響應(yīng)面法優(yōu)化草莓品種紅顏離體繁殖的增殖條件

姚思揚(yáng) 趙春莉 劉子平 劉翰升 劉玥

摘要：為了研究?jī)?yōu)化紅顏草莓繼代增殖培養(yǎng)的條件，以草莓品種紅顏繼代組培苗為試驗(yàn)材料，利用響應(yīng)面法對(duì)其增殖條件進(jìn)行優(yōu)化。在單因素的試驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以瓊脂濃度、光照度、pH值為試驗(yàn)因子，以增殖系數(shù)為響應(yīng)值，進(jìn)行3因素3水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)。結(jié)果表明：3因素對(duì)植株增殖系數(shù)的影響力大小為光照度>pH值>瓊脂濃度，最終得到的二元回歸方程顯示，紅顏草莓增殖條件的優(yōu)化結(jié)果如下：瓊脂濃度為 7.1 g/L，pH值為5.37，光照度為2 177 lx。在此條件下，最佳增殖系數(shù)預(yù)測(cè)值為10.930 5，實(shí)際操作結(jié)果為10.73。

關(guān)鍵詞：草莓品種;離體繁殖;增殖條件;響應(yīng)面法

中圖分類號(hào)： S668.404+.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2019）23-0088-04

草莓（Fragaria×ananassa Duch.）是薔薇科草莓屬多年生草本植物，紅顏（Benihoppe）為著名的日本品種，是以幸香和章姬為親本雜交選育而來(lái)的，其果實(shí)鮮紅飽滿，味道香甜可口，產(chǎn)量高，耐儲(chǔ)存耐運(yùn)輸[1]，深受廣大種植者和消費(fèi)者的喜愛(ài)，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，擁有廣闊的市場(chǎng)。草莓的傳統(tǒng)繁殖方法是匍匐莖繁殖和分枝繁殖，效率低，易感染病毒，長(zhǎng)久的病毒累積使品種退化，產(chǎn)量降低[2]。經(jīng)過(guò)莖尖脫毒培養(yǎng)后進(jìn)行離體快繁，不受季節(jié)限制，產(chǎn)量高，培養(yǎng)周期短，是獲得大量無(wú)病毒原種苗的有效手段。

目前，關(guān)于草莓組培的相關(guān)研究，大部分集中于探討培養(yǎng)基內(nèi)激素的種類及濃度，旨在篩選出每個(gè)階段的最佳培養(yǎng)基[3-7]，但關(guān)于其他培養(yǎng)條件的優(yōu)化研究鮮有報(bào)道。本試驗(yàn)旨在探討增殖階段，pH值、光照度、瓊脂濃度對(duì)其增殖率的影響。并在單因素的試驗(yàn)基礎(chǔ)上，參考Box-Behnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，用響應(yīng)面法將各因子的相互關(guān)系進(jìn)行擬合分析，研究各因子與響應(yīng)值的關(guān)系，從而優(yōu)化紅顏草莓的組培條件，以期為今后相關(guān)研究提供理論實(shí)踐基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)溫室的當(dāng)年生草莓匍匐莖尖，于2017年5月采摘，在園藝學(xué)院園林生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)經(jīng)初代培養(yǎng)后，選取長(zhǎng)勢(shì)一致的、高2 cm左右的紅顏草莓繼代組培苗為試驗(yàn)材料。在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，所用的培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0 mg/L+IBA 0.1 mg/L，蔗糖濃度30 g/L。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 單因素試驗(yàn)

1.2.1.1 pH值對(duì)增殖系數(shù)的影響 將不定芽接種到培養(yǎng)基內(nèi)，光照度為2 000 lx，光照時(shí)間為14 h/d，培養(yǎng)室溫度為 （25±2） ℃，pH值為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，瓊脂粉濃度為 7 g/L。每個(gè)水平處理10個(gè)組培苗，培養(yǎng)周期為30 d。

1.2.1.2 光照度對(duì)增殖系數(shù)的影響 將不定芽接種到培養(yǎng)基內(nèi)，pH值為6.0，光照時(shí)間為14 h/d，培養(yǎng)室溫度為（25±2） ℃，光照度為1 200、1 500、1 800、2 100、2 400 lx。瓊脂粉濃度為7 g/L，每個(gè)水平處理10個(gè)組培苗，培養(yǎng)周期為30 d。

1.2.1.3 瓊脂濃度對(duì)增殖系數(shù)的影響 將不定芽接種到培養(yǎng)基內(nèi)，pH值為6.0，光照時(shí)間為14 h/d，光照度為2 000 lx，培養(yǎng)室溫度為（25±2） ℃，瓊脂濃度為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0 g/L，每個(gè)水平處理10個(gè)組培苗，培養(yǎng)周期為30 d。

1.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，用響應(yīng)面分析法，根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以pH值、光照度、瓊脂濃度為試驗(yàn)因子，增殖系數(shù)為響應(yīng)值，進(jìn)行3因素3水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，見(jiàn)表1。每個(gè)水平處理10個(gè)組培苗，培養(yǎng)周期為30 d。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用SPSS和Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。增殖系數(shù)=培養(yǎng)30 d后不定芽總數(shù)/接種的不定芽數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 pH值對(duì)增殖系數(shù)的影響 由表2可知，pH值為5.5時(shí)，試管苗呈翠綠色，植株健壯，與其他大部分處理間差異顯著。當(dāng)pH值為6.0時(shí)，增殖系數(shù)隨著pH值的繼續(xù)升高而降低。當(dāng)pH值為7.0時(shí)，培養(yǎng)基內(nèi)環(huán)境為堿性，增殖系數(shù)只有3.30，植株矮小，長(zhǎng)勢(shì)不佳。由此可見(jiàn)，草莓增殖階段更適于酸性的培養(yǎng)環(huán)境，堿性環(huán)境會(huì)抑制其增殖與生長(zhǎng)，增殖培養(yǎng)的最適pH值為5.5，增殖系數(shù)可達(dá)5.90。

2.1.2 光照度對(duì)增殖系數(shù)的影響 由表2可知，增殖系數(shù)隨光照度的增大呈先上升后下降的趨勢(shì)，在光照度 1 200 lx 下，試管苗生長(zhǎng)緩慢，長(zhǎng)勢(shì)不佳，增殖率只有3.1。隨著光照度的增加，植株長(zhǎng)勢(shì)隨之變好，增殖系數(shù)隨之增加，但光照度為2 400 lx時(shí)，增殖系數(shù)下降，且試管苗失綠變透明狀，有玻璃化現(xiàn)象。由此可見(jiàn)，光照度過(guò)低會(huì)抑制植株生長(zhǎng)，過(guò)高會(huì)產(chǎn)生玻璃化苗，不利于植株生長(zhǎng)，增殖培養(yǎng)的最佳光照度為 2 100 lx，增殖系數(shù)為6.90。

2.1.3 瓊脂濃度對(duì)增殖系數(shù)的影響 由表2可知，瓊脂濃度低于7.0 g/L時(shí)，增殖系數(shù)都低于5，植株矮小且有玻璃化苗產(chǎn)生。當(dāng)瓊脂濃度≥7.0 g/L時(shí)，植株生長(zhǎng)健壯，無(wú)玻璃化苗。C4、C5這2處理差異不顯著，都有很好的增殖效果，且植株長(zhǎng)勢(shì)極佳，但從經(jīng)濟(jì)成本上考慮，篩選出最適宜增殖培養(yǎng)的瓊脂濃度為7.5 g/L，增殖系數(shù)為6.50。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 二元模型的建立與分析 以增殖系數(shù)（Y）為響應(yīng)值，瓊脂濃度（X1）、pH（X2）、光照度（X3）為因素，經(jīng)過(guò)Design-Expert 8.0.6軟件分析，得出的回歸方程模型為Y=10.66+0.36X1-0.89X2+1.00X3+0.33X1X2+0.050X1X3+020X2X3-0.89X21-1.54X22-1.87X23。該回歸模型P為 0.000 3<0.01，有極顯著差異，失擬項(xiàng)為0.174 6>0.05，差異不顯著，模型穩(wěn)定性較好。該方程響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表3。R2=0.962 6，說(shuō)明方程擬合性良好，試驗(yàn)誤差小。由表4可知，X1對(duì)響應(yīng)值影響不顯著，X2、X3影響極顯著，3因素對(duì)增殖系數(shù)的影響力大小為X3>X2>X1，X1、X2、X3的二次項(xiàng)都對(duì)響應(yīng)值有極顯著影響，交互作用影響均不顯著。

2.2.2 響應(yīng)面分析 根據(jù)擬合方程，繪制3因素之間交互作用的響應(yīng)面圖和等高線圖，各圖表示在1種因素取值為0時(shí)，其他2種因素對(duì)響應(yīng)值的影響。響應(yīng)面曲面的陡峭程度可表明因素對(duì)響應(yīng)值的影響力大小，曲面越陡，影響力越大，反之則越小。由等高線的形狀可知交互效應(yīng)的強(qiáng)弱，橢圓形表明效應(yīng)顯著，圓形則相反[8]。由圖1、圖2、圖3可知，有關(guān)瓊脂濃度的曲面較平緩，可見(jiàn)瓊脂的影響力小。關(guān)于光照度的曲面都很陡峭，可見(jiàn)光照度是影響力最大的因素。通過(guò)等高線圖及響應(yīng)面圖可見(jiàn)瓊脂濃度與pH值的交互作用影響力最大，其次是光照度與pH值，影響力最小的是光照度與瓊脂濃度的交互作用。

2.2.3 模擬方程的驗(yàn)證試驗(yàn) 通過(guò)二次回歸方程的分析可得出紅顏草莓增殖的最優(yōu)條件如下：瓊脂濃度為7.08 g/L，pH值為5.37，光照度為2 176.99 lx，最佳增殖系數(shù)預(yù)測(cè)值為10.930 5。對(duì)該模型進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)， 試驗(yàn)條件如下：瓊脂濃度為7.1 g/L，pH值為5.37，光照度為2 177 lx。每次處理10個(gè)不定芽，得出的3次結(jié)果為10.7、11.2、10.3，平均值為10.73。與預(yù)測(cè)值十分接近，說(shuō)明方程與真實(shí)試驗(yàn)擬合度較好，該優(yōu)化方案有實(shí)際意義和可行度。

3 討論與結(jié)論

光照度是影響植物光合作用的主要因素，在一定范圍內(nèi)，隨著光照度的增強(qiáng)， 植株長(zhǎng)勢(shì)隨之變好。但光照度超過(guò)一定

范圍，則會(huì)對(duì)植物產(chǎn)生不利影響[9]。不同種類的組培苗所需光照差異性較大，如紅樹(shù)莓增殖階段的最適光照度為 1 500 lx[10]，紫花含笑在8 000 lx的強(qiáng)光下更適于芽的生長(zhǎng)[11]，金葉復(fù)葉槭在4 200 lx的光照度下生長(zhǎng)效果最佳[12]，香蕉組培苗增殖階段只需1 000 lx光照度[13]。在組培的不同階段，所需光照度不同，通常在生根階段組培苗所需的光照更多，隨著組培苗生長(zhǎng)狀態(tài)的變化，要合理調(diào)控光因素，才可使植株更好生長(zhǎng)，可見(jiàn)光照是影響組培苗生長(zhǎng)的重要因素。不同植物所需的培養(yǎng)基酸堿環(huán)境不同，本試驗(yàn)證明，紅顏草莓更適于酸性培養(yǎng)基。瓊脂有凝固培養(yǎng)基的作用，可影響培養(yǎng)基內(nèi)的水分，其濃度對(duì)植物生長(zhǎng)也存在一定影響。瓊脂濃度低，培養(yǎng)基內(nèi)水分多，不利于植物生長(zhǎng)分化，會(huì)有玻璃化現(xiàn)象產(chǎn)生;瓊脂濃度高，培養(yǎng)基偏硬，會(huì)使植物失水，造成植株萎蔫[14]。這與本試驗(yàn)結(jié)果一致，在單因素試驗(yàn)中，瓊脂濃度低于 7 g/L 時(shí)，有玻璃化現(xiàn)象，植株長(zhǎng)勢(shì)不佳。

在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，光照度過(guò)高、瓊脂濃度過(guò)低時(shí)會(huì)產(chǎn)生玻璃化苗。玻璃化是一種植物在離體快繁中發(fā)生的生理、形態(tài)異常的現(xiàn)象，可危害試管苗正常生長(zhǎng)。玻璃化苗植株矮小，莖干透明狀，葉片透明狀，脆弱失綠，長(zhǎng)勢(shì)不佳[15]。產(chǎn)生玻璃化的原因有很多，高溫密封的培養(yǎng)環(huán)境、高濃度的植物激素加速了植物生長(zhǎng)，瓶?jī)?nèi)氣體濃度發(fā)生變化，供植物正常生長(zhǎng)的氣體交換環(huán)節(jié)受到影響，易產(chǎn)生玻璃化[16]。溫度過(guò)高、濕度過(guò)大、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度高、繼代次數(shù)太多，都易出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象，影響植株長(zhǎng)勢(shì)[17]。對(duì)于輕度的玻璃化苗，增加蔗糖濃度，添加活性炭可使其緩解或恢復(fù)[18]。在組培試驗(yàn)中，要嚴(yán)格控制通風(fēng)、溫度、光照等培養(yǎng)環(huán)境，控制激素濃度，避免或減少玻璃化苗的產(chǎn)生。

在單因素試驗(yàn)中，光照度、瓊脂濃度、pH值的最佳增殖系數(shù)分別為6.9、6.5、5.9。而優(yōu)化試驗(yàn)中最佳增殖系數(shù)為 10.73，明顯高于單因素的試驗(yàn)結(jié)果。響應(yīng)面分析法是一種試驗(yàn)次數(shù)少、回歸方程精度高、能研究多因子間交互作用的研究方法，其高效便捷，可節(jié)省人力、成本和時(shí)間[19-20]。優(yōu)化試驗(yàn)的結(jié)果顯示，最適合紅顏草莓增殖的培養(yǎng)環(huán)境如下：瓊脂濃度 7.1 g/L，pH值為5.37，光照度為2 177 lx，增殖系數(shù)為 10.73。陳英等研究得到的最佳增殖系數(shù)為6.62[21]。翟婷婷研究得出的最佳增殖系數(shù)為5.0[22]，與現(xiàn)有研究相比本試驗(yàn)的增殖系數(shù)高于已報(bào)道的部分研究結(jié)果，說(shuō)明篩選增殖條件有實(shí)際意義。

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收稿日期：2018-09-05

基金項(xiàng)目：吉林省重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目（編號(hào)：20140204026NY）。

作者簡(jiǎn)介：姚思揚(yáng)（1994—），女，山東壽光人，碩士研究生，主要從事觀賞植物資源引種馴化及繁殖技術(shù)研究。E-mail：1575603119@qq.com。

通信作者：趙春莉，博士，副教授，主要從事觀賞植物資源引種馴化及繁殖技術(shù)研究。E-mail：zcl8368@163.com。