龔玉華，徐中葉

江蘇省無錫市人民醫(yī)院 （江蘇無錫 214023）

自倫琴發(fā)現(xiàn)X射線至今，電離輻射已經(jīng)廣泛運(yùn)用于臨床疾病的診斷和治療，其中的放射治療發(fā)展尤為迅猛。人們曾經(jīng)認(rèn)為電離射線穿過細(xì)胞核引起的直接或間接的DNA損傷是產(chǎn)生放射治療生物學(xué)效應(yīng)的唯一原因[1]。1992年，Nagasawa和Little發(fā)現(xiàn)在單層培養(yǎng)的細(xì)胞中，少于1%的細(xì)胞的細(xì)胞核被單束α射線穿透，出現(xiàn)姐妹染色體交換頻率增加的細(xì)胞卻超過30%[2]。這一發(fā)現(xiàn)激發(fā)了研究者們對放射誘導(dǎo)的所謂“旁觀者效應(yīng)”的興趣，一系列與之相關(guān)的研究隨之開展。利用高線性能量傳遞（LET）射線如α射線、重粒子，或者低LET射線如X射線、γ射線，針對不同細(xì)胞分別進(jìn)行的體外或體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了旁觀者效應(yīng)的存在[3-4]，并初步探討了其發(fā)生機(jī)制。然而，該效應(yīng)的確切機(jī)制目前尚不清楚。本研究對近十年內(nèi)提出的放射誘導(dǎo)的旁觀者效應(yīng)（radio induced bystander effects,RIBE）發(fā)生機(jī)制及其常用研究方法進(jìn)行綜述。

1 研究方法

放射誘導(dǎo)的旁觀者效應(yīng)中存在兩類細(xì)胞，即“作用細(xì)胞”（受照射的細(xì)胞）與“反應(yīng)細(xì)胞”（旁觀者細(xì)胞），前者受照射后產(chǎn)生信號分子通過細(xì)胞間連接結(jié)構(gòu)傳遞或釋放到細(xì)胞外圍環(huán)境中，后者接收這些信號并產(chǎn)生與前者相類似的輻射損傷誘導(dǎo)的應(yīng)激反應(yīng)，如誘導(dǎo)基因表達(dá)、基因突變、微核形成、誘導(dǎo)分化、凋亡、惡性轉(zhuǎn)化等[5]。在諸如X射線、γ射線、重粒子等輻射中，目前使用高LET的α射線，特別是以精確的微束形式甚至特定的粒子數(shù)目照射一定的區(qū)域、單個細(xì)胞或者亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)[6-7]的方法最為常見。有研究者將“作用細(xì)胞”與“反應(yīng)細(xì)胞”共同單層培養(yǎng)或三圍聚集培養(yǎng)，旨在保證兩者間的物理接觸以便于讓細(xì)胞間的縫隙連接發(fā)揮傳遞信息的作用（gap junctiongmediated intercellular communication，GJIC）。相反，有研究側(cè)重于探討由“作用細(xì)胞”釋放入培養(yǎng)基環(huán)境中的信號，常在同一培養(yǎng)基中以稀疏集落培養(yǎng)上述兩類細(xì)胞，或者收集受照射的“作用細(xì)胞”周圍介質(zhì)來培養(yǎng)“反應(yīng)細(xì)胞”，即所謂的共培養(yǎng)轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)（cocuhure/media transfer experiments）[8]。

2 DNA損傷現(xiàn)象

旁觀者細(xì)胞的DNA損傷在旁觀者效應(yīng)的發(fā)生中有著重要的作用，與受照射細(xì)胞一樣，其DNA可能發(fā)生的損傷在類型和分布上都相當(dāng)復(fù)雜，目前已被識別的有20多種，包括堿基突變、DNA單鏈斷裂（SSB）、雙鏈斷裂（DSB）以及共價結(jié)合所導(dǎo)致的DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)、DNA-DNA交聯(lián)等。在受到直接照射的“作用細(xì)胞”中，因DNA雙鏈斷裂引起的染色體異常占主導(dǎo)，而“反應(yīng)細(xì)胞”的染色體異常則多因堿基損傷或是單鏈斷裂所致[9]。研究者們常通過觀察微核形成（MN）、姐妹染色體交換（SCE）及使用γH2AX foci技術(shù)等作為DNA、染色體損傷的證據(jù)[10]。Kashino等[11-12]利用共培養(yǎng)轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)，將接受過1 Gy常規(guī)X射線照射的3種中國倉鼠卵巢細(xì)胞（CHO）（包括野生型、缺乏SSB修復(fù)能力和缺乏DSB修復(fù)能力）的培養(yǎng)基質(zhì)分別轉(zhuǎn)移給缺乏DSB修復(fù)能力的xrs5細(xì)胞，培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)3個樣本中xrs5細(xì)胞發(fā)生MN的程度并無差異。然而，將受X射線照射過的CHO細(xì)胞的基質(zhì)轉(zhuǎn)移到另一培養(yǎng)基中，在這一培養(yǎng)基中同時培養(yǎng)具有DNA修復(fù)能力的CHO及不具有DSB修復(fù)能力的xrs5細(xì)胞，利用克隆形成分析兩者，結(jié)果發(fā)現(xiàn)xrs5細(xì)胞對可能存在的“旁觀者信號”的敏感程度明顯高于CHO。綜合以上實(shí)驗(yàn)，Kashino等[11-12]提出接收旁觀者信號的細(xì)胞的DNA修復(fù)能力決定了旁觀者細(xì)胞的復(fù)雜應(yīng)答反應(yīng)，而非產(chǎn)生這些信號的細(xì)胞的DNA修復(fù)能力。

旁觀者細(xì)胞產(chǎn)生DNA損傷影響細(xì)胞的功能與存活，是旁觀者效應(yīng)中最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)之一。有研究認(rèn)為這與旁觀者細(xì)胞活性氧簇的形成、線粒體功能和線粒體依賴的信號通路以及鈣離子的流動[13]有關(guān)，其具體機(jī)制仍然是一個研究熱點(diǎn)。

3 涉及機(jī)制

3.1 活性氧簇、線粒體和核因子-кB

活性氧簇（ROS）是一類化學(xué)性質(zhì)極活潑的物質(zhì)，在正常人體內(nèi)通過氧代謝產(chǎn)生，對細(xì)胞、組織具有一定的損傷作用。研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)放射線照射后的細(xì)胞ROS增多，另有大量證據(jù)表明ROS與旁觀者效應(yīng)的發(fā)生密切相關(guān)，但是ROS極不穩(wěn)定的特性決定了其作用時限和范圍的局限性，如羥自由基的存在時間和彌散能力均是以納秒、納米來計(jì)的，這些都提示ROS的作用可能是通過調(diào)節(jié)信號通路來實(shí)現(xiàn)的[14]。Shao等[15]在照射T98G細(xì)胞引起AG01522細(xì)胞旁觀者效應(yīng)的研究中發(fā)現(xiàn)ROS的產(chǎn)生還與NO，TGF-β1有關(guān)。Chen等[16]利用共培養(yǎng)轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)，將rho（+）細(xì)胞和 rho（-）細(xì)胞照射10 min后的基質(zhì)分別轉(zhuǎn)移給旁觀者細(xì)胞培養(yǎng)基，結(jié)果發(fā)現(xiàn)照射rho（+）細(xì)胞得到的基質(zhì)引起旁觀者細(xì)胞ROS增加了35%，明顯高于另一組，而通過觀察γH2AX foci發(fā)現(xiàn)ROS增加明顯的旁觀者細(xì)胞DNA損傷較另一組嚴(yán)重的多，另外，ROS清除劑DMSO處理后的細(xì)胞DNA損傷明顯減輕。該實(shí)驗(yàn)一方面證實(shí)了活性氧簇在旁觀者效應(yīng)中發(fā)揮著巨大作用，另一方面提示了旁觀者細(xì)胞ROS的量以及DNA損傷程度與受照射細(xì)胞的線粒體DNA功能存在一定的聯(lián)系。研究發(fā)現(xiàn)缺乏線粒體DNA的人皮膚纖維母細(xì)胞無論作為受照射細(xì)胞還是旁觀者細(xì)胞，其所得到的旁觀者效應(yīng)強(qiáng)度均不如野生型，這一點(diǎn)更加證實(shí)了線粒體功能的重要性。利用Bay11抑制核因子-кB活性、PTIO清除NO或通過抑制鈣離子的攝取從而抑制iNOS都能增強(qiáng)旁觀者細(xì)胞的DNA穩(wěn)定性，減少突變發(fā)生的頻率[17-18]。

根據(jù)以上分析，一條依賴于線粒體功能，有活性氧簇參與，以iNOS、NO、核因子-кB為主線的旁觀者效應(yīng)的調(diào)節(jié)機(jī)制呈現(xiàn)在眼前，這為進(jìn)一步探究更精確的機(jī)制提供了思路。

3.2 可溶性因子擴(kuò)散與MAPK通路

研究表明，受照射后的細(xì)胞可能釋放一些可溶性因子，這些因子一方面形成了細(xì)胞周圍的炎癥微環(huán)境，另一方面可能與未照射的臨近細(xì)胞接觸，引發(fā)旁觀者效應(yīng)，這可能是RIBE發(fā)生的重要機(jī)制之一。已經(jīng)被實(shí)驗(yàn)證實(shí)存在的可溶性因子包括TGF-β1[14]、白介素-6、白介素-8[19]、轉(zhuǎn)化生長因子-α（TGF-α）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等。有證據(jù)顯示白介素-8、TGF-α、TNF-α和TGF-β1可以與旁觀者細(xì)胞上的相應(yīng)受體結(jié)合，激活旁觀者細(xì)胞的MAPK信號通路家族[9]。MAPK信號通路家族包括ERK、JNK和p38，以上的分泌因子激活這些通路，并進(jìn)一步通過核因子-кB、AP1和ATF-2等影響旁觀者細(xì)胞的生存能力和基因突變，從而表現(xiàn)出旁觀者效應(yīng)。Coates等[20]發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞的應(yīng)答反應(yīng)在受照射后炎癥微環(huán)境的形成和引發(fā)基因型依賴的旁觀者效應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。針對可溶性因子及受體和MAPK通路的深入研究或許將使掌控旁觀者效應(yīng)成為可能。

3.3 GJIC的作用

縫隙連接（GJ）又稱融合膜，散在分布于相鄰細(xì)胞間，是動物細(xì)胞中最普遍存在的一種細(xì)胞連接。它由6個柱狀蛋白質(zhì)亞基組成，這些亞基環(huán)形排列形成通道樣結(jié)構(gòu)連接相鄰細(xì)胞的質(zhì)膜。這種通道結(jié)構(gòu)可以允許分子量低于1500的水溶性分子直接通過，通道在pH值降低或鈣離子濃度升高時會變小甚至關(guān)閉，以保護(hù)臨近細(xì)胞不受影響[21]。目前大量證據(jù)表明GJIC參與了旁觀者效應(yīng)的發(fā)生[2,9]。為研究縫隙連接對于旁觀者效應(yīng)的作用，大部分實(shí)驗(yàn)都選用以α射線照射單層培養(yǎng)的細(xì)胞中的一小部分，通過觀察非照射部分的應(yīng)答反應(yīng)進(jìn)行判斷。Shao等[22]嘗試使用重粒子（碳粒子束）照射單層培養(yǎng)的人纖維母細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)照射劑量越低，發(fā)生微核形成的數(shù)目卻在增加，并且這種對低劑量照射的敏感性隨著GJIC增強(qiáng)劑8-Br-cAMP的使用而增強(qiáng)，相反，GJIC的抑制劑林丹則可明顯減弱基因的毒性反應(yīng)。然而，允許通過縫隙連接的分子種類繁多，可以是核苷酸、多肽或者第二信使等，具體是何種分子的傳遞引發(fā)了旁觀者效應(yīng)有待進(jìn)一步的研究揭示。

4 總結(jié)與展望

經(jīng)過數(shù)十年的研究，人們對旁觀者效應(yīng)的認(rèn)識正在日漸加深。根據(jù)旁觀者效應(yīng)已知的一些特點(diǎn)可以推測，它對腫瘤的放射治療有著重大的建設(shè)性作用：利用它對未照射細(xì)胞的影響，可以減少照射劑量，縮小照射范圍而達(dá)到相同的治療效果；阻斷它對鄰近正常組織的效應(yīng)則可以起到保護(hù)正常組織、提升放射治療靶向特異性的作用。相信隨著研究的繼續(xù)深入，對放射誘導(dǎo)旁觀者效應(yīng)的機(jī)制認(rèn)識將更加透徹，并最終可以將其應(yīng)用到放射治療和防護(hù)的實(shí)際工作中。