α芋螺毒素MI分支肽的合成及免疫原性研究

陳榮芳，余碩，周良燚，張學(xué)榮，戴秋云

1.廣西醫(yī)科大學(xué) 蛇毒研究所，廣西醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣西 南寧530021；2.軍事醫(yī)學(xué)研究院 生物工程研究所，北京100071

α芋螺毒素MI 來自幻芋螺（Conus magus），其氨基酸序列為GRCCHPACGKNYSC-NH2[1]，含2 對二硫鍵（連接方式為Cys3-Cys8，Cys4-Cys14[2]）。MI 作用于肌肉型煙堿乙酰膽堿受體，對小鼠的半數(shù)致死劑量約10 μg/kg（腹腔注射）[2-4]，我們實測為15～20 μg/kg，是目前發(fā)現(xiàn)的毒性最強(qiáng)的芋螺毒素。MI 可導(dǎo)致中毒對象肌肉癱瘓及麻木，呼吸困難，心肌損害，心搏停止乃至死亡[1]。

目前MI 中毒無有效治療藥物，也未見MI的抗毒血清報道，僅見結(jié)構(gòu)相似的α芋螺毒素GI 抗血清對MI的解毒效果報道[5]。GI與孔藍(lán)蛋白或卵清蛋白偶聯(lián)后免疫山羊，制備的抗血清對GI 及MI的保護(hù)活性不高[5]。本實驗室開展了GI-BSA（牛血清蛋白）偶聯(lián)物免疫后制備的小鼠抗血清工作，發(fā)現(xiàn)GI 抗血清對GI 中毒小鼠有一定的保護(hù)作用，但活性仍不高[6]。其原因可能是α芋螺毒素GI 通過戊二醛偶聯(lián)蛋白載體時反應(yīng)位點(diǎn)多，影響了GI的抗原表位，導(dǎo)致抗血清活性不高。

多抗原肽系統(tǒng)（multiple antigen peptide sys?tem，MAPs）由小的核心基質(zhì)與圍繞核心基質(zhì)的高密度抗原肽形成，與常規(guī)的肽-載體蛋白相比抗原密度更高，免疫原性增強(qiáng)，已用于多肽抗體及疫苗的研發(fā)[7-8]。為制備MI 抗血清，我們采用點(diǎn)擊反應(yīng)制備了MI 多分支肽，保持MI 抗原表位的完整性，然后免疫小鼠，測定其抗體滴度與抗毒活性。結(jié)果表明，成功制備了MI 八分支抗原，但其免疫抗原性較低，抗血清的抗毒活性不佳。

1 材料與方法

1.1 材料

KM 小鼠（雌雄各半，18～20 g）及BALB/c 小鼠（雌性，5周齡，17～19 g）購自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司）。有機(jī)合成用試劑9-芴甲氧琥珀酰亞胺基碳酸酯（Fmoc-OSu）、三異丙基硅烷（TIS）、三[（1-芐基-1H-1，2，3-三唑-4-基）甲基]胺（TBTA）、抗壞血酸鈉、Boc-Lys-OH、3-丁炔-1-醇、三光氣等購自北京伊諾凱科技有限公司。多肽固相合成用試劑Rink 樹脂（取代率0.6 mmol/g）購自天津南開合成有限公司，F(xiàn)moc 保護(hù)氨基酸、苯并三氮唑-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸鹽（HBTU）、1-羥基苯并三唑（HoBt）等購自上海吉爾生化有限公司，二甲基甲酰胺（DMF）、哌啶、二氯甲烷（DCM）、無水甲醇（MeOH）、無水乙醚等購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，二異丙基二乙胺（DIEA）、三氟乙酸（TFA）等購自北京伊諾凱有限公司。ELISA檢測試劑辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗體、TMB 底物顯色試劑盒等購自康為世紀(jì)生物科技有限公司。其他常規(guī)化學(xué)試劑等購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（日本EYELA 公司）；循環(huán)水式真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；多肽固相合成儀（德國Zinsser analytic 公司）；凍干機(jī)（德國Christ 公司）；Waters 625 高效液相色譜儀（Waters公司）；安捷倫1200 型高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；核磁共振儀（日本JEOL 公司）；mi?croTOF QII 質(zhì)譜儀（德國布魯克公司）；酶標(biāo)儀（賽默飛世爾科技有限公司）。

1.2 Fmoc-Lys（butynyl）-OH 合成

按文獻(xiàn)[9]先合成Boc-Lys（butynyl）-OH，再用4 mol/L HCl 脫去保護(hù)基，所得白色固體（2.38 g，9.83 mmol）和碳酸鈉（1.04 g，9.83 mmol）溶于30 mL 四氫呋喃（THF）水溶液中（THF∶水=2∶1），冰浴冷卻后，緩慢滴加Fmoc-OSu（3.31 g，9.83 mmol）THF 溶液（10 mL）。室溫攪拌過夜，反應(yīng)完成后旋去THF，乙酸乙酯萃取4～5 次，無水硫酸鈉干燥，旋蒸后經(jīng)硅膠柱純化，獲得3.52 g Fmoc-Lys（butynyl）-OH。

1.3 MI 多分支抗原的合成

C端連接的MI 多分支抗原合成路線見圖1，N端連接的MI 多分支抗原路線與此相同。

1.3.1 含炔基MI 線性肽及含疊氮的賴氨酸多分支肽的合成 采用Fmoc-固相多肽合成法[10]，應(yīng)用自動合成儀合成含炔基MI 線性肽MI-1、MI-2及含疊氮的賴氨酸多分支肽（D），序列如下：

然后將肽樹脂裂解（裂解液：TFA/DTT/H2O/TIPS=44/2.5/2.5/1，v/w/v/v），旋蒸除去大部分TFA后加入預(yù)冷的無水乙醚4℃沉淀，G4 漏斗過濾得到粗肽。

1.3.2 含炔基MI 線性肽的氧化折疊及純化 采用空氣氧化法折疊線性肽[11]。多肽折疊采用0.1 mol/L的NH4HCO3溶液（肽濃度為0.3 mg/mL），氨水調(diào)pH值至8.0，室溫攪拌24 h，用HPLC 監(jiān)測折疊產(chǎn)物。折疊完成后，用冰醋酸調(diào)pH 至5 終止折疊，反向高效液相色譜（RP-HPLC）法除鹽、富集。

采用高效液相色譜純化粗肽，純化柱為C18半制備柱（Kromasil，300 ?，10 mm×250 mm）。色譜條件：0～2 min 5%～10% B，2～30 min 10%～60%B（依多肽不同流動相B 比例相應(yīng)變化），30～31 min 60%～95% B，流動相A 為含0.1% TFA的去離子水，流動相B 為含0.1% TFA的乙腈，檢測波長230 nm，流速3 mL/min。粗肽純化后凍干，做HPLC 分析及質(zhì)譜鑒定。

1.3.3 賴氨酸多分支肽的純化 同1.3.2。

1.3.4 含炔基MI與D的CuAAc 反應(yīng)（click 反應(yīng)）采用銅[Cu（I）]催化疊氮-炔雜環(huán)化反應(yīng)（Cu?AAc）[12-14]，將含炔基MI 連接至賴氨酸多分支肽，合成N、C端連接的MI 多分支抗原。

溶解含炔基肽（16 eq）至190 μL DMF 中，分別 加 入D（1 eq）、CuSO4（1.6 eq）、TBTA（1.6 eq）。通氮?dú)?5 min后，加入抗壞血酸鈉（4 eq），氮?dú)獗Ｗo(hù)下室溫攪拌40 h，0、20、40 h 取樣做HPLC 分析。產(chǎn)物經(jīng)RP-HPLC 法純化，分離柱為C8半制備柱（Kromasil，300，10 mm×250 mm）。

1.4 含炔基MI 腹腔注射毒性

KM 小鼠雌雄各半，隨機(jī)分為MI-1 20 μg/kg組、MI-2 20、40 μg/kg 組，每組10只。腹腔注射200 μL后，記錄小鼠死亡時間，小鼠死亡時間以x±s表示。

1.5 小鼠免疫

BALB/c 小鼠隨機(jī)分為生理鹽水組、N端連接的MI 八分支肽10、20 μg/只組、C端連接的MI 八分支肽10、20 μg/只組，每組10只。免疫前取陰性血清作為對照，共4 次免疫?；A(chǔ)免疫時，八分支肽與完全弗氏佐劑等體積混合，皮下注射加腹腔注射（注射體積200 μL）?；A(chǔ)免疫后每隔2周進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫，共進(jìn)行3 次加強(qiáng)免疫，加強(qiáng)免疫時八分支肽與不完全弗氏佐劑等體積混合，免疫劑量和方式同基礎(chǔ)免疫。

1.6 MI 八分支肽抗血清滴度測定

圖1 C端連接的MI 多分支肽抗原的合成路線圖

設(shè)生理鹽水組、空白組及待測血清組，為保證實驗準(zhǔn)確性及重復(fù)性設(shè)2個復(fù)孔。各組血清采用相應(yīng)的八分支肽作為包被抗原，包被量均為100 ng/孔，4℃包被過夜，PBST 洗4 次，5%脫脂奶粉封閉2 h，PBST 洗4 次，加入不同稀釋度待測血清（一抗），孵育1 h，PBST 洗4 次，加辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG（二抗），孵育30 min，PBST 洗4 次，TMB 底物顯色15 min，再加0.5 mol/L 硫酸終止顯色反應(yīng)，酶標(biāo)儀測D450nm及D600nm值。數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 2010 處理。D值為D450nm值減去D600nm值。最終以生理鹽水組的2.1倍為陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.7 中和活性實驗

KM 小鼠（雌雄各半）隨機(jī)分為6 組，即陰性對照組MI、生理鹽水組、N端連接的MI 八分支肽組（10、20 μg/只）、C端連接的MI 八分支肽組（10、20 μg/只），每組10只，各組血清與MI（20 μg/kg）混合，37℃孵育40 min后腹腔注射，記錄小鼠死亡時間。采用Log-rank 檢驗統(tǒng)計方法比較抗血清組與對照組的死亡時間差別。

2 結(jié)果

2.1 含炔基MI的合成

含炔基MI的線性肽、折疊產(chǎn)物及純肽的HPLC 分析見圖2。結(jié)果表明，MI-1、MI-2 線性肽折疊為一個主峰，純化后多肽純度均大于95%。質(zhì)譜測定結(jié)果顯示，MI-1、MI-2的M+1 峰值為1587.55 及1831.65，與其理論單同位素分子量1586.64、1830.76 一致。

2.2 MI 多分支肽的合成結(jié)果

圖2 含炔基MI 線性肽、折疊產(chǎn)物及純肽的HPLC 分析圖

圖3 N端（A）及C端（B）連接的MI 多分支肽點(diǎn)擊反應(yīng)產(chǎn)物及純肽的HPLC 分析

含炔基MI與賴氨酸多分支肽的點(diǎn)擊反應(yīng)產(chǎn)物為一個主產(chǎn)物（圖3）及反應(yīng)原料，產(chǎn)物純化后，質(zhì)譜分析結(jié)果如圖4 所示，均為八分支肽。

圖4 MI 多分支肽的質(zhì)譜分析圖

2.3 含炔基MI 小鼠腹腔注射毒性

結(jié)果表明，N端連接炔基的MI（MI-1）的毒性有所降低，20 μg/kg MI-1 組的小鼠死亡率為50%，同樣劑量的MI的死亡率為100%。C端連接炔基的MI（MI-2）20、40 μg/kg 劑量組的小鼠死亡率分別為0 及20%，明顯低于MI。

表1 小鼠血清抗體滴度測定結(jié)果

2.4 MI 八分支抗原的抗體滴度

MI 八分支抗原4 次免疫后2周采集的血清抗體滴度結(jié)果見圖5 及表1。10、20 μg/只劑量的N端連接MI 八分支肽組第4 次免疫后血清抗體滴度分別為1∶400 及1∶6400，10、20 μg/只劑量的C端連接MI 八分支肽組第4 次免疫后血清抗體滴度分別為1∶3200 及1∶25 600。

2.5 抗血清的中和活性

各組血清與MI（20 μg/kg）的中和實驗結(jié)果見圖6 及表2。實驗組與對照組小鼠死亡率均為100%，GraphPad Prism 做生存曲線圖，Log-rank 檢驗對各組進(jìn)行多重比較，統(tǒng)計結(jié)果分析顯示小鼠死亡時間與對照組比較無顯著差異（P=0.5855）。

3 討論

賴氨酸分支肽連接多個精氨酸主要考慮增加目標(biāo)分支肽的溶解度及穿膜性。考慮空間位阻對MI 多分支肽合成效率的影響，在MI的N端連接一個5-己炔酸、C端增加2個GG，結(jié)果表明MI-1 或MI-2的折疊效率仍很高，與賴氨酸多分支肽點(diǎn)擊反應(yīng)時效率較高。

圖5 小鼠血清抗體滴度測定結(jié)果

為使反應(yīng)完全，我們采用含炔基MI與賴氨酸多分支肽的反應(yīng)比例為16∶1，即含炔基MI與疊氮的摩爾比例為2∶1。為使抗壞血酸鈉能有效還原二價銅離子為一價銅離子并盡可能減少對毒素二硫鍵的還原，須控制抗壞血酸鈉的用量，一般采用抗壞血酸鈉與含炔基MI的摩爾比例為1∶4。實驗采用氮?dú)獗Ｗo(hù)，以防一價銅離子被氧化而喪失催化活性[15-16]。

圖6 200 μL 血清與MI（20 μg/kg）中和結(jié)果

表2 200 μL血清與MI（20 μg/kg）中和實驗結(jié)果（n=10）

免疫原性與其各自單體的毒性并無對應(yīng)關(guān)系，由C端含炔基連接的MI 毒性低于N端含炔基連接的MI，但N端連接的MI 八分支肽組免疫后的抗血清滴度明顯低于C端連接的MI 八分支肽組，且2個八分支肽的毒性較低，20 μg/只對小鼠無明顯毒性。

MI 八分支抗原的免疫原性較低，抗血清的抗毒活性不高，原因可能是MI 本身免疫抗原性低，這與其序列短、親水氨基酸多有關(guān)。