王 歡,馬祉茜,林淑云,湯英賢,李玉珍,溫偉洪,李介華,徐令清

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第六醫(yī)院(清遠(yuǎn)市人民醫(yī)院) 檢驗(yàn)科，廣東 清遠(yuǎn)511518)

肺炎克雷伯菌(KP)是常見的導(dǎo)致臨床感染的條件致病菌之一。其檢出率僅次于大腸桿菌和銅綠假單胞菌[1]。近年來，伴隨廣譜抗生素的濫用現(xiàn)象，KP耐藥率明顯增高[1]，而產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶(ESBLs)的菌株也與日俱增。有現(xiàn)象表明，其產(chǎn)生的獨(dú)立預(yù)測因素為不恰當(dāng)?shù)目咕委?，包括不必要的延長抗生素用藥時(shí)間、過多的給藥劑量等等。外用抗生素尤其易導(dǎo)致細(xì)菌耐藥，第三代頭孢菌素經(jīng)驗(yàn)性用藥可引起產(chǎn)ESBLs 的菌株流行[2]。整合子作為一種可移動(dòng)的基因元件，不僅可利用位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)在細(xì)菌之間傳播，并且具有捕獲耐藥基因盒的功能[3]。本文通過基因擴(kuò)增和測序的方法研究整合子在產(chǎn)ESBLs和非產(chǎn)ESBLs的肺炎克雷伯菌中的分布和整合子攜帶耐藥基因盒的種類。

1 材料與方法

1.1菌株來源本研究中包含80株肺炎克雷伯菌，來源于2016年11月至2017年8月廣東省清遠(yuǎn)市人民醫(yī)院不同科室患者的臨床標(biāo)本，以住院病人為主。由BD phoenix100儀器鑒定，其中產(chǎn)ESBLs菌株30株，非產(chǎn)ESBLs菌株50株。排除同一患者在一次住院期間同類型標(biāo)本分離的同種菌株。這些菌株分離自痰液(n=37)、血液(n=13)、中段尿(n=11)和其他分泌物(n=19)：包括膿液、分泌物、引流液、膽汁等。

1.2儀器與試劑儀器：BD phoenix100 全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀及其配套鑒定藥敏卡；BIO-RAD公司T100TMPCR擴(kuò)增儀、Power PacTMBasic 電泳儀以及Gel DoxTMXR+紫外凝膠成像系統(tǒng)。試劑：DNA提取試劑盒，Taq PCR MasterMix ，GelGreen核酸染料以及Marker Ⅱ、Ⅲ DNA Ladder 成品均購自天根生化科技有限公司(TIANGEN)；引物由英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.3方法

1.3.1細(xì)菌總DNA 的提取 分裝無菌的伊利純牛奶于已滅菌的EP管中，-20℃保存。使用前恢復(fù)室溫，挑取單個(gè)菌落混勻，-80℃冷凍保存。提取前，挑取一環(huán)牛奶，于血平板分區(qū)劃線，過夜培養(yǎng)。挑取適量菌量加入無菌生理鹽水中懸浮；按照提取試劑盒說明書(TIANGEN公司細(xì)菌組DNA提取試劑盒)的步驟提取，最后用1.5 ml 規(guī)格的無菌EP管收集洗脫后的DNA產(chǎn)物，-40℃冷凍保存；

1.3.2整合酶基因PCR 檢測 根據(jù)參考文獻(xiàn)[4]設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，引物序列見表1；PCR體系為25 μl，其中2×Taq PCR masterMix 12.5 μl，引物各0.5 μl，模板0.5 μl，補(bǔ)充ddH2O至25 μl；擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；之后每個(gè)循環(huán)為94 ℃變性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，26個(gè)循環(huán)后，72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳法，取5 μl產(chǎn)物點(diǎn)樣，參照條帶使用100-1 200 bp的MarkerⅡDNA Ladder，電壓為150V，在2%的瓊脂糖凝膠中電泳30 min，結(jié)果使用BIO-RAD公司的凝膠成像系統(tǒng)分析。

1.3.3可變區(qū)PCR檢測 根據(jù)參考文獻(xiàn)[4]設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，引物序列見表1；PCR體系為50 μl；其中2×Taq PCR masterMix 25 μl，引物各0.5 μl，模板1 μl，補(bǔ)充ddH2O至50 μl；擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；之后每個(gè)循環(huán)為94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)后，72℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳法，取5 μl產(chǎn)物點(diǎn)樣，條帶參照使用200-4 500 bp的MarkerⅢDNA Ladder，電壓為150 V，在1.2%的瓊脂糖凝膠中電泳30 min，結(jié)果使用BIO-RAD公司的凝膠成像系統(tǒng)分析。

1.3.4可變區(qū)測序分析 將電泳結(jié)果顯示有明顯條帶的可變區(qū)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物交由上海生物工程有限公司進(jìn)行純化和測序分析，測序結(jié)果使用BLAST(www.Pubmed.com)進(jìn)行序列比對分析，選擇匹配度最高的結(jié)果。

1.3.5引物設(shè)計(jì) 參照參考文獻(xiàn)[5]，Ⅰ類、Ⅱ類、Ⅲ類整合子的整合酶基因以及可變區(qū)所用的引物序列見表1。所用的引物由英駿生物技術(shù)有限公司合成。

表1 三類整合酶基因以及可變區(qū)的引物序列

1.3.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 藥敏結(jié)果使用Microsoft Excel 2007進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，耐藥率的比較采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1科室分布情況30株產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌菌株中，送檢自ICU的有9株；其次是心血管科和兒科各3株，其余科室散發(fā)存在；50株非產(chǎn)ESBLs菌株中，ICU 18株，其次是泌尿外科5株，其他科室散發(fā)存在；是以可見，ICU是最易發(fā)生細(xì)菌感染的科室。

2.2整合酶基因分布80株肺炎克雷伯菌共檢出I類整合子陽性菌株30株，檢出率為37.5%；其中產(chǎn)ESBLs菌株中占73.3%(22/30)，非產(chǎn)ESBLs菌株中占16%(8/50)；未檢出Ⅱ類和Ⅲ類整合子。部分整合子Ⅰ陽性PCR 電泳結(jié)果如圖1所示。

2.3Ⅰ類整合子與各種抗菌藥物耐藥率的關(guān)系Ⅰ類整合子陽性的菌株對各類抗菌藥物的耐藥率除氨芐青霉素、亞胺培南、美羅培南和阿米卡星之外均高過Ⅰ類整合子陰性的菌株。結(jié)果如表2所示。

2.4整合子可變區(qū)擴(kuò)增結(jié)果經(jīng)過PCR擴(kuò)增以及瓊脂糖凝膠電泳后，出現(xiàn)明顯條帶的標(biāo)本有8株，其片段長度為1 200-3 000 bp之間，大小不等，結(jié)果如圖2所示。

2.5基因盒測序結(jié)果

結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳條帶分析，把7株Ⅰ類整合子陽性的菌株及1株Ⅰ類整合子陰性的菌株，共8株送去測序。測序結(jié)果顯示，7株Ⅰ類整合子陽性的菌株全部檢測出基因盒，Ⅰ類整合子陰性菌株，也就是2號標(biāo)本測序不成功。其攜帶的基因盒類型如表3所示，共檢出10種耐藥基因。

注：Marker:100-1 200 bp;泳道1-10：Ⅰ類整合酶基因陽性標(biāo)本，對應(yīng)的原始編號為2，3，4，5，6，8，9，10，11，13；泳道11：空白對照。

圖1 部分Ⅰ類整合酶基因PCR 擴(kuò)增結(jié)果表2 80株肺炎克雷伯菌Ⅰ類整合子陽性菌株和陰性菌株耐藥表型比較

3 討論

肺炎克雷伯菌是獲得性感染的主要流行菌，隨著超廣譜抗菌藥物的廣泛應(yīng)用，近年來產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的肺炎克雷伯菌也與日俱增[6]。而Ⅰ類整合子是肺炎克雷伯菌最常見的整合子類型，包含大部分耐藥基因[7]。因此本次實(shí)驗(yàn)對本院2016年11月到2017年8月臨床分離的80株肺炎克雷伯菌進(jìn)行整合子Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、可變區(qū)以及測序分析，從而對該院的院內(nèi)感染趨勢提供相應(yīng)的依據(jù)。本次實(shí)驗(yàn)對80株肺炎克雷伯菌進(jìn)行整合子Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的檢測，整合子Ⅰ陽性共30株，檢出率為37.5%； 其中產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌的整合子Ⅰ陽性檢出率為73.3%，非產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌的整合子I陽性檢出率為16%； 并未檢出整合子Ⅱ、Ⅲ；由此可見，整合子Ⅰ在產(chǎn)ESBLs和非產(chǎn)ESBLs的肺炎克雷伯菌中的分布相差懸殊。另外，本次研究還發(fā)現(xiàn)來自ICU 的9株產(chǎn)ESBLs菌株中，有5株檢測出整合子Ⅰ陽性，檢出率為55.5%，略低于相關(guān)研究[7]，可能與標(biāo)本數(shù)量太少有關(guān)；另來自ICU的18株非產(chǎn)ESBLs的菌株中，僅2株檢測出Ⅰ類整合子，檢出率為11.1%，存在明顯的差異。

注：Marker:200-4 500 bp;泳道1-8：可變區(qū)陽性標(biāo)本；對應(yīng)的原始編號為：2，12，13，20，24，27，77，80，泳道9：空白對照。

圖2 8株陽性標(biāo)本可變區(qū)PCR結(jié)果

注，對20種抗生素進(jìn)行分類，可以分為9類，其中a類為碳青酶稀類，IPM,MEM;b類為氨基糖苷類，CN,AMI;c類為醛固酮類：CIP,LEV,MXF;d類為頭孢菌素類：CZ,CAZ,CTX,FEP;e類為廣譜青霉素類：SAM,TZP,AMC,PIP;f類為β-內(nèi)酰胺類：ATM,AMP;g為磺胺類：SXT;h為四環(huán)素類：TE;i為酰胺醇類：C.

通過統(tǒng)計(jì)分析，氨芐青霉素的耐藥率為100%，阿莫西林/克拉維酸、哌拉西林/他唑巴坦耐藥率較低，亞胺培南、美羅培南以及阿米卡星的耐藥率都在10%以下，整合子I陽性菌株的耐藥率更是低至0.00%，提示臨床可以根據(jù)病人感染情況按照限制級別選擇用藥；對環(huán)丙沙星、四環(huán)素、哌拉西林、頭孢唑啉、頭孢噻肟、氨曲南、氯霉素和復(fù)方新諾明等藥物，整合子I陽性菌株的耐藥率明顯高于陰性菌株，這代表著其耐藥機(jī)制與整合子I的存在有緊密的聯(lián)系。

整合子是一種具有基因捕獲和表達(dá)能力，攜帶一個(gè)或多個(gè)基因盒的遺傳單位[8]；基本結(jié)構(gòu)有5′保守區(qū)(5′conserved segment，5′CS)、3′保守區(qū)(3′conserved segement,3′CS)、可變區(qū)(Variable region,VR)三部分組成。可變區(qū)可同時(shí)插入一個(gè)或多個(gè)記憶和(GC)，基因盒是由重組位點(diǎn)attC和基因編碼區(qū)組成，這些基因盒作為獨(dú)立的功能單位可單獨(dú)移動(dòng)[9]。80株肺炎克雷伯菌菌株中擴(kuò)增出可變區(qū)的有8株，共檢出 10種耐藥基因盒。其中aadA1、aadA2、aadA5為編碼氨基糖苷類藥物的耐藥基因[10];dfrA1、dfrA12、dfrA17為編碼磺胺類藥物的耐藥基因[11]，本次檢測耐藥基因與耐藥表型有一定的關(guān)聯(lián)卻不完全相符，可能存在其他耐藥機(jī)制，需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，Ⅰ類整合子的攜帶與細(xì)菌的耐藥性有著密切的聯(lián)系，其可變區(qū)所攜帶的基因盒具有多樣性，與耐藥機(jī)制有一定的對應(yīng)關(guān)系。應(yīng)加強(qiáng)研究，以更深入的了解細(xì)菌耐藥的發(fā)生和傳播機(jī)制。

作者簡介：王歡(1980-)，主管檢驗(yàn)師 ，醫(yī)學(xué)法學(xué)雙學(xué)士，主要從事醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)質(zhì)量控制研究。