羅濤，柴娟，經(jīng)屏

單純皰疹病毒腦炎（herpes simplex virus encephalitis，HSE）是 由單 純 皰疹 病 毒（herpes simplex virus，HSV）引起的腦部炎癥，是非流行性腦炎中最常見的類型。HSV是嗜神經(jīng)的DNA病毒，分為1、2兩個抗原亞型，近90%的HSE是由HSV-1引起。除病毒直接損傷神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞外，病毒導(dǎo)致的免疫炎性反應(yīng)也有關(guān)鍵作用。研究認為固有免疫與適應(yīng)性免疫應(yīng)答在機體抗病毒感染過程中發(fā)揮了重要作用[1]。

證據(jù)表明 Toll樣受體（(Toll-like receptors，TLRs）介導(dǎo)的免疫反應(yīng)在機體抗病毒感染過程中發(fā)揮重要作用[2]。HSV感染過程中大量促炎細胞因子的釋放是導(dǎo)致HSE腦損傷的主要原因。TLRs可能參與或介導(dǎo)了小膠質(zhì)細胞對HSV-1病毒的識別、對HSV-1感染的固有免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)過程。本研究將通過HSV-1感染小膠質(zhì)細胞系BV2建立HSE的細胞模型，觀察干預(yù)前后細胞TLRsmRNA的轉(zhuǎn)錄水平。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料

BV2細胞購于北京協(xié)和醫(yī)院；HSV-1病毒由武漢協(xié)和醫(yī)院病毒室提供；高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰酶（含EDTA）購自Hyclone公司，噻唑藍、二甲基亞砜購自美國Sigma公司；Total RNA提取試劑（RNAiso Plus）、5×PrimeScript?RT Master Mix逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR?Premix Ex TaqTM II（Perfect Real Time）購于日本TAKARA公司。

1.2 方法

1.2.1 BV2細胞上HSV-1病毒滴度測定 BV2細胞以1×104的密度接種于96孔板，培養(yǎng)至單層生長，吸去培養(yǎng)液，接種連續(xù)10倍系列稀釋的病毒維持液（5%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基+稀釋病毒），感染病毒孔加入含100μL病毒液的維持液，對照孔加入100μL維持液，每組5個復(fù)孔。細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每天觀察并記錄出現(xiàn)細胞病變的孔數(shù)。細胞病變效應(yīng)（cytopathic effect，CPE）劃分標準：25%細胞病變（+）；25%～50%細胞病變（++）；50%～75%細胞病變（+++）；75%～100%細胞病變（++++）。當細胞病變不再發(fā)展時，采用Reed-Muench法計算50%組織細胞感染量（tissue culture infective dose 50，TCID50）。LgTCID50=距離比例×稀釋度對數(shù)之間的差+高于50%病變率的稀釋度的對數(shù)，距離比例=(高于50%病變率的百分數(shù)－50%)/(高于50%病變率的百分數(shù)－低于50%病變率的百分數(shù))。

1.2.2 分組及處理 將BV2細胞以1×105的密度接種于6孔板內(nèi)，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，細胞生長達60%時，隨機分為對照組和HSV-1感染組。感染組予HSV-1病毒液（100TCID50），病毒作用6 h后更換培養(yǎng)基，各組繼續(xù)培養(yǎng)24 h后觀察細胞形態(tài)并收集細胞進行實驗相關(guān)數(shù)據(jù)的測定。

1.2.3 各組TLR2、TLR3、TLR9轉(zhuǎn)錄水平檢測

RNA制備試劑盒提取組織總RNA，采用TAKARA逆轉(zhuǎn)錄及實時熒光定量試劑盒檢測各組TLR2、TLR3和TLR9 mRNA轉(zhuǎn)錄水平，以三磷酸甘油醛脫氫酶（GADPH）為內(nèi)參對照。反應(yīng)條件：95℃變性4 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72℃延伸5 min。每樣本設(shè)置3個復(fù)孔，StepOne Software 2.1軟件（Applied Biosystems公司）分析PCR過程各檢測樣本的Ct（Threshold cycle）值，Ct值代表熒光實時定量PCR的結(jié)果，ΔCT=CT(目的基因)-CT(內(nèi)參基因)，ΔΔCT=ΔCT(感染組)-ΔCT(對照組)。根據(jù)公式計算相對表達量=2-ΔΔCT。采用Primer 5.0軟件設(shè)計引物，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17.0軟件處理數(shù)據(jù)。符合正態(tài)分布以及方差齊性的計量資料以（x±s）表示，組間比較采用獨立樣本均數(shù)t檢驗；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HSV-1病毒對BV2細胞滴度測定

HSV-1感染BV2細胞后，CPE表現(xiàn)為細胞折光性增強，突起增多，胞質(zhì)內(nèi)可見空泡，細胞間距增大。本研究將對數(shù)滴度的HSV-1感染BV2后，記錄48 h內(nèi)細胞形態(tài)學(xué)變化，TCID50=10-4.8/0.1mL，見表1。

表1 對數(shù)滴度的HSV-1感染BV2細胞48 h后CPE變化

2.2 HSV-1感染后BV2細胞TLR2、TLR3、TLR9轉(zhuǎn)錄水平變化

HSV-1感染組TLR2、TLR3、TLR9 mRNA轉(zhuǎn)錄水平均明顯高于對照組（P＜0.01），見圖2。

3 討論

HSE是臨床上多發(fā)的神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病，HSV-1是引起非流行致命病毒腦炎的最常見原因[3]。目前認為HSE的發(fā)生可能與病毒復(fù)制的直接作用有關(guān)，還與病毒感染機體后誘導(dǎo)機體的免疫反應(yīng)有關(guān)[4]。HSV-1侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng)后小膠質(zhì)細胞立即被激活，激發(fā)機體固有免疫系統(tǒng)，誘導(dǎo)復(fù)雜的免疫應(yīng)答過程，釋放一系列炎癥介質(zhì)。TLRs是一類可激活人體固有免疫應(yīng)答并在感染早期發(fā)揮保護性作用的重要膜受體家族[5]，小膠質(zhì)細胞自身有多種TLRs位于細胞膜或胞漿內(nèi)。病毒的核酸或包膜，作為一種病原體相關(guān)分子模式，可以被TLRs識別結(jié)合，啟動機體的先天免疫反應(yīng)和炎性反應(yīng)[6]。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)11種人類TLRs和13種小鼠TLRs。TLRs主要特征為胞外區(qū)有富含亮氨酸的重復(fù)序列（leucine rich repeat，LRR）以及胞內(nèi)區(qū)有與白介素-I型受體同源的Toll/白介素-1受體（Toll/interleukin-1 receptor，TIR）結(jié)構(gòu)域。LRR與識別病原體特異結(jié)構(gòu)有關(guān)，TIR是TLRs下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要原件。一旦它們與HSV-1蛋白或病毒核酸這樣的病原體結(jié)合，機體的先天免疫反應(yīng)被激活，核因子Kappa B（nuclear factor-kappa B，NF-κB）、c-Jun氨基端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）和p38蛋白激酶相繼被激活，從而引起趨化因子、促炎細胞因子的產(chǎn)生[8]。

研究表明，有多種TLRs參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染引起的免疫反應(yīng)。肺炎鏈球菌腦膜炎中發(fā)現(xiàn)TLR2、TLR4和TLR9 mRNA轉(zhuǎn)錄水平增加，大腸埃希菌腦膜炎中TLR2、TLR4和TLR7 mRNA轉(zhuǎn)錄水平增加[8]。人類TLR3、TLR4、TLR7、TLR8和TLR9及鼠TLR3、TLR4、TLR7和TLR9能觸發(fā)I型干擾素的合成和釋放，在抗病毒免疫中起關(guān)鍵作用[9]。還有研究發(fā)現(xiàn)干擾素-α/β受體缺陷時，感染HSV-2的缺陷小鼠較野生鼠生殖道病毒復(fù)制和疾病進展顯著加快，當給予TLR3、TLR7和TLR9的激活劑（合成的雙鏈RNA，咪喹莫特和寡核苷酸）后，缺陷小鼠的病毒復(fù)制，疾病進展和死亡率無明顯改善，而感染HSV-2的野生鼠卻有明顯改善，結(jié)果表明對抗HSV的干擾素的產(chǎn)生是由TLR3、TLR7和TLR9介導(dǎo)的[10]。

本研究發(fā)現(xiàn)在HSV-1感染小膠質(zhì)細胞后，感染組TLR2、TLR3及TLR9 mRNA轉(zhuǎn)錄水平較對照組明顯增加，說明TLR2、TLR3和TLR9可能參與了小膠質(zhì)細胞對HSV-1病毒的識別。研究結(jié)果表明Toll樣受體參與了HSE的發(fā)病，尤其是TLR2、TLR3和TLR9介導(dǎo)了機體對HSV-1感染的先天免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)過程。小膠質(zhì)細胞受HSV-1病毒感染后，可能通過TLR2、TLR3和TLR9激活先天免疫反應(yīng)，釋放一些細胞因子參與病毒感染后的病理生理過程。但TLRs在病毒感染后所起的作用仍有爭議，有報道TLR2激活后產(chǎn)生的過度炎性反應(yīng)對HSE是有害的[4]，另有報道TLR2可協(xié)同TLR9對HSE產(chǎn)生保護作用[11,12]。因此，TLRs在HSE發(fā)病過程中作用和機制仍需進一步研究。