dòng)脈血栓形成的易感性[41]。下調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞中Bmal1的水平促進(jìn)了微血管和大血管的損傷，導(dǎo)致微血管重塑與新生內(nèi)皮增加[31]。研究者在Bmal1基因敲除的缺血再灌注模型小鼠的視網(wǎng)膜無細(xì)胞毛細(xì)血管中觀察到，無細(xì)胞毛細(xì)血管的數(shù)量較野生型小鼠增加了3倍，表明Bmal1-/-小鼠的微血管增生重塑大幅上升。同樣的，與股動(dòng)脈損傷的野生型小鼠相比，Bmal1-/-小鼠損傷的股動(dòng)脈新生內(nèi)皮增生增加20%[39]。更有研究進(jìn)一步表明，Bmal1可能是通過抑制單核細(xì)胞的聚集，來減輕血管內(nèi)皮的炎性損傷以及動(dòng)脈粥樣硬化[42]。

2.3Bmal1與興奮性神經(jīng)遞質(zhì) 谷氨酸鹽是主要的興奮性氨基酸，能激活多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。該神經(jīng)遞質(zhì)參與晝夜節(jié)律的光誘導(dǎo)作用，從而調(diào)節(jié)人類的生理和行為功能。研究人員用谷氨酸能配體刺激雞小腦Bergmann神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的原代培養(yǎng)物發(fā)現(xiàn)，Bmal1的水平呈劑量-時(shí)間依賴性增加[43]。此外，在谷氨酸刺激下，Bmal1中絲氨酸殘基的磷酸化增加[43]。Bmal1表達(dá)的增加很可能是環(huán)腺苷酸依賴性蛋白激酶和(或)Ca2+/二?；视鸵蕾囆缘鞍准っ噶姿峄蠓€(wěn)定化的結(jié)果[11]。目前認(rèn)為，谷氨酸參與調(diào)節(jié)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中Bmal1的表達(dá)，而這些細(xì)胞可能在控制小腦的晝夜節(jié)律中起重要作用。有學(xué)者用神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸100 μmol/L、5-羥色胺10 μmol/L以及多巴胺10 μmol/L同時(shí)處理星形膠質(zhì)細(xì)胞，導(dǎo)致Bmal1的表達(dá)增加[44]。以上研究提示，腦缺血再灌注損傷時(shí)釋放的神經(jīng)遞質(zhì)可誘導(dǎo)Bmal1表達(dá)，并調(diào)節(jié)翻譯后修飾。

2.4Bmal1與神經(jīng)元的凋亡及自噬 Bmal1通過調(diào)控活性氧類的水平影響細(xì)胞凋亡和壞死信號(hào)通路，p53、Bcl-2家族蛋白(Bax、Bid)、促分裂原活化的蛋白激酶通路都是活性氧類誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的關(guān)鍵通路[27,45]。有證據(jù)表明，與其他時(shí)間點(diǎn)誘導(dǎo)的缺血相比，午夜(ZT18; 24:00)誘導(dǎo)的小鼠腦缺血再灌注損傷梗死體積少、腦腫脹輕、神經(jīng)功能缺損評(píng)分低、神經(jīng)元存活率高、凋亡細(xì)胞少[46]，而這可能與晝夜節(jié)律蛋白Bmal1表達(dá)的增加有關(guān)。

自噬是細(xì)胞內(nèi)自我降解的過程，自噬體與溶酶體融合后降解自噬體內(nèi)過量或受損的細(xì)胞器和細(xì)胞質(zhì)。雖然自噬通常被認(rèn)為是促進(jìn)細(xì)胞存活的，但其也在細(xì)胞死亡過程中起作用。有研究報(bào)道認(rèn)為，缺乏生物鐘蛋白的小鼠對(duì)腦缺血有更高的易感性[39-40]，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，這一現(xiàn)象與生物鐘基因依賴性調(diào)節(jié)凋亡/自噬標(biāo)志物的表達(dá)有關(guān)[47]。

3 結(jié) 語

氧化應(yīng)激是導(dǎo)致腦缺血再灌注損傷的重要機(jī)制，而Bmal1也被證實(shí)在氧化應(yīng)激水平的調(diào)節(jié)中起重要作用，因此推測(cè)Bmal1對(duì)腦缺血再灌注損傷也有一定的影響。Bmal1作為時(shí)鐘基因負(fù)反饋環(huán)中的關(guān)鍵調(diào)控元件，也調(diào)控著機(jī)體內(nèi)的氧化應(yīng)激水平、血管功能障礙以及血管重塑水平等，從而調(diào)控腦缺血再灌注損傷的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后。相對(duì)地，腦缺血再灌注損傷也可影響組織自身生物鐘節(jié)律的改變，兩者以類似于正反饋的形式相互作用。目前對(duì)于Bmal1具體是通過何種信號(hào)通路調(diào)控氧化應(yīng)激水平的尚未有定論。未來，生物鐘可作為一個(gè)新的治療靶點(diǎn)，通過調(diào)節(jié)生物鐘或其中某一重要環(huán)節(jié)如Bmal1-Clock復(fù)合體，減少腦組織缺血再灌注損傷，并對(duì)損傷起到一定修復(fù)作用。