李 濤，宛迎春，蘇子源，周長(zhǎng)玉*

(1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 消化內(nèi)科，吉林 長(zhǎng)春130033；2.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院)

結(jié)直腸癌是男性中最常見(jiàn)的3種癌癥之一，也是女性最常見(jiàn)的兩種癌癥之一。全球平均每年有100萬(wàn)人被診斷出患有結(jié)直腸癌[1]。死亡率隨疾病分期有顯著差異;有5年以上的存活率90%的I期患者，10%-20%的轉(zhuǎn)移患者[2]。結(jié)直腸癌存在的類型多樣，約40%的病例攜帶KRAS突變，10%為BRAF突變[3]。與野生型KRAS患者相比，突變的KRAS預(yù)示著不良的預(yù)后和生存，同時(shí)耐受抗表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)治療[4-6]。

結(jié)腸癌是常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一，在全球惡性腫瘤發(fā)病率中居第三位，在癌癥相關(guān)死亡中排名第四，嚴(yán)重危害全球范圍內(nèi)居民健康，給社會(huì)和家庭經(jīng)濟(jì)造成沉重負(fù)擔(dān)[1]。結(jié)腸癌的主要危害來(lái)源于術(shù)后的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，特別是晚期結(jié)腸癌患者，如何預(yù)防和降低轉(zhuǎn)移成為治療結(jié)腸癌的關(guān)鍵[2]。

microRNAs (miRNAs)是一類內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)RNA分子，長(zhǎng)度約22個(gè)核苷酸，參與動(dòng)植物轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控[3,4]。近來(lái)的研究顯示，miRNA與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，通過(guò)對(duì)目標(biāo)基因的調(diào)節(jié)，參與腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，增殖和轉(zhuǎn)移的調(diào)節(jié)[5,6]。本課題擬通過(guò)實(shí)驗(yàn)明確miR-155對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和線粒體凋亡信號(hào)通路的影響，為臨床治療結(jié)腸癌提供新的策略和作用靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑

結(jié)腸癌組織和癌旁組織收集于吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，人結(jié)腸癌HCT116，SW480細(xì)胞和人結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460購(gòu)買(mǎi)于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù).細(xì)胞培養(yǎng)用胎牛血清FBS和DMEM高糖培養(yǎng)液購(gòu)買(mǎi)于美國(guó)GIBCO公司，1640培養(yǎng)液和細(xì)胞消化用胰酶購(gòu)買(mǎi)于美國(guó)Hyclone 公司。miR-155 inhibitor和對(duì)照購(gòu)買(mǎi)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，Bax和cytochrome C抗體購(gòu)買(mǎi)自美國(guó)CST公司。

1.2 RT-qPCR

利用Trizol試劑方法提取細(xì)胞中總RNA，提取總RNA后利用TaqMan進(jìn)行實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶反應(yīng)(RT-PCR)，miR-155所用引物和內(nèi)源性對(duì)照U6購(gòu)買(mǎi)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，利用ABI 7300檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

利用lipofectamine3000進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，細(xì)胞培養(yǎng)至80%進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，將細(xì)胞培養(yǎng)液換成Opti-MEM培養(yǎng)液，利用Opti-MEM稀釋lip3000和DNA，同時(shí)在DNA溶解液中加入P3000，室溫孵育10 min，滴入已經(jīng)換成Opti-MEM的平皿中，轉(zhuǎn)染5 h后，換成正常細(xì)胞培養(yǎng)液，24 h后進(jìn)行相應(yīng)實(shí)驗(yàn)。

1.4 CCK8檢測(cè)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖率

細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，進(jìn)行細(xì)胞傳代，計(jì)數(shù)，鋪96孔板，按照每孔2000個(gè)細(xì)胞進(jìn)行鋪板，鋪板后過(guò)夜等待細(xì)胞完全貼壁后進(jìn)行不同分組作用。按照不同的分組作用細(xì)胞，觀察細(xì)胞狀態(tài)完成相應(yīng)的作用，待作用時(shí)間完成后，每孔加入10 μl CCK8溶液，輕輕混勻，放入浮箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)3 h后停止作用，利用酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度值(OD值，450 nm)。

1.5 Western Blotting檢測(cè)結(jié)腸癌細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)

蛋白是細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮生物學(xué)功能的大分子物質(zhì)，檢測(cè)蛋白水平的改變可以反應(yīng)細(xì)胞內(nèi)一些現(xiàn)象的發(fā)生，細(xì)胞蛋白提取和表達(dá)檢測(cè)步驟如下，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞按照分組進(jìn)行分皿，待細(xì)胞完全貼壁后進(jìn)行相應(yīng)的處理，處理完成后進(jìn)行蛋白的提取，棄除細(xì)胞正常培養(yǎng)液，冷卻的PBS洗細(xì)胞2次后，完全吸出PBS，加入150 μl RIPA細(xì)胞裂解液，均勻鋪開(kāi)后，放置冰上作用5 min后，利用細(xì)胞刮將細(xì)胞完全刮除后轉(zhuǎn)至EP管中，放入4℃冰箱搖勻作用30 min，3 000 rpm/min離心20 min，取上清后對(duì)蛋白濃度進(jìn)行定量(BCA方法)。根據(jù)蛋白濃度絕對(duì)上樣體積，蛋白中加入loading buffer，95℃煮蛋白使其變性后，進(jìn)行蛋白質(zhì)丙烯酰胺凝膠電泳分離不同分子量的蛋白，將膠上的蛋白通過(guò)轉(zhuǎn)模轉(zhuǎn)移至PVDF膜上， 5%脫脂奶粉中封閉2 h，根據(jù)檢測(cè)蛋白的不同加入相應(yīng)的一抗，低溫孵育過(guò)夜，第二天PBST清膜3次后加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育2 h后， PBST清膜3次， ECL發(fā)光顯示，對(duì)結(jié)果進(jìn)行拍照分析。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同分組結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡率

利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同分組下結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡率，利用Annexin V-FITC/PI雙染色檢測(cè)凋亡率的改變。具體步驟如下，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞按照分組進(jìn)行分皿，待細(xì)胞完全貼壁后進(jìn)行相應(yīng)的處理，藥物作用完成后，消化收集細(xì)胞，利用冷PBS清洗細(xì)胞2次后加入染料Annexin V-FITC和PI溶液，避光作用0.5 h，利用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行熒光強(qiáng)度的檢測(cè)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

對(duì)CCK8，流式細(xì)胞術(shù)和western blotting數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。利用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，兩組比較采用t檢驗(yàn)的方法，3組及3組以上采用方差分析的方法，P<0.05定義為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)腸癌組織與癌旁組織中miR-155表達(dá)水平

為明確miR-155在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)，我們首先利用了RT-qPCR的方法檢測(cè)了30對(duì)組織中miR-155表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與癌旁組織相比較，結(jié)腸癌組織中miR-155表達(dá)水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表1。

表1 RT-qPCR檢測(cè)結(jié)腸癌和癌旁組織miR-155表達(dá)水平

*與癌旁組織相比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P<0.05

2.2 miR-155 抑制劑對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖率的影響

在檢測(cè)到miR-155表達(dá)水平上調(diào)的基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步探討抑制miR-155對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖率的影響，我們檢測(cè)了HCT116和SW480兩種結(jié)腸癌細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-155抑制劑可以明顯的降低兩種結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖速度，見(jiàn)圖1和圖2。

圖1 miR-155 抑制劑對(duì)HCT116細(xì)胞增殖率的影響

圖2 miR-155 抑制劑對(duì)SW480細(xì)胞增殖率的影響

2.3 miR-155 inhibitor對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的影響

我們進(jìn)一步檢測(cè)了miR-155抑制劑其兩種結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡率的影響，我們利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了給予miR-155 inhibitor對(duì)凋亡率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比較，miR-155 inhibitor可以明顯的增加兩種結(jié)腸癌凋亡率，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 miR-155 inhibitor對(duì)HCT116和SW480細(xì)胞凋亡率的影響

*與Control組比較，P<0.05

2.4 miR-155 inhibitor對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞線粒體凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

研究顯示，線粒體凋亡信號(hào)通路在凋亡的發(fā)生中發(fā)揮了重要的作用，因此我們進(jìn)一步檢測(cè)了線粒體凋亡相關(guān)蛋白Bax和Cytochrome C表達(dá)水平。Western Blotting結(jié)果發(fā)現(xiàn)，給予miR-155 inhibitor可以明顯的增加細(xì)胞中線粒體凋亡相關(guān)蛋白Bax和Cytochrome C表達(dá)水平，結(jié)果見(jiàn)圖3和圖4。

圖3 miR-155 inhibitor對(duì)HCT116和SW480細(xì)胞Bax表達(dá)水平的影響

圖4 miR-155 inhibitor對(duì)HCT116和SW480細(xì)胞Cytochrome C表達(dá)水平的影響

3 討論

結(jié)腸癌是男性和女性中第三常見(jiàn)和第二致命的惡性腫瘤,結(jié)腸癌具有很強(qiáng)的環(huán)境關(guān)聯(lián)性和遺傳風(fēng)險(xiǎn)因素[7]。大約5%的結(jié)腸癌是由家族性腺瘤性息肉病和林奇綜合征兩種遺傳綜合征。正常結(jié)腸的演變成癌前病變和浸潤(rùn)性癌需要大約10到15年通過(guò)遺傳的積累突變體(獲得的)和/或生殖系(遺傳的)。染色體不穩(wěn)定性、失配修復(fù)和CpG高甲基化是結(jié)腸癌發(fā)生的主要途徑。病理診斷是最重要的結(jié)腸癌預(yù)后指標(biāo)[8]。大量的證據(jù)表明了miRNAs與腫瘤的密切關(guān)系，成為腫瘤診斷和靶向治療的熱點(diǎn)分子[9]。近來(lái)的報(bào)道顯示出miRNAs家族成員miR-155在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要的作用[10]。但是，在結(jié)腸癌的發(fā)生，細(xì)胞增殖以及凋亡中miR-155是否發(fā)揮了重要作用還不是很清楚，基于此本課題組開(kāi)展了本次實(shí)驗(yàn)。

首先檢測(cè)了臨床組織樣本中miR-155表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織相比較，結(jié)腸癌組織中表達(dá)水平明顯的升高。為明確miR-155對(duì)細(xì)胞增殖率和凋亡的影響，我們利用miR-155 inhibitor檢測(cè)其對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖率和凋亡率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抑制miR-155可以明顯的降低結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖率，增加細(xì)胞凋亡的發(fā)生，提示miR-155參與了結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)控。

凋亡是細(xì)胞內(nèi)普遍存在的生物學(xué)過(guò)程，同時(shí)是癌癥治療過(guò)程中抗癌試劑盒藥物誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的主要方式[11]。多種信號(hào)通路都可以介導(dǎo)細(xì)胞凋亡信號(hào)通路，其中線粒體凋亡信號(hào)通路是最常見(jiàn)的，也是在腫瘤細(xì)胞凋亡中發(fā)揮主要作用的信號(hào)通路[12]。Bcl-2家族蛋白在線粒體凋亡信號(hào)通路中發(fā)揮重要作用，特別是Bax，其在線粒體外膜形成孔道，促進(jìn)線粒體內(nèi)膜和外膜間的cytochrome C釋放到細(xì)胞質(zhì)中，促進(jìn)了凋亡的發(fā)生[13]。

為進(jìn)一步明確線粒體凋亡信號(hào)通路在miR-155抑制劑介導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡中的作用，我們檢測(cè)了線粒體凋亡相關(guān)蛋白Bax和cytochrome C，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩種表達(dá)水平明顯的升高，提示線粒體凋亡信號(hào)通路參與了miR-155 抑制劑誘導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡。

綜上所述，miR-155在結(jié)腸癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，抑制miR-155可以引起結(jié)腸癌細(xì)胞增殖率的下降和凋亡的升高，線粒體凋亡信號(hào)通路參與了凋亡的發(fā)生過(guò)程。本課題為臨床治療結(jié)腸癌提供了新的思路和治療靶點(diǎn)。

作者簡(jiǎn)介：周長(zhǎng)玉,吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院消化科主任醫(yī)師.