李文文 宋少鵬 馬秀嵐

中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院耳科

中耳膽脂瘤是一種良性鱗狀上皮角質(zhì)化增生性病變[1]，由鱗狀層狀角質(zhì)化上皮細(xì)胞組成，它表現(xiàn)為一種含有成纖維細(xì)胞和炎性細(xì)胞的表皮樣囊腫[2]。中耳膽脂瘤的特點是細(xì)胞過度增殖[3,4],伴隨的是角蛋白碎片的積累和顳骨及其周圍骨結(jié)構(gòu)的破壞[5]。膽脂瘤除導(dǎo)致聽力損傷和耳流膿外還可以導(dǎo)致多種顱內(nèi)外并發(fā)癥，如迷路炎、面癱、乙狀竇血栓性靜脈炎、腦膜炎、腦膿腫等[6,7]。膽脂瘤發(fā)病機制復(fù)雜，影響因素很多[7]，對中耳膽脂瘤患者體內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶基因表達量及蛋白表達情況的研究，有助于提高對膽脂瘤復(fù)雜的致病機制的認(rèn)識。本文選用WB和PCR完善MMP在中耳膽脂瘤發(fā)生發(fā)展過程中的機制。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集2017年2月～2018年2月在盛京醫(yī)院耳科手術(shù)的部分中耳膽脂瘤標(biāo)本36例,同時收集術(shù)耳外耳道皮膚29例（開放式乳突切除術(shù)+鼓室成形術(shù)+耳甲腔成型術(shù)中廢棄不用的外耳道皮膚的小碎塊）作為對照組。其中男16例，女20例，年齡18-64歲，平均年齡41.85歲病程為一月至40年不等。留取樣本組織置于液氮中或者放入深低溫(-80℃)冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑及來源

鼠抗人MMP2抗體購于R&D，兔抗人MMP9抗體購于CST（CELL Singaling TECHNOLOGY），鼠抗人GAPDH抗體購于proteintech，RT-PCR試劑購于TAKARA，引物由生工生物工程公司合成，見表1。

1.3 RT-PCR檢測MMP2和MMP9mRNA的表達情況

1.3.1 總RNA的抽提和反轉(zhuǎn)錄

50mg組織，加800ulRNAiso Plus后勻漿，靜置5min，加入 200ul氯仿，震蕩均勻，靜置 5min，12000g 4℃離心15min，上清移入新EP管，加入500ul異丙醇，靜置10min，12000g 4℃離心10min，棄上清，加入500ul75%乙醇清洗沉淀，7500g 4℃離心5min，棄上清保留沉淀，干燥，溶解于適量DEPC水中，用于反轉(zhuǎn)錄的模板。cDNA合成按照Prime?ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser說明完成。

1.3.2 RT-PCR

反應(yīng)體系 SYBR Premix Ex TaqⅡ 10ul,PCR Forward Primer(5uM)1ul,PCR Reverse Primer(5uM)1ul,DNA模板 2ul，DEPC水6ul，共20ul。PCR反應(yīng)條件預(yù)變性95℃ 30s；PCR反應(yīng)，95℃ 5s，60℃ 20s，40個循環(huán)結(jié)束。

1.3.3 PCR產(chǎn)物的鑒定瓊脂糖凝膠電泳用0.5X TBE配制1.5%瓊脂糖凝膠，電泳緩沖液為0.5X TBE，電壓100v，電泳1h。用溴化乙錠顯色。

1.4 Western Blot檢測MMP2和MMP9的蛋白表達情況

取適量組織，加入RIPA裂解液，冰上充分研磨，充分震蕩，靜止10min重復(fù)三次，4度12000g離心30min，提取上清液，保存?zhèn)溆?。檢測蛋白濃度，配膠，上樣，電泳，恒壓80v跑電泳，按照marker的指示，根據(jù)每個蛋白分子量的不同，切出所需蛋白分子量的膠：MMP2約為72KD,MMP9約為84-92KD,GAPDH約為36KD。PVDF膜進行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜后用5%的脫脂牛奶封閉2h，后用2.5%牛奶按照一定的比例稀釋一抗：MMP2 1:500,MMP9 1:1000,GAPDH 1:5000。一抗4℃冷放孵育過夜，1xT?BST洗滌三次，每次10min，二抗室溫孵育兩小時，1xTBST洗滌三次，每次10min。利用電化學(xué)發(fā)光ECL顯色試劑盒顯色，軟件分析條帶吸光度。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS32.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。對數(shù)據(jù)進行t檢驗，正態(tài)分布檢驗，方差齊性檢驗，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MMP2和MMP9在中耳膽脂瘤及外耳道皮膚的蛋白的表達

中耳膽脂瘤中MMP2和MMP9的表達量明顯高于外耳道皮膚，對樣本相對灰度值分析結(jié)果顯示，中耳膽脂瘤中MMP2的相對表達量4.110±1.039，高于外耳道皮膚0.6660±0.2151（P<0.05）,膽脂瘤中MMP9的相對表達量15.98±6.520顯著高于外耳道皮膚1.033±0.3756（P<0.05）具有統(tǒng)計學(xué)意義。見圖1和表2。

圖1 MMP2和MMP9在中耳膽脂瘤與外耳道皮膚中蛋白的表達情況（C:膽脂瘤，N：外耳道皮膚）Fig.1 Expression of proteins(MMP2 and MMP9)in middle ear cholesteatoma and external auditory canal skin（C:cholesteatoma,N:normal skin）

2.2 MMP2和MMP9在中耳膽脂瘤及外耳道皮膚中的mRNA的表達情況

MMP2，MMP9在中耳膽脂瘤及外耳道皮膚中均表達，MMP2和MMP9在中耳膽脂瘤中的表達明顯高與外耳道皮膚，用2-ΔΔCT計算，膽脂瘤組和對照組的MMP2 mRNA相對表達量分別為8.234±2.325和1.255±0.3087，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。膽脂瘤組和對照組的MMP9 mRNA相對表達量分別為99.35±31.92和1.522±0.5290，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），見圖2和表3。

表1 PCR引物序列Table 1 PCR primer sequence

圖2 MMP2和MMP9在中耳膽脂瘤與外耳道皮膚中mRNA的表達情況(C:膽脂瘤，N：外耳道皮膚)Fig.2 mRNA expression of MMP2 and MMP9 in middle ear cholesteatoma and the skin of external auditory canal(C:cholesteatoma,N:normal skin)

3 討論

中耳膽脂瘤是一種具有侵襲性的發(fā)生于顳骨區(qū)的角質(zhì)化鱗狀上皮異常生長，膽脂瘤上皮細(xì)胞可分泌炎癥因子[8]，而這些炎癥因子使膽脂瘤發(fā)展程度加重[9]。膽脂瘤角化細(xì)胞具有與腫瘤相似的增殖和遷移特征[10]，在膽脂瘤上皮增殖的過程中，不僅可以了解到該病的發(fā)病機制，更能預(yù)測膽脂瘤可能的發(fā)展方向。眾多研究人員證實膽脂瘤標(biāo)本中腫瘤相關(guān)基因和增殖標(biāo)志物上調(diào)[11,12]。MMP是一組由內(nèi)皮細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞等分泌的鋅依賴性蛋白酶[13]，MMP9和MMP2是其非常重要的兩個亞型，在正常生理情況下MMPS表達水平極低，而在炎癥因子、生長因子、高糖和氧化應(yīng)激的情況等環(huán)境及病理條件下MMPS的表達顯著上調(diào)。活化的基質(zhì)金屬蛋白酶MMPS可以通過水解基底膜（BM）和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)，影響角質(zhì)上皮細(xì)胞的增殖、遷移和分化過程[14,15]。多項研究表明，在上皮源性腫瘤組織中，如肺癌、胃癌、乳腺癌、結(jié)腸癌及前列腺癌等惡性腫瘤等，均發(fā)現(xiàn)MMPS的高表達與腫瘤的轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良密切相關(guān)[16]。Olszewska發(fā)現(xiàn)MMP可以降低某些激素、生長因子、細(xì)胞因子和趨化因子[17]。Duellman發(fā)現(xiàn)SNP（單核多態(tài)性）能通過miRNA靶向基因的編碼區(qū)域特異性調(diào)控MMP9,使我們更全面的了解MMP多因素的作用[18]。本實驗中RT-PCR有助于分析MMP2和MMP9基因的表達，并建立分子活性與聽力損傷的相關(guān)性。一旦這種相關(guān)性得到證實，就有可能提出對中耳膽脂瘤的防控策略。盡管核酸分析技術(shù)發(fā)展迅速，但在特定文獻中僅有極少論文使用RT-PCR來研究MMPs的基因表達及其抑制劑，可能是由于從膽脂瘤標(biāo)本中提取RNA的技術(shù)困難。采用本實驗技術(shù)的方法提取膽脂瘤的RNA[19]，提取出的RNA的OD比值在1.8~2.0之間，濃度在500~2000ng/ul。RT-PCR結(jié)果顯示，在中耳膽脂瘤中MMP2,MMP9的mRNA的表達量是上調(diào)的，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。由于膽脂瘤體積限制，在本實驗中采取了改良的提取蛋白的方法[20]，使用提取完RNA的蛋白層，加入乙醇、異丙醇、鹽酸胍、SDS按照相應(yīng)的時間和離心條件提取蛋白，western blot條帶進行Gel-Pro Analyzer灰度值分析，結(jié)果顯示MMP2,MMP9在中耳膽脂瘤中的蛋白表達明顯高于外耳道正常皮膚，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

目前膽脂瘤尚無藥物治療，標(biāo)準(zhǔn)治療方法是手術(shù)切除[21]，MMPs過表達與多種致瘤事件(包括早期癌變、腫瘤生長、腫瘤侵襲、血管生成和轉(zhuǎn)移)之間的強因果關(guān)系使其成為具有吸引力的治療靶點。因此，一些廣泛的抑制劑(MMPI)進入晚期癌癥患者的III期臨床試驗[22]。MMP9單克隆抗體GS-5745可使約45%的重度潰瘍性結(jié)腸炎患者獲益，結(jié)腸炎癥得到控制[23]；氯霉素可選擇性抑制MMP2,膠質(zhì)細(xì)胞瘤高表達MMP2,因此其可能用于膠質(zhì)細(xì)胞瘤的治療[24]。MMPS表達水平調(diào)控包括基因水平和酶原活化，因此，開發(fā)同時具有抑制MMPS基因表達和抑制MMPS酶活性的靶向藥物可能成為新的MMPS研究方向，如聯(lián)合納米探針-MMPS的生物工程新方案可實現(xiàn)對部分腫瘤組織MMPS的特異性抑制[25]。

表2 MMP2和MMP9相對灰度值分析結(jié)果Table 2 Results of MMP2 and MMP9 relative gray value analysis

表3 MMP2和MMP9的mRNA相對表達量結(jié)果Table 3 Results of mRNArelative expression of MMP2 and MMP9

綜上所述，MMP2和MMP9在中耳膽脂瘤中高表達，可能與中耳膽脂瘤的發(fā)生、發(fā)展、骨破壞、聽力損傷等相關(guān)，為膽脂瘤發(fā)病機制提供了新的線索，并為治療膽脂瘤提供了潛在的治療靶點。