吳楷文 關靜 王秋菊

解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科解放軍耳鼻咽喉研究所（北京100853）

EYA4（eye absent 4）是eya家族蛋白的一員，于 1999年被克隆并定位在6q23.2[1]，作為轉錄激活因子參與機體內多種生物活動，對維持Corti器的發(fā)育成熟具有重要作用。EYA4的突變與常染色體顯性遺傳性耳聾（Autosomal Dominant Non-syndrome Hearing Loss,ADNSHL）、擴張型心肌?。―ilated cardiomyopathy，DCM）及多種惡性腫瘤的發(fā)病相關[2]，其中EYA4突變導致的ADNSHL定位于DFNA10基因座，在世界范圍內被報道，其臨床特點表現(xiàn)為雙側對稱、遲發(fā)性、漸進性加重的感音神經性耳聾，可能與單倍體劑量不足導致的失能效應相關。本文旨在將EYA4突變導致的DFNA10型遺傳性耳聾的研究進展進行綜述，繪制致病突變圖譜，分析臨床表型與基因型的關聯(lián)及可能的致聾機制。

1 EYA4的克隆、定位與表達

1996年，O’Neill等對一個美國的ADNSHL家系進行了連鎖分析，發(fā)現(xiàn)了一個新的耳聾基因座DFNA10，并將其定位在6q22-23一段15cM的范圍內，標記D6S474-D6S270之間[3]，隨后通過擴大家系驗證逐漸將范圍縮小至6cM，標記在D6S413-D6S292 之間[4]。1999年Borsani等對人類EYA4和小鼠Eya4進行了克隆與定位，并詳細描述其特點，EYA4在人類6號染色體恰位于DFNA10區(qū)域，小鼠Eya4位于10號染色體，兩者的核苷酸編碼區(qū)序列更88.9%同源，氨基酸序列同源性達到90.9%。由于不同剪切方式導致EYA4轉錄有多種亞型，含有19外顯子的亞型在發(fā)育中的內耳表達，含有20外顯子的亞型在成熟內耳表達[1]。2001年Wayne等通過單鏈構象多態(tài)性(Single-Strand Con?formation Polymor-phism，SSCP)的方法在2個之前報道的DFNA10家系中分析并發(fā)現(xiàn)EYA4的兩種致病突變，由此確定了EYA4即為DFNA10型耳聾的責任基因[5]。

Eya4在小鼠胚胎期聽囊表達，發(fā)育過程中，逐漸集中在血管紋及前庭膜表達，由蝸管上層轉移到蝸管底部神經上皮表達，出生后則在螺旋神經節(jié)邊緣、Corti器及骨蝸管表達[5]。eya4在斑馬魚受精24小時后胚胎的腹側聽囊表達，72小時集中在胚胎三處嵴突和兩處斑塊的感覺區(qū)域（內含支持細胞及毛細胞）表達eya4嗎啡啉突變體的斑馬魚胚胎表現(xiàn)為體積縮小、聽泡發(fā)育畸形、毛細胞形態(tài)發(fā)育異常且數(shù)量較野生型減少、聽覺功能異常[6]。EYA4在非人類的靈長類動物---狨猴的內耳主要表達在內、外毛細胞，支持細胞和螺旋神經節(jié)細胞分布。EYA4在成年狨猴內耳所有支持細胞均有表達，而在嚙齒類動物出生后就不再于支持細胞表達[7]。

2 EYA4蛋白功能域及功能

EYA4位于6q23.2，含21個外顯子，從2號外顯子開始編碼，共640個氨基酸，含有2個結構功能域：eya可變區(qū)域（eya variable region,eyaVR)和eya同源區(qū)域（eya homologous region,eyaHR），兩個結構域各行使不同的功能。eyaVR位于N端，其氨基酸序列在不同物種間變化大，保守性差，內含一段相對保守的脯氨酸-絲氨酸-蘇氨酸（proline–serine–threonine,PST）豐富（34%–41%）的反式激活區(qū)域，行使轉錄激活功能和蘇氨酸磷酸酶活性作用。PST結構對于轉錄激活是必須的，其通過與SIX/SO（Sine oculis）、DAC/DACH（Dachshund）的協(xié)同作用行使轉錄激活功能，若結構域缺失將嚴重影響Eya蛋白的正常功能[8-12]。PST結構的蘇氨酸磷酸酶活性可通過激活特定信號通路保護機體免受細胞凋亡產生的有害物質，增強機體固有免疫[13]。

eyaHR位于C端，由271個氨基酸組成，在Eya蛋白家族及不同物種間均高度保守[2,14]。目前已知eyaHR有兩方面功能：一方面，它能夠與SIX/SO和DAC/DACH蛋白相互結合，eyaHR與SIX家族蛋白的相互作用形成共轉錄因子進入細胞核，SIX蛋白的同源異型結構域與DNA序列結合，Eya蛋白行使激活功能，Eya蛋白與DACH蛋白的相互作用需要CBP蛋白來介導[5,15]。另一方面，eyaHR同時具有酪氨酸磷酸酶活性，而且屬于真核動物中少見的鹵酸脫鹵酶，Eya蛋白通過天門冬氨酸作為親核體并且結合Mg2+來催化酪氨酸磷酸鹽的水解作用，參與多種生物化學反應，如協(xié)助癌細胞轉移[16]、促進乳腺癌細胞增值并抑制凋亡[17]，抑制酪氨酸磷酸酶活性可干擾血管生成[18]，此外酪氨酸磷酸化酶活性還具有調解DNA損傷修復的功能[19,20]。

3 EYA4突變與DFNA10型遺傳性耳聾

3.1 DFNA10型耳聾臨床表型特點

EYA4致病突變導致的DFNA10型耳聾在遺傳學方面具有遺傳穩(wěn)定性和重復性，目前在美國等十一個國家共報道19個DFNA10型耳聾家系[5,21-37]，不同家系的臨床表型既有相似性又有差異性，相似性表現(xiàn)在語后發(fā)病、遲發(fā)性、進行性加重、雙耳對稱的感音神經性聽力損失，部分家系可伴有耳鳴癥狀，但無前庭功能異常。差異主要表現(xiàn)在:（1）發(fā)病年齡變化差異大。瑞典家系中有患者4歲即發(fā)病[30]，而美國家系患者中最晚發(fā)病年齡為50歲[5]，來自中國的6個EYA4家系共60名患者平均發(fā)病年齡為30歲，個別發(fā)病早至8歲[28,31-33,36]；（2）發(fā)病初期聽力受損特點不同。幾乎所有DFNA10患者發(fā)病時都累及中頻聽力，同時部分家系高頻或低頻可受累，相當一部分家系發(fā)病初即全頻受累，因此發(fā)病初聽力曲線常見為U型，也可見下降型、平坦型曲線；（3）聽力損失的進展速度不同，比利時家系患者聽力下降平均1.08dB/年，55歲之前為輕度聽力損失，55歲之后為中-重度[38]；美國家系患者在聽閾不超過50dB時聽力下降約0.6dB/年[39]；6個中國DFNA10型家系耳聾患者聽力損失為1.3dB-3.9dB/年，在聽閾<55dBHL時，平均下降3.8dB/年，聽閾>56dBHL時，平均下降2.2dB/年，聽力損失在5年病程內為輕度，5-30年左右為中-重度，達30年后（平均達57歲）多進展為重度乃至極重度（圖1）[28,31-33,36,40]。所有的DF?NA10型耳聾患者的聽力損失最終將累及全部頻率，成為重度-極重度的平坦型聽力曲線。

Frykholm等對瑞典家系耳聾患者的PTA與性別、年齡、雙親來源等因素進行分析，發(fā)現(xiàn)男性患者在年輕時即進入中重度聽力損失，男性患者的后代耳聾的發(fā)病時間更早[30]。van Beelen對來自荷蘭的家系進行多年隨訪分析，發(fā)現(xiàn)不同頻率聽力損失進展不同，2kHz每年下降0.5dB，8kHz每年下降1.6dB，高頻進展較快，這與美國家系的特點相似[34]。Choi等在統(tǒng)計韓國中度聽力下降的ADNSHL家系中，發(fā)現(xiàn)EYA4突變導致的DFNA10耳聾所占的頻率為7.14%（1/14）[35]，結合另一項研究得出該數(shù)據為8.57%（3/35）[25,26]。Kim等在87名ADNSHL患者中檢測出2個EYA4致病突變[29]，因此在顯性遺傳性耳聾家系研究中，不能忽略EYA4的致病的可能。

EYA4突變還可引起綜合征型聽力損失，Sch?onberger等人報道了2個無血緣關系的美國家系，其患者同時出現(xiàn)遲發(fā)性漸進性聽力損失和DCM，20歲出現(xiàn)輕度聽力損失并逐漸變?yōu)橹囟?極重度，心臟癥狀最早31歲出現(xiàn)，通過檢查示心臟擴張，NYHA評估心力衰竭為I級-II級，隨年齡逐漸加重，40多歲演變?yōu)镈CM，50-60歲病情加重乃至死亡，必須行心臟移植手術，這是報道的唯一的EYA4突變導致的綜合征型聽力損失[21]。

圖1 中國DFNA10耳聾患者PTA與病程的分布特點Fig.1 Analysis of pure-tone thresholds and disease course of DFNA10 patients in China共統(tǒng)計60名患者，男性38名，女性22名，輕度聽力損失15人，中度-重度聽力損失38人，極重度聽力損失7人。病程5年內聽力損失多為輕度，5-30年為中-重度度，>30年多為重度-極重度A total of 60 patients were involved in this study,including 38 males and 22 females,15 patients with mild hearing loss,38 with moderate to severe hearing loss,and 7 with profound hearing loss.Most DFNA10 patients show mild hearing loss within 5 years of onset,moderate to severe within 5 to 30 years,and severe to extremely severe within 30 years.

3.2 臨床表型與基因型關聯(lián)分析

截止目前共報道EYA4的18種突變會導致DF?NA10型耳聾，包括4種無義突變，7種插入（缺失/重復）突變，2種剪切突變，1種大片段缺失突變（Copy number variation，CNV）和4種錯義突變（圖2）。前四種突變均導致氨基酸翻譯提前終止而形成截短蛋白，嚴重影響EYA4蛋白的功能。采用ACMG指南標準對4種錯義突變進行致病性分析，p.G171R、p.I434K、p.T548R突變均為“可能致病的”[28,31,33,40]，而p.F326L為“意義不明確的”，其致病性有待進一步明確[41]。

EYA4突變導致的DFNA10型耳聾具有高度異質性，表現(xiàn)在相同或相似的突變可引起不同的臨床表型，而相似的臨床表型可由不同的突變導致。例如在荷蘭家系（致病突變?yōu)閏.464delC）中，發(fā)病初期V-8，V-7，IV-13僅中頻輕度受累，而IV-24/25累及中低頻，呈中度聽力損失；IV-24/25全部頻率均隨年齡顯著下降，III-3/7/14、V-8患者在個別頻率下降，III-5/13/16在10年中無明顯下降[34]。同樣在中國家系（致病突變?yōu)閏.544-545in?sA）中，兩不同分支臨床特點不同，II-1分支高頻受影響呈下降型曲線，II-6分支全頻受累呈平坦型曲線[32]。相同或相似的突變導致的不同臨床表型，可能與環(huán)境因素、個體因素或其他基因修飾有關。相反的，中國家系（致病突變?yōu)閏.1301T>A）與比利時家系（致病突變?yōu)閏.1759C>T）相比，突變不同但臨床表型相似，發(fā)病年齡最早在1-10歲，最晚在40歲之前，首先中頻聽力受損，為“Cook?ie-bite”樣聽力曲線，病程進展緩慢，約1dB/年，最終聽力轉歸為平坦型曲線[5,28]。

所有的截短突變都影響了eyaHR區(qū)域，故一般認為該區(qū)域的完整性對于維持聽覺功能很重要，但隨著越來越多錯義突變的報道，發(fā)現(xiàn)僅影響eyaVR區(qū)域的突變也會引起DFNA10型耳聾，如c.511G>C突變引起單個氨基酸替換，影響eyaVR而與eyaHR無關聯(lián)，說明eyaVR區(qū)域的特殊突變亦影響了聽覺功能[31]。c.863C>A(p.S288X)在韓國家系多次報道，是始祖效應突變，在其他不同人群和地區(qū)其始祖效應仍需有待驗證[25,29]。

EYA4的CNV為涵蓋9號外顯子、內含子和10號外顯子的2238 bp的大片段缺失，導致194位氨基酸處往后移碼30個氨基酸，在222位置氨基酸翻譯終止（p.D194Gfs*30），該突變導致漸進性聽力損失和DCM，Schonberger等人認為EYA4蛋白的193-343區(qū)域可能在維持心臟功能中發(fā)揮關鍵作用。2009年報道一名波蘭患者的6q23.2-6q24.1之間出現(xiàn)7.7-9.4Mb的片段缺失，波及到EYA4的大部分區(qū)域，只剩3個外顯子，導致臨床表現(xiàn)為小頭畸形、身材矮小、動脈導管未閉，感音神經性耳聾、精神發(fā)育遲滯、行為異常等，從一定意義上支持了EYA4特定區(qū)域的變異會影響心臟和內耳功能的觀點[42]。eya4嗎啡突變體斑馬魚表現(xiàn)為心腔擴張，肌纖維發(fā)育不良，30%左右胚胎圍心腔出血心肌射血功能減弱，肌纖維分化不明顯，說明了eya4的下調影響心臟發(fā)育及功能[6]。但隨著臨床上更多的研究發(fā)現(xiàn)影響EYA4蛋白的193-343區(qū)域的缺失突變，如p.D194Yfs*52、p.S288X，甚至更嚴重的截短突變如p.P155Qfs*43，都僅僅引起單純的DFNA10型耳聾，無任何DCM癥狀及猝死的發(fā)生[25,29,30，34]。EYA4突變導致合并DCM的綜合征型耳聾的機制仍需進一步探索。

圖2 與DFNA10型耳聾相關的EYA4突變位點使用EYA4最長轉錄本（NM_004100.4）對以前報道的突變進行了重新分析。eyaVR代表可變區(qū)域，eyaHR代表同源區(qū)域，黑色表示插入/缺失/重復突變，綠色表示無義突變，藍色表示剪切突變，橙色表示CNV，紅色表示錯義突變。Fig.2 Mutations of EYA4 associated with DFNA10 deafness The previously reported mutations were reanalyzed using the longest mRNA transcript of EYA4,NM_004100.4.EyaVR:variable region,eyaHR:homologous region,black:insertion/deletion/duplication mutation,green:nonsense mutation,blue:shear mutation,orange:CNV,red:missense mutation.

4 EYA4致聾的機制的探討

基因突變可通過獲能效應（gain of function）或失能效應（loss of function）導致ADNSHL，EYA4突變致聾是由于單倍體劑量不足導致的失能效應引起的。Zhang等利用小鼠Eya4HRR564X構建體進行了體外細胞實驗，小鼠Eya4的突變R564X與人類的R587X是同源突變，Eya4HRR564X構建體轉染到細胞內未能檢測到相應截短蛋白的表達，且無法與Six1蛋白相結合，同樣Eya4HR的其他不同類型截短構建體也在轉染細胞內得到相同的結果，因此認為突變的EYA4蛋白因降解而單倍體劑量不足導致耳聾的發(fā)生[43]。EYA4致病還可能與內耳感覺細胞的Na+/K+-ATP酶功能異常有關，Wang等研究發(fā)現(xiàn)Na+/K+-ATP酶的亞單位atp1b2b在斑馬魚體內與eya4共表達具有時空一致性，eya4嗎啡突變體斑馬魚內耳atp1b2b表達量下降，atp1b2b嗎啡突變體與eya4突變體的表型相似，都出現(xiàn)毛細胞數(shù)量減少，半規(guī)管嵴發(fā)育不良及感覺運動異常，atp1b2b可挽回eya4突變體的聽覺功能及結構異常。綜上說明Na+/K+-ATP酶在斑馬魚發(fā)育過程中聽覺功能上受eya4調節(jié)，eya4突變引起atp1b2b異常致耳聾發(fā)生，此研究在分子水平上為EYA4基因突變致耳聾發(fā)病的機制提供了一定可供參考的理論依據[6]。

利用小鼠模型探索人類遺傳性耳聾的致病機制是一種常用的有效手段，但是Eya4敲除（Eya4-/-）的小鼠病變特點與DFNA10型耳聾不一致，Eya4-/-小鼠咽鼓管骨部變細、鼓口異位、纖毛數(shù)量減少，咽鼓管通氣及排出功能異常導致分泌性中耳炎，同時伴有中耳畸形及嚴重的先天性聽力損失，這與DF?NA10型耳聾遲發(fā)、漸進性的感音神經聽力損失差別較大，在一些家系中兒童患者的分泌性中耳炎的發(fā)病或可借小鼠模型得以解釋[44]。

5 EYA4致聾的臨床遺傳咨詢

針對EYA4的致病突變進行遺傳咨詢可以幫助患者明確耳聾的病因，預估發(fā)病年齡、聽力下降趨勢及嚴重程度，預測耳聾的遺傳規(guī)律及后代發(fā)病的風險。應注意由于遲發(fā)性發(fā)病的特點，新生兒聽力篩查可能會通過，但要對EYA4突變者進行聽力隨訪，及時發(fā)現(xiàn)聽力下降并進行干預；對EYA4突變的患者應進行心臟相關病史詢問、體檢及檢查，排除DCM的可能性；產前診斷和胚胎移植前遺傳學診斷（preimplantation genetic diagnosis，PGD）是有效阻斷EYA4垂直傳遞給下一代的方法，應在與患者充分溝通、合作的基礎上，嚴格按照相關流程及規(guī)范完成[45]臨床上在為EYA4患者提供合理指導建議的同時，還要兼顧疏導由基因檢測結果產生的患者家庭的心理問題[46]。

6 小結和展望

EYA4突變引起的DFNA10型遺傳性耳聾，臨床表現(xiàn)可概括為遲發(fā)性的、影響中頻聽力的、進行性加重的感音神經性聽力損失，但是表現(xiàn)度差異較大，目前報道的突變種類及家系數(shù)量較少，臨床表型與基因型聯(lián)系未發(fā)現(xiàn)明顯的規(guī)律性。EYA4突變在韓國ADNSHL人群中所占比例較高，在中國人群報道的亦較多，但是中國人群發(fā)病比例尚待進一步統(tǒng)計研究，在中頻受累的顯性遺傳性耳聾中，要考慮到EYA4致病的可能性。EYA4突變對心臟功能的影響存在較多疑惑，何種突變會影響心臟功能？突變是如何影響心臟發(fā)育和心臟功能的？是否存在其他基因修飾或起到更為主導的作用？更多臨床表型的發(fā)現(xiàn)及基礎的實驗探索將會解答這些疑惑。EYA4致聾的機制與失能效應有關，可能通過調節(jié)內耳毛細胞Na+/K+-ATP酶影響聽覺功能，構建合適的動物模型進行體內實驗探究EYA4的致聾機制并探索可能的治療方式如特定的藥物治療、基因治療等是未來研究的重點，可利用CRISPR/Cas9技術精確編輯EYA4突變的哺乳動物模型進行相關研究。