趙磊，李希，袁建業(yè)，林江,*

(1. 上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海 201203； 2. 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院消化科，上海 200032； 3. 上海中醫(yī)藥大學(xué)脾胃病研究所，上海 200032)

腸易激綜合征(irritable bowel syndrome，IBS)是一種常見的功能性腸病，主要表現(xiàn)為腹痛伴有排便習(xí)慣和大便性狀的改變，并缺少足以解釋其癥狀的腸道結(jié)構(gòu)改變和生化異常[1]。IBS的發(fā)病機(jī)制尚未完全明了。目前認(rèn)為，包括在生活早期遭受創(chuàng)傷[2]和恐懼、焦慮、緊張等負(fù)面心理因素[3]在內(nèi)的各種應(yīng)激作用于腦腸軸[4]，可引起神經(jīng)、內(nèi)分泌、腸道動(dòng)力和內(nèi)臟敏感性的異常[5]。其中內(nèi)臟高敏感(visceral hypersensitivity，VH)是引起IBS臨床癥狀的重要病理生理機(jī)制之一[6]。因此，用應(yīng)激方法建立VH模型，對于進(jìn)一步探索IBS發(fā)病機(jī)制和研發(fā)治療IBS的藥物具有重要意義。但是，現(xiàn)有的應(yīng)激方法如避水、束縛、母嬰分離等，存在刺激可控性差、容易產(chǎn)生應(yīng)激耐受、個(gè)體差異大等缺陷，影響研究的結(jié)果。足底電擊是建立大鼠焦慮、抑郁模型常用的一種應(yīng)激刺激[7-8]，具有可量化和穩(wěn)定的特點(diǎn)。而焦慮、抑郁也是引起VH的重要因素。因此，本研究嘗試采用足底電擊應(yīng)激法建立大鼠VH的模型，并與經(jīng)典的避水應(yīng)激法相比較，以期建立一種簡便而有效的VH造模方法，為相關(guān)研究提供更多的模型選擇。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級雌性SD大鼠24只，體重160 ～ 180 g，購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司【SCXK(滬)2017-0005】。大鼠飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心【SYXK(滬)2014-0008】，溫度20 ～ 26℃，濕度40% ～ 70%，自由進(jìn)水進(jìn)食，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后開始造模實(shí)驗(yàn)。所有實(shí)驗(yàn)經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)審批【SZY201712005】，操作均符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理要求。

1.1.2 儀器和試劑

大鼠ELISA檢測試劑盒：促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子(corticotrophin-releasing factor，CRF),貨號mL037302；促腎上腺皮質(zhì)激素(adrenocorticotrophic hormone，ACTH)，貨號mL002875;皮質(zhì)酮(corticosterone，CORT)，貨號mL002893；五羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)，貨號mL028308，均購自上海酶聯(lián)生物。避水應(yīng)激箱、恒壓電擊箱、壓力檢測氣囊均為自制。

1.2 方法

將實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為正常對照(normal control，NC)組、足底電擊(foot shock stress，F(xiàn)SS)組和避水應(yīng)激(water avoidance stress，WAS)組，每組8只，合籠飼養(yǎng)。NC組大鼠每日放入足底電擊箱內(nèi)1 h，不予刺激。FSS組和WAS組分別置于足底電擊箱和避水應(yīng)激箱予以相應(yīng)刺激。

1.2.1 避水應(yīng)激

參考Bradesi等[9]文獻(xiàn)中的方法，裝置為避水應(yīng)激箱(45 cm × 25 cm × 25 cm)，箱體中央設(shè)置一島型方臺(10 cm × 8 cm × 8 cm)，箱體注入室溫水(25℃)，水面距平臺表面下1 cm，大鼠放置于方臺上，每天1 h，連續(xù)10 d。

1.2.2 足底電擊

造模裝置為足底電擊箱，大小與避水應(yīng)激箱相同，在電擊箱底部平行鋪設(shè)直徑2.0 mm的不銹鋼絲，鋼絲長度超出箱底兩側(cè)各3.0 cm，鋼絲間隔0.5 cm，以大鼠足趾可同時(shí)接觸相鄰的至少2條鋼絲為準(zhǔn)，絕緣固定。將不相鄰的鋼絲分別在兩端用導(dǎo)絲連接，一端串聯(lián)自復(fù)位開關(guān)(LA38按鈕式自鎖點(diǎn)動(dòng)開關(guān)，深圳匯君科技有限公司)，接入可控硅電子恒壓器(WBT.4000 W，上海穩(wěn)伏電器有限公司)負(fù)極，另一端串聯(lián)15 W白熾燈(E27型鎢絲燈，佛山電器照明股份有限公司，常溫電阻R1=100 Ω，發(fā)熱電阻R2=3200 Ω)，接入恒壓器正極。將大鼠置于電擊箱中自由活動(dòng)1 h，后接通電源，施加足底電擊刺激。具體操作如下：刺激電壓為40 V，刺激頻率為20次/min，每次1 s，共5 min。為消除晝夜節(jié)律影響，刺激時(shí)間固定于每天8：00—10：00進(jìn)行，連續(xù)10 d。

1.2.3 排便量和糞便含水量檢測

造模期間隔日采集大鼠在應(yīng)激箱1 h內(nèi)的糞便，記錄顆粒數(shù)并稱重，質(zhì)量記為M1。然后置于70℃烘箱內(nèi)烘烤6 h，再次稱干重，質(zhì)量記為M2。糞便含水量計(jì)算公式為：

糞便含水量=(M1-M2)/M1×100%

1.2.4 直腸擴(kuò)張氣囊組裝

將8號兒童導(dǎo)尿管頂端剪除，在剪口處加熱使其鈍化，將定制的橡膠氣囊套于導(dǎo)尿管頂部，0號手術(shù)線扎緊。導(dǎo)尿管用三通閥與50 mL注射器和便攜式血壓計(jì)的導(dǎo)氣管相連，連接處嚴(yán)格密封。用注射器推注空氣，觀察記錄氣囊形變的壓力值為P0，注射器刻度值N0。

1.2.5 腹壁回縮反射(abdominal withdrawal reflex)測定

造模結(jié)束后第1天，大鼠禁食12 h，將直腸擴(kuò)張氣囊用石蠟油潤滑，輕柔插入肛門，末端距肛門約1 cm，用膠布將導(dǎo)尿管固定于鼠尾根部。將大鼠置入透明有機(jī)玻璃盒中，適應(yīng)10 min后，用注射器以2 mL/s速度向氣囊內(nèi)注氣。當(dāng)注射器刻度接近N0時(shí)推注速度降為0.5 mL/s，同時(shí)觀察大鼠腹壁。當(dāng)腹部肌肉收縮時(shí)，標(biāo)記為疼痛壓力閾值。所得壓力值減去球囊形變壓力P0為真實(shí)壓力閾值。每只大鼠重復(fù)操作3次，每次操作間隔2 min，取平均值。

1.2.6 動(dòng)物取材

在造模第4天、第7天、第10天以及造模結(jié)束后第1天，待大鼠于造模箱內(nèi)應(yīng)激1 h后，分別抽取尾靜脈血0.5 mL置于1.5 mL離心管中。所有血液標(biāo)本4℃靜置過夜后，3000 r/min勻速離心15 min，取血清備用，用于血清CRF、ACTH、CORT、5-HT等檢測。造模結(jié)束后第1天尾靜脈取血后，用2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，頸椎脫臼處死。剖腹，剪取距肛門5 cm以上的結(jié)腸組織4 cm，沿腸系膜縱向剖開，用磷酸鹽緩沖液漂洗，分成2等分，一段置入4%甲醛溶液中固定，用于病理檢查；另一段稱量50 mg，勻漿后用于ELISA檢測腸組織5-HT。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般行為和體重比較

造模期間各組大鼠毛發(fā)光澤濃密，飲食及體重增加穩(wěn)定。三組大鼠體重比較見表 1，差異無顯著性(P> 0.05)。NC組大鼠活動(dòng)自如，F(xiàn)SS組和WAS組大鼠受水環(huán)境和電擊應(yīng)激環(huán)境影響，均表現(xiàn)出精神緊張，活動(dòng)謹(jǐn)慎及異常排便等應(yīng)激行為。

表1 大鼠體重變化Table 1 Changes of body weight in the rats

注：三組間體重比較采用重復(fù)測量方差分析。

Note. Repeated measures. ANOVA is used to compare the changes of body weight among the three groups.

2.2 糞便顆粒數(shù)和含水量比較

造模期間大鼠排便顆粒數(shù)和糞便含水量結(jié)果見表2和表3。FSS組和WAS組大鼠經(jīng)過應(yīng)激刺激后，排便量明顯增多，組間比較，差異有顯著性(P< 0.05)。NC組大鼠對應(yīng)激箱環(huán)境能較好地適應(yīng)，糞便顆粒數(shù)穩(wěn)定，組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)比較，差異無顯著性(P> 0.05)。WAS組組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)比較，糞便顆粒數(shù)逐漸減少，差異有顯著性(P< 0.05)，在相同時(shí)間點(diǎn)避水組與正常組比較，從第7天起排便量相當(dāng)，差異無顯著性(P> 0.05)。FSS組排便顆粒數(shù)和糞便含水量增加明顯而穩(wěn)定，組內(nèi)比較差異無顯著性(P> 0.05)，排便顆粒數(shù)在相同時(shí)間點(diǎn)與NC組和WAS組比較，差異有顯著性(P< 0.05)。WAS組因排便顆粒沾水，無法有效獲取糞便及測量其含水量。

表2 大鼠排便顆粒數(shù)比較Table 2 Comparison of the number of stool particles (n) in the rats

注：與正常對照組比較，*P< 0.05；與避水應(yīng)激組比較，#P< 0.05。(下表同)

Note. Compared with the NC group,*P< 0.05. Compared with the WAS group,#P< 0.05.(The same in the following tables.)

表3 大鼠糞便含水量(%)比較Table 3 Comparison of water content(%)in feces of the

2.3 大鼠直腸疼痛壓力閾值比較

造模結(jié)束后第1天，檢測大鼠直腸敏感性。用自制氣囊刺激直腸誘發(fā)腹壁回縮反射，記錄引起腹部肌肉收縮的氣囊壓力值，減去氣囊形變壓力P0，作為疼痛壓力閾值。結(jié)果FSS組與WAS組的大鼠疼痛閾值較正常組均明顯降低，差異有顯著性(120.0 ± 7.6 mmHgvs.160± 2.1 mmHg; 148.3 ± 11.7 mmHgvs. 160.2 ± 2.1 mmHg,P< 0.05)，且FSS組比WAS組的降低更為明顯，存在顯著性差異 (120.0 ± 7.6 mmHgvs. 148.3 ± 11.7 mmHg,P< 0.05)。

2.4 大鼠血清CRF、ACTH和CORT濃度比較

大鼠經(jīng)過應(yīng)激刺激后，分別在第4天、第7天、第10天檢測其血清中CRF、ACTH及CORT激素濃度，結(jié)果見表4。WAS組和FSS組大鼠血清CRF、ACTH和CORT在造模第4、第7和第10天均較NC組明顯升高，差異有顯著性(P< 0.05)。WAS組大鼠血清CRF、ACTH、CORT濃度在第4天升高明顯，后逐漸降低，并從7 d起穩(wěn)定在一定水平，與第10天比較差異無顯著性(P> 0.05)。FSS組血清CRF、ACTH濃度逐漸升高，第7天起穩(wěn)定在較高濃度，與第10天比較，差異無顯著性(P> 0.05)，但CORT濃度持續(xù)升高，第4天、第7天、第10天差異均有顯著性(P< 0.05)。

表4 大鼠血清CRF(pg/mL)、ACTH(pg/mL)和CORT(ng/mL)濃度比較Table 4 Comparison of serum concentrations of CRF, ACTH and CORT in the rats

2.5 大鼠血清和組織5-HT濃度比較

造模結(jié)束后第1天，檢測大鼠血清和結(jié)腸組織中5-HT濃度，結(jié)果見表5。與NC組比較，F(xiàn)SS組和WAS組大鼠血清和組織5-HT濃度均明顯升高，差異有顯著性(P< 0.05)。FSS組5-HT濃度較WAS組升高明顯，差異有顯著性(P< 0.05)。

2.6 結(jié)腸黏膜病理表現(xiàn)

三組大鼠結(jié)腸黏膜HE染色均未見明顯結(jié)構(gòu)異常和炎性細(xì)胞浸潤，可排除模型動(dòng)物存在腸道炎癥和腸黏膜損傷。(見圖1)

組別Groups結(jié)腸Colon血清Serum對照組 NC10.1 ± 0.69.1 ± 0.4電擊組 FSS14.9 ± 0.5*#13.1 ± 0.5*#避水組 WAS13.7 ± 0.8*12.4 ± 0.4*

圖1 各組大鼠結(jié)腸黏膜組織切片(伊紅-蘇木素染色)Figure 1 Histopathological changes of colon tissue in different groups of the rats (HE staining)

3 討論

應(yīng)激誘導(dǎo)法如避水應(yīng)激[10]、束縛應(yīng)激[11]、母嬰分離[12]等通過人為的生理或心理刺激，間接誘導(dǎo)出腸道痛閾降低等VH表現(xiàn)。這些造模方法所建立的VH模型符合應(yīng)激可以誘導(dǎo)或者加重VH癥狀的IBS病理生理機(jī)制，且所建立模型的腸道無病理性損傷，因此一直作為經(jīng)典的造模方法被應(yīng)用于IBS內(nèi)臟高敏感性的研究中[13-14]。但是這些應(yīng)激方法尚存在一些不足之處：如母嬰分離法，幼鼠在成年后體長和體重等均一性差，導(dǎo)致其內(nèi)臟敏感性也存在較大的差異；又如避水應(yīng)激法，隨著應(yīng)激延長，大鼠會(huì)對其產(chǎn)生耐受。還有研究采用不可預(yù)知性慢性應(yīng)激刺激干預(yù)大鼠，以求避免應(yīng)激耐受，但是實(shí)驗(yàn)過程復(fù)雜，可操作性低[15]。

本研究采用足底電擊作為應(yīng)激刺激構(gòu)建VH模型。將大鼠放置于特制的足底電擊箱內(nèi)，大鼠足趾作為導(dǎo)體形成回路，電擊發(fā)生后大鼠跳起，電路瞬間斷開。如果大鼠不能躲避，則白熾燈亮起，燈絲發(fā)熱后電阻迅速增加，電擊籠內(nèi)電壓降至安全范圍，可使大鼠避免發(fā)生電擊損傷。實(shí)驗(yàn)中的電擊條件參照了有關(guān)文獻(xiàn)[7,16]的報(bào)道。在足底電擊造模期間大鼠足底皮膚微紅，1 h左右可恢復(fù)正常，無明顯皮損、腫脹等電擊傷，符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利的3R原則。在造模結(jié)束后檢測大鼠結(jié)腸黏膜并未出現(xiàn)病理損傷表現(xiàn)。本研究中內(nèi)臟敏感性的評價(jià)采取常用的直腸擴(kuò)張法[6]。造模結(jié)束后直腸擴(kuò)張刺激引發(fā)大鼠疼痛的壓力閾值明顯低于正常對照組。與經(jīng)典的避水應(yīng)激法相比，足底電擊法模型大鼠腸道疼痛壓力閾值降低存在更好的一致性，其指標(biāo)參數(shù)能更好地反映大鼠的VH。

本研究還觀察到，在避水應(yīng)激法造模中，部分大鼠多次落水后對溺水的恐懼感驟減，大鼠的排便數(shù)會(huì)隨造模天數(shù)的增加而逐漸減少。避水應(yīng)激法造模大鼠從第5天起排便粒數(shù)明顯減少，到第10天已接近于正常組。而足底電擊法造模大鼠3 d后可出現(xiàn)排便粒數(shù)增多和糞便含水量增加，明顯高于正常對照組，而且這一現(xiàn)象可穩(wěn)定持續(xù)到造模結(jié)束，更符合IBS大便性狀和排便習(xí)慣改變的臨床特點(diǎn)。

目前認(rèn)為，應(yīng)激引起的VH可能與下丘腦-垂體-腎上腺軸(hypothalamic-pituitary-adrenal axis，HPA)密切相關(guān)。大腦中樞接收應(yīng)激刺激信號，引起下丘腦分泌CRF，CRF通過垂體束的門脈系統(tǒng)進(jìn)入腦垂體前葉，引起ACTH的分泌，ACTH由血液循環(huán)運(yùn)送至腎上腺皮質(zhì)，引起糖皮質(zhì)激素的釋放[17]。嚙齒類動(dòng)物的糖皮質(zhì)激素主要成分是CORT。有研究[ 18-19]表明CRF和CORT可分別激活中樞及外周的CRF受體和糖皮質(zhì)激素受體，直接引起VH。因此CRF、ACTH、CORT等可作為評價(jià)大鼠應(yīng)激水平的重要指標(biāo)。本研究在造模期間動(dòng)態(tài)檢測了各組大鼠血清中CRF、ACTH、CORT等指標(biāo)，結(jié)果顯示避水和足底電擊兩種造模方法均可升高這些指標(biāo)的血清濃度。但避水組各指標(biāo)均一性較差，部分結(jié)果在造模結(jié)束時(shí)已接近正常值，提示大鼠對其應(yīng)激存在一定的耐受。電擊組各指標(biāo)的升高較避水組和正常對照組持久且穩(wěn)定，不存在應(yīng)激耐受現(xiàn)象。

5-HT是一種與VH形成密切相關(guān)的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)。其約90%由腸嗜鉻細(xì)胞(enterochromaffin cells，EC)合成，并以旁分泌形式進(jìn)入腸黏膜中。5-HT既可激活腸道初級神經(jīng)元，引起腸道蠕動(dòng)和分泌活動(dòng)的增強(qiáng)，也可興奮內(nèi)臟傳入神經(jīng)，進(jìn)而引起下游降鈣素基因相關(guān)肽、P物質(zhì)等多種神經(jīng)活性物質(zhì)的釋放，使傳入中樞的化學(xué)信號異常，引起不適感受，在IBS內(nèi)臟高敏感性形成過程中發(fā)揮重要作用[20]。因此，5-HT也是目前研究IBS治療藥物的重要靶點(diǎn)之一[21]。本研究檢測了各組大鼠結(jié)腸和血清中5-HT濃度，發(fā)現(xiàn)模型大鼠結(jié)腸組織和血清中5-HT濃度明顯升高，且與內(nèi)臟敏感性升高一致，與目前已知的研究結(jié)果相吻合。應(yīng)激如何引起EC釋放5-HT仍未知。但已有研究[22]發(fā)現(xiàn)，EC表面存在腎上腺素受體α2 A，激活后可引起5-HT的釋放。應(yīng)激是否通過增加腎上腺素的釋放，進(jìn)而刺激EC分泌5-HT，最終引起VH，可能是以后研究的新方向。

綜上所述，足底電擊具有很好的可控性，可成功誘導(dǎo)模型大鼠VH，模型參數(shù)均一性和穩(wěn)定性好，造模成功率高，不易出現(xiàn)應(yīng)激耐受，并可誘導(dǎo)大鼠排便量和糞便含水量的穩(wěn)定增加。該應(yīng)激造模法為研究應(yīng)激、VH和IBS之間的聯(lián)系提供了新的造模選擇。

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