吳晨爍，李曉月，秦明珍，嚴(yán)芬

(福州大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，福建 福州，350108)

褐藻膠(alginate)是由1,4-β-D-甘露糖醛酸(M)和1,4-α-L-古羅糖醛酸(G)兩種糖醛酸單體聚合而成的水溶性酸性多糖[1],在能源、農(nóng)業(yè)、食品和醫(yī)療等領(lǐng)域均有應(yīng)用價(jià)值[2-4]。由褐藻膠降解得到的褐藻膠寡糖具有降血糖血脂、抗自由基、抗病毒和抗腫瘤等功能[5-10]。褐藻膠裂解酶是通過(guò)β消除反應(yīng)催化褐藻膠產(chǎn)生褐藻寡糖的多糖裂解酶[11-13]。褐藻膠裂解酶的來(lái)源主要有海洋動(dòng)物、細(xì)菌和真菌等，獲得途徑主要是篩選產(chǎn)褐藻膠裂解酶菌株，以褐藻膠為碳源發(fā)酵，從發(fā)酵液中分離純化得到[14-15]。目前已報(bào)道產(chǎn)褐藻膠裂解酶的菌株有Exiguobacteriumspecies Alg-S5[16]、Microbulbifersp. ALW1[17]和Pseudoalteromonassp. B1[18]等。通過(guò)產(chǎn)酶菌株發(fā)酵液分離純化得到褐藻膠裂解酶存在發(fā)酵周期長(zhǎng)、產(chǎn)量低和純化效率低等問(wèn)題，而基因工程方法獲得重組褐藻膠裂解酶具有發(fā)酵周期短、產(chǎn)量高和易于純化等優(yōu)點(diǎn)[19-22]。目前已實(shí)現(xiàn)褐藻膠裂解酶基因原核表達(dá)有褐藻膠裂解酶oalS6[23]、AlyL1[24]、OalY1和OalY2[25]等。此外，通過(guò)生物信息學(xué)技術(shù)分析預(yù)測(cè)褐藻膠裂解酶基因中是否含有編碼信號(hào)肽的核酸序列，PCR擴(kuò)增不含信號(hào)肽的褐藻膠裂解酶基因，于工程菌中成功表達(dá)具有褐藻膠裂解酶活性的重組蛋白[26-28]。通過(guò)克隆不含信號(hào)肽的褐藻膠裂解酶基因，構(gòu)建重組菌株并誘導(dǎo)表達(dá)，重組酶的分離純化和酶學(xué)性質(zhì)研究，不但獲得重組褐藻膠裂解酶，還為研究信號(hào)肽對(duì)褐藻膠裂解酶的影響奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種和質(zhì)粒

假交替單胞菌(Pseudoalteromonassp.)B1[18]，宿主大腸桿菌DH5α和BL21(DE3) 為實(shí)驗(yàn)室保藏菌種，質(zhì)粒pGEX-4T-1為實(shí)驗(yàn)室保藏質(zhì)粒。

1.2 主要試劑

T4 DNA連接酶、限制性?xún)?nèi)切酶、pMD18T、DNA Marker和Gene Walking kit購(gòu)于TAKARA公司；PCRmix購(gòu)于北京全式金公司；引物合成、氨芐青霉素、蛋白Marker、Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒、質(zhì)粒小量抽提試劑盒和膠回收試劑盒購(gòu)于上海生工生物工程有限公司，其他常規(guī)藥品購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 培養(yǎng)基

人工海水：NaCl 26.5 g、MgCl2·7H2O 2.1 g、KCl 0.9 g、CaCl2·2H2O 1.2 g、MgSO4·7H2O 4.2 g，蒸餾水加至1 L，pH 7.0[29]。

2216E培養(yǎng)基：蛋白胨 5 g、酵母粉 3 g、FeCl3·6H2O 0.02 g、人工海水加至1 L，pH 7.0[29]。

大腸桿菌的培養(yǎng)基為L(zhǎng)B培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、酵母粉5 g、NaCl 10 g、蒸餾水加至1 L，pH 7.0。

1.4 提取假交替單胞菌B1的基因組DNA

假交替單胞菌B1是本實(shí)驗(yàn)室從海洋來(lái)源的樣品中篩選得到并保藏的1株產(chǎn)褐藻膠裂解酶菌株。將菌株接種到2216E培養(yǎng)基，于28 ℃、180 r/min培養(yǎng)12～16 h，利用細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒提取假交替單胞菌B1基因組DNA。

1.5 Touch-down PCR擴(kuò)增保守區(qū)片段

根據(jù)CAZY數(shù)據(jù)庫(kù)中PL7家族褐藻膠裂解酶氨基酸序列比對(duì)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)2個(gè)保守性較高序列“HPDFFYLD”和“NGDYAQVS”，根據(jù)保守序列設(shè)計(jì)2條簡(jiǎn)并引物，分別標(biāo)注為B1-Q3-F和B1-Q3-R2(表1)。PCR擴(kuò)增體系：基因組DNA模板1 μL，上下游引物各1 μL，2×PCRmix 25 μL，去離子水補(bǔ)足至50 μL。擴(kuò)增條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 2 min，每個(gè)循環(huán)的退火溫度減1 ℃，減至50 ℃后以50 ℃為退火溫度再做20個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。

1.6 獲得褐藻膠裂解酶基因及核酸序列分析

根據(jù)測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)上下游各3條特異性引物，分別命名為B27F1、B27F2、B27F3、B27R1、B27R2和B27R3(表1)，配合Gene Walking kit試劑盒PCR擴(kuò)增保守區(qū)兩側(cè)，PCR產(chǎn)物測(cè)序。保守區(qū)兩側(cè)序列與保守區(qū)通過(guò)軟件拼接得到褐藻膠裂解酶基因B13Q，設(shè)計(jì)上下游引物命名為B13QF和B13QR(表1)。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

注：下劃線(xiàn)為酶切位點(diǎn)，加粗為保護(hù)堿基。

通過(guò)Signal P 3.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/)預(yù)測(cè)是否存在信號(hào)肽，將去除信號(hào)肽后的褐藻膠裂解酶基因命名為B1SM，設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)BamHⅠ和XhoⅠ的引物B1SMFH和B1SMRX(表1)。通過(guò)Expasy的Compute pI/Mw tool(http://web.expasy.org/compute_pi/)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)和理論分子量，利用Swiss-Model(https://www.swissmodel.expasy.org/)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.7 重組質(zhì)粒的構(gòu)建和重組菌株誘導(dǎo)表達(dá)

將去除信號(hào)肽后的褐藻膠裂解酶基因B1SM連接至pMD18T載體構(gòu)建質(zhì)粒pMD18T-B1SM，限制性?xún)?nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ分別酶切pMD18T-B1SM與pGEX-4T-1，T4連接酶連接構(gòu)建重組表達(dá)載體pGEX-B1SM并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)構(gòu)建重組表達(dá)菌株。重組表達(dá)菌株接種至5 mL含100 μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基，37 ℃、搖床轉(zhuǎn)速200 r/min過(guò)夜培養(yǎng)，按1%接種量轉(zhuǎn)接至100 mL含氨芐青霉素LB新培養(yǎng)基中，37 ℃、搖床轉(zhuǎn)速200 r/min培養(yǎng)至OD600為0.4～0.5時(shí)加IPTG至終濃度1.0 mmol/L，25 ℃誘導(dǎo)16 h。培養(yǎng)物經(jīng)超聲波破碎和離心得粗酶液，GST親和層析柱分離純化，SDS-PAGE觀察純化結(jié)果。

1.8 pH和溫度對(duì)重組酶B1SM的影響

在相同pH環(huán)境中酶液與底物的混合物分別置于不同溫度(10、20、25、30、40、50、60 ℃)孵育30 min測(cè)酶活，以最高酶活為100%，計(jì)算相對(duì)酶活，確定最適溫度。重組酶分別與不同pH(3、4、5、6、7、8、9、10)緩沖液配置底物混合，最適溫度反應(yīng)測(cè)酶活，以最高酶活力為100%計(jì)算其余組分酶活力，確定最適pH。酶液分別置于不同pH(3、4、5、6、7、8、9、10)緩沖液，室溫(25 ℃)放置1 h，最適條件反應(yīng)測(cè)酶活力，以未處理酶液酶活力為100 %計(jì)算各組酶活力。將酶液置于不同溫度(30、40、50 ℃)孵育1 h，最適條件反應(yīng)測(cè)酶活，以未處理酶液酶活為100%計(jì)算各組酶活。

2 結(jié)果與分析

2.1 褐藻膠裂解酶基因及其序列分析

通過(guò)保守區(qū)簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增約到800 bp的特異性條帶，測(cè)序結(jié)果顯示大小為832 bp(圖1)，保守區(qū)特異性引物和Gene Waiking kit的簡(jiǎn)并引物，通過(guò)3次熱不對(duì)稱(chēng)PCR反應(yīng)分別擴(kuò)增保守區(qū)3’端和5’端未知區(qū)域片段(圖2)，拼接序列獲得基因B13Q。PCR擴(kuò)增基因B13Q結(jié)果如圖3，長(zhǎng)度1 089 bp，編碼362個(gè)氨基酸，Blastx分析其屬于PL7家族，與Pseudoalteromonassp. SM0524的褐藻膠裂解酶的匹配達(dá)到95%，證明基因B13Q為褐藻膠裂解酶基因。Signal P 3.0分析基因B13Q具有28個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽，PCR擴(kuò)增其去除編碼信號(hào)肽的核酸序列B1SM(如圖4)，長(zhǎng)1 008 bp，編碼334個(gè)氨基酸，理論等電點(diǎn)為8.51，理論分子質(zhì)量為37.13 kDa。Swiss-Model分析基因B1SM編碼蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)(圖5)，與已報(bào)道的褐藻膠裂解酶4be3.1.A的三級(jí)結(jié)構(gòu)有45.99%的相似度。

M-DNA Marker；1- Touch down PCR擴(kuò)增產(chǎn)物圖1 Touch down PCR結(jié)果Fig.1 Touch down PCR

M-DNA marker；1、2、3、4分別表示4個(gè)簡(jiǎn)并引物AD1、AD2、AD3、AD4、與5’端的特異性引物第3輪PCR結(jié)果；5、6、7、8分別表示4個(gè)簡(jiǎn)并引物AD1、AD2、AD3、AD4與3’端的特異性引物第3輪PCR結(jié)果圖2 染色體移步方法獲得B13Q基因兩端未知序列Fig.2 Chromosome walking method to get the unknownB13Q gene sequence

M-250 bp DNA Marker；1-PCR擴(kuò)增褐藻膠裂解酶基因B13Q圖3 PCR擴(kuò)增褐藻膠裂解酶基因B13QFig.3 PCR product of alginate lyase gene B13Q

M-250 bp DNA Marker；1-PCR擴(kuò)增褐藻膠裂解酶基因B1SM；2-PCR擴(kuò)增褐藻膠裂解酶基因B13Q圖4 褐藻膠裂解酶基因B1SM的PCR擴(kuò)增電泳圖Fig.4 PCR product of alginate lyase gene B1SM

圖5B1SM基因編碼蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)
Fig.5 Three-dimensional simulated structure ofB1SM

2.2 重組褐藻膠裂解酶B1SM基因的重組表達(dá)與純化

重組表達(dá)菌株BL21(DE3)-pGEX-4T-B1SM誘導(dǎo)表達(dá)情況如圖6所示，因?yàn)镚ST標(biāo)簽的理論分子質(zhì)量為26 kDa，褐藻膠裂解酶B1SM理論分子質(zhì)量為37.13 kDa，所以重組蛋白理論分子量為63.13 kDa。粗酶液經(jīng)GST親和層析分離純化結(jié)果如圖7所示。

M-蛋白Marker；1-未誘導(dǎo)重組菌全細(xì)胞；2-誘導(dǎo)后重組菌全細(xì)胞圖6 重組褐藻膠裂解酶B1SM的SDS-PAGE分析Fig.6 SDS-PAGE analysis of recombinant Alginate lyase B1SM

其洗脫液與誘導(dǎo)后重組菌全細(xì)胞在相同位置出現(xiàn)重組酶(圖7的4泳道)，流出液和洗脫液分別用DNS法測(cè)酶活，僅洗脫液具有褐藻膠裂解酶活性，說(shuō)明純化到重組褐藻膠裂解酶B1SM。

M-Marker；1-未誘導(dǎo)重組菌液；2-IPTG誘導(dǎo)超聲波破碎重組菌上清液；3-重組酶B1SM純化流出液；4-純化后重組酶B1SM圖7 純化重組褐藻膠裂解酶B1SM的SDS-PAGE分析Fig.7 SDS-PAGE analysis of purified recombinant Alginatelyase B1SM

2.3 重組褐藻膠裂解酶的酶學(xué)性質(zhì)

由圖8-A可知在pH 7.0的條件下重組褐藻膠裂解酶裂解褐藻膠的最適溫度為25 ℃，說(shuō)明重組酶B1SM在常溫下可降解褐藻膠。由圖8-B可知，在25 ℃條件下重組酶在pH 6～10之間酶活較高，最適pH為8.0。由圖8-C可知在pH 7.0～9.0范圍內(nèi)25 ℃下保溫1 h剩余酶活仍保持在60%以上，說(shuō)明重組酶在堿性條件下酶活較高且穩(wěn)定。由圖8-D可知在pH 8.0和30 ℃條件下重組酶的剩余酶活維持在60%以上，在40 ℃和50 ℃條件下保溫20 min后重組酶的剩余酶活低于20%，說(shuō)明重組酶B1SM在30℃穩(wěn)定性較好。

圖8 pH和溫度對(duì)重組褐藻膠裂解酶B1SM的酶活和
穩(wěn)定性的影響
Fig.8 Effect of temperature and pH on activity and stability
of the recombinant Alginate lyase B1SM

3 結(jié)論

本文從實(shí)驗(yàn)室保藏1株產(chǎn)褐藻膠裂解酶菌株假交替單胞菌B1的基因組DNA中擴(kuò)增到褐藻膠裂解酶基因B13Q，經(jīng)分析預(yù)測(cè)褐藻膠裂解酶基因B13Q具有28個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽，根據(jù)去除信號(hào)肽后的核酸序列設(shè)計(jì)上下游引物，從假交替單胞菌B1的基因組中克隆到不含信號(hào)肽的褐藻膠裂解酶基因B1SM，連接到表達(dá)載體pGEX-4T-1構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-B1SM并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)，獲得重組表達(dá)菌株BL21(DE3)-pGEX-B1SM，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)和分離純化得重組酶B1SM，分析其酶學(xué)性質(zhì)，重組酶最適溫度25 ℃，最適pH 8.0，在pH 6.0～9.0范圍內(nèi)放置于25 ℃孵育1 h仍有60%以上的酶活，于pH 8.0環(huán)境中酶在40 ℃及以上溫度孵育酶活迅速降低，在40 ℃放置10 min酶活降低到40%以下，而30 ℃放置1 h酶活仍保持在60%，說(shuō)明該重組酶在室溫(25 ℃)及pH 6.0～9.0的條件下即可降解褐藻膠產(chǎn)生褐藻寡糖。