高 琦，郭 艷，魏小娟

新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院消化內(nèi)科，河南 新鄉(xiāng) 453000

胰腺癌是常見的惡性腫瘤之一，是導致發(fā)達國家癌癥患者死亡的第4大原因，并且預計到2050年，胰腺癌將成為導致美國癌癥患者死亡的首要原因［1-2］。胰腺癌在中國同樣屬于高發(fā)疾病，據(jù)統(tǒng)計，2015年中國約有90 100例胰腺癌新發(fā)病例，并有7 9400人死于胰腺癌［3］。研究表明，胰腺癌具有較高的侵襲和轉移能力，約有超過85%的胰腺癌患者在初次診斷時就已經(jīng)出現(xiàn)癌細胞的局部浸潤或遠處轉移［4］。胰腺癌患者的中位存活時間也僅有5～6個月，5年內(nèi)存活率低于5%［5］。雖然目前對于胰腺癌的治療取得了一定的進展，但由于胰腺癌細胞容易形成放化療抵抗而導致胰腺癌患者死亡率難以降低。因此，尋找治療胰腺癌的新藥物是降低胰腺癌患者死亡率的關鍵。雷公藤紅素（celastrol）是提取自中藥雷公藤的一類三萜類化合物，研究發(fā)現(xiàn)，celastrol具有較強的抗癌活性，能抑制前列腺癌、食管癌及胃癌等多種癌癥的發(fā)展，并且對癌癥的轉移也具有顯著的抑制作用［6-8］。Zhao等［9］研究發(fā)現(xiàn)，celastrol還能誘導胰腺癌細胞凋亡，但對胰腺癌細胞侵襲及遷移能力的影響還少見報道。本研究以人胰腺癌細胞PANC-1為研究對象，探究celastrol對胰腺癌細胞侵襲及遷移能力的影響。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

RPMI-1640細胞培養(yǎng)液和胎牛血清由美國Gibco公司提供，celastrol購自美國Sigma公司，RIPA裂解液、BCA試劑盒及細胞計數(shù)試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）由美國Pierce公司提供。Matrigel購自美國Millipore公司，Ki-67、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）一抗購自美國Santa Cruz公司，HRP標記山羊抗小鼠和HRP標記山羊抗兔二抗購自北京博奧森生物技術有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

人胰腺癌細胞PANC-1購自美國ATCC公司。用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液將PANC-1細胞培養(yǎng)于37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的恒溫培養(yǎng)箱中，隔天換液1次，2～3天進行傳代培養(yǎng)，細胞傳代的密度為2×104個/mL。

1.3 試劑配置

用微量的二甲基亞砜將celastrol全部溶解，使二甲基亞砜終濃度不超過0.1%，隨后加入無血清培養(yǎng)液的celastrol配制為1 mmol/L的儲存液儲存于-20 ℃冰箱中，臨用前用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液將celastrol儲存液稀釋到實驗所需濃度。

1.4 細胞分組及處理方法

將人胰腺癌PANC-1細胞分為PANC-1組、celastrol（5 μmol/L）組、celastrol（10 μmol/L）組和celastrol（20 μmol/L）組，分別用0、5、10和20 μmol/L的celastrol處理PANC-1細胞，進行后續(xù)檢測。

1.5 CCK-8檢測細胞活性

將PANC-1細胞接種于96孔板中，并用0、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100、200和500 μmol/L的celastrol處理PANC-1細胞24 h，每個濃度6個復孔。每孔分別加入10 μL的CCK-8試劑，于37 ℃繼續(xù)溫育4 h后用酶標儀檢測細胞活性。

按照上述方法檢測PANC-1組、celastrol（5 μmol/L）組、celastrol（10 μmol/L）組和celastrol（20 μmol/L）組的細胞活性，計算細胞增殖倍數(shù)。

1.6 Transwell檢測細胞侵襲能力

用Matrigel對Transwell小室進行預包被處理，即將Matrigel置于4 ℃溶化后，加入適量Matrigel覆蓋Transwell小室底部，將Transwell小室放于培養(yǎng)箱中待Matrigel凝固后取出備用。將PANC-1細胞以2×105個/mL的密度接種于小室上層，并加入含有0、5、10和20 μmol/L celastrol的無血清培養(yǎng)液處理細胞24 h，小室下層加入完全培養(yǎng)液。24 h后用無菌棉簽擦去上層未遷移細胞，用結晶紫對遷移細胞染色并計數(shù)統(tǒng)計。

1.7 劃痕實驗檢測細胞遷移能力

用無菌的記號筆于6孔板背面劃5條平行直線后備用。將PANC-1細胞接種于準備好的6孔板中，種板密度為5×105個/mL。第2天用10 μL的槍頭垂直于培養(yǎng)板背面的直線劃痕，并用PBS洗去被劃下的細胞，記錄0 h時各組細胞劃痕寬度，并將細胞按照1.4的方法處理24 h后記錄各組細胞劃痕寬度，計算細胞的劃痕閉合率。

1.8 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測蛋白表達

將細胞按照1.4的方法進行處理后，用RIPA裂解液提取各組細胞蛋白，并用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid disodium，BCA）試劑盒檢測蛋白濃度后調(diào)平。每組分別取40 μg的蛋白用10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）進行分離，采用半干法將分離后的目標蛋白轉移到PVDF膜，用5%的脫脂奶粉室溫封閉蛋白質(zhì)2 h，2 h后加入適宜濃度的一抗（Ki-67：1∶1 000；VEGF：1∶1 000；MMP-9：1∶800）于4 ℃溫育過夜。第2天取出PVDF膜，洗去膜上未結合一抗，加入二抗37 ℃溫育1 h后，滴加化學發(fā)光顯色液進行曝光顯影。

1.9 統(tǒng)計學處理

所有實驗結果均用統(tǒng)計學軟件SPSS 19.0進行分析，組間差異分析采用單因素方差分析，實驗結果以表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 對PANC-1細胞增殖的影響

預實驗結果表明，當celastrol濃度高于50 μmol/L時，胰腺癌PANC-1細胞的細胞活性降至80%以下（圖1）。因此，選擇5、10和20 μmol/L 3個濃度的celastrol進行后續(xù)實驗。與PANC-1組相比，celastrol（5 μmol/L）組、celastrol（10 μmol/L）組和celastrol（20 μmol/L）組的胰腺癌PANC-1細胞的增殖倍數(shù)明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，圖2），并具有量效關系；同時，celastrol（5 μmol/L）組、celastrol（10 μmol/L）組和celastrol（20 μmol/L）組細胞增殖相關蛋白Ki-67的蛋白表達水平與PANC-1組比較明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，圖3）。

圖 1 Celastrol對PANC-1細胞活性的影響Fig. 1 The effect of celastrol on cell viability of PANC-1 cells

圖 2 Celastrol對PANC-1細胞增殖的影響Fig. 2 The effect of celastrol on proliferation of PANC-1 cells

圖 3 Celastrol對PANC-1細胞Ki-67、VEGF和MMP-9蛋白的影響Fig. 3 The effect of celastrol on the expressions of Ki-67, VEGF and MMP-9 in PANC-1 cells

2.2 Celastrol對PANC-1細胞侵襲能力的影響

與PANC-1組相比，celastrol（5 μmol/L）組、celastrol（10 μmol/L）組和celastrol（20 μmol/L）組侵襲的胰腺癌PANC-1細胞明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，圖4），并具有量效關系。

2.3 Celastrol對PANC-1細胞遷移能力的影響

劃痕實驗結果表明，與PANC-1組相比，celastrol（5 μmol/L）組、celastrol（10 μmol/L）組和celastrol（20 μmol/L）組24和48 h PANC-1細胞的劃痕閉合率顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，圖5），并具有量效關系；同時，celastrol（5 μmol/L）組、celastrol（10 μmol/L）組和celastrol（20 μmol/L）組PANC-1細胞侵襲遷移相關蛋白VEGF和MMP-9的蛋白表達水平與PANC-1組相比明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，圖3）。

圖 4 Celastrol對PANC-1細胞侵襲能力的影響Fig. 4 The effect of celastrol on invasion ability of PANC-1 cells

圖 5 Celastrol對PANC-1細胞遷移能力的影響Fig. 5 The effect of celastrol on migration ability of PANC-1 cells

3 討 論

胰腺癌是常見的惡性腫瘤之一，胰腺癌患者通常預后較差、生存時間較短，并且通常易復發(fā)，易出現(xiàn)淋巴及肝臟轉移［10］。目前對于胰腺癌的治療方法及藥物并不明顯影響胰腺癌患者的預后［11］。因此，尋找治療胰腺癌的新方法及藥物是提高胰腺癌患者預后的關鍵。Celastrol是中藥雷公藤中的主要活性成分，研究發(fā)現(xiàn)，celastrol具有較強的抗炎、抗氧化及免疫調(diào)節(jié)作用，能通過抑制血管新生、抑制蛋白酶體活性從而抑制癌癥發(fā)展、誘導癌細胞凋亡［12-13］。Lee等［14］研究表明，celastrol可通過誘導細胞凋亡和自噬抑制胃癌細胞生長。Celastrol還能通過調(diào)控Akt信號通路的激活和整合素的表達抑制肺癌細胞的生長和轉移［15］。此外，celastrol還能誘導胰腺癌細胞凋亡，其作用機制與抑制elF4E結合蛋白4E-BP1的表達有關［16］。為進一步探究celastrol對胰腺癌細胞生長及轉移的作用，為雷公藤應用于胰腺癌的食療提供更多理論依據(jù)，本研究探討celastrol對胰腺癌PANC-1細胞增殖、侵襲及遷移能力的影響。

首先，本研究采用濃度梯度的celastrol處理人胰腺癌PANC-1細胞并發(fā)現(xiàn)，當celastrol濃度≥50 μmol/L時，PANC-1細胞的活性降至80%以下，表明其濃度達到50 μmol/L及以上時，對PANC-1細胞具有明顯的毒性，并且隨著celastrol濃度的增大，對PANC-1細胞活性的抑制作用越強。因此選擇了5、10和20 μmol/L 3個濃度進行后續(xù)實驗。用不同濃度的celastrol處理細胞4 d后，PANC-1細胞的增殖倍數(shù)與正常培養(yǎng)的PANC-1細胞比較明顯降低，并且具有量效關系。進一步表明celastrol能抑制胰腺癌PANC-1細胞增殖，從而抑制胰腺癌的發(fā)展。

癌細胞侵襲和轉移是導致患者癌癥性死亡的最主要原因，抑制癌細胞的侵襲及轉移能減緩癌癥發(fā)展進程，但目前臨床上并無針對癌細胞轉移的藥物被應用于癌癥的治療［17］。已有研究表明，celastrol對癌細胞的侵襲和遷移具有明顯的抑制作用［18-20］。Yu等［18］研究發(fā)現(xiàn)，celastrol能通過下調(diào)PI3K/Akt/NF-κB信號通路活性減弱人骨肉瘤細胞的侵襲和轉移能力。Celastrol還能通過抑制NF-κB通路的激活抑制卵巢癌細胞遷移和侵襲，抑制卵巢癌細胞生長［19］。此外，celastrol還能通過抑制MMP-9的表達抑制乳腺癌細胞侵襲［20］。本研究發(fā)現(xiàn)，celastrol能顯著減少侵襲的胰腺癌PANC-1細胞數(shù)、降低PANC-1細胞的劃痕閉合率，并隨濃度升高作用逐漸增強，表明celastrol能抑制胰腺癌PANC-1細胞侵襲和遷移。此外，celastrol還能抑制PANC-1細胞侵襲及遷移相關蛋白VEGF和MMP-9的表達。細胞外基質(zhì)的降解是癌癥轉移的關鍵，MMP-9在促進細胞外基質(zhì)降解過程中發(fā)揮著重要作用［21］。VEGF是促進血管新生的關鍵因子，也能通過促進細胞外基質(zhì)的降解促進癌細胞的侵襲和遷移［22］。結合實驗結果進一步表明，celastrol能抑制胰腺癌PANC-1細胞侵襲和遷移。

綜上所述，celastrol能降低人胰腺癌PANC-1細胞增殖倍數(shù)，并能抑制Ki-67的表達，同時還能減少PANC-1細胞侵襲，降低PANC-1細胞的劃痕閉合率，并降低VEGF和MMP-9的蛋白表達水平，表明celastrol能抑制人胰腺癌PANC-1細胞增殖，并減弱癌細胞的侵襲和遷移能力。本研究僅探討了celastrol對胰腺癌PANC-1細胞增殖、侵襲和遷移的作用，對作用機制的研究還未涉及，因此后期還需要對其作用機制進行進一步探究。