王麗，呂紀(jì)華，劉瑛，饒偉源，鄧聿胤，覃良

(廣西壯族自治區(qū)中醫(yī)藥研究院，廣西中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530022)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種慢性系統(tǒng)性自身免疫疾病[1]，以關(guān)節(jié)和關(guān)節(jié)周圍組織的非感染炎癥為主要病變，好發(fā)于中年女性[2]，其機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，其中T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫異常在疾病進(jìn)展過程中至關(guān)重要。透骨香為夾竹桃科植物筋藤(AlyxialevineiMerr.)的干燥根和莖[3]，是廣西民間常用壯藥，具有祛風(fēng)除濕，消腫止痛的功效，用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎之關(guān)節(jié)疼痛，療效甚佳，但其藥物活性及作用機(jī)制研究未見任何報(bào)道。本研究采用T淋巴細(xì)胞體外增殖實(shí)驗(yàn)對(duì)透骨香抗RA作用的活性部位進(jìn)行篩選，并初步探討其作用機(jī)制，為透骨香治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 BALB/c小鼠，雄性，體重14～16 g，SPF級(jí)，購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(粵)2013-0002。

1.2 藥物 透骨香藥材采自廣西玉林市，經(jīng)本研究院饒偉源主任藥師鑒定為夾竹桃科植物筋藤(AlyxialevineiMerr.)后使用。透骨香藥材8 kg采用60%乙醇加熱回流提取，提取液回收乙醇后，藥液分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇進(jìn)行梯度提取分離，得到正丁醇部位25.1 g(提取率0.31%)、乙酸乙酯部位5.39 g(提取率0.07%)、石油醚部位0.40 g(提取率0.005%)和水溶部位364.3 g(提取率4.55%)共4 個(gè)部分，石油醚、乙酸乙酯及正丁醇部位用二甲基亞砜(DMSO)溶解成10 mg·mL-1儲(chǔ)備液，水溶部位用RPMI-1640培養(yǎng)基溶解成10 mg·mL-1儲(chǔ)備液，過濾除菌，實(shí)驗(yàn)時(shí)分別以RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋使用。

1.3 主要試劑 RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清(Hyclone公司)；小鼠脾臟淋巴細(xì)胞分離液試劑盒、青鏈霉素混合液(Solarbio公司)；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8[CCK-8,東仁化學(xué)科技(上海)有限公司]；酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)試劑盒(天津安諾瑞康生物技術(shù)有限公司)；刀豆蛋白A(CoA，Sigma公司)，實(shí)驗(yàn)時(shí)以RPMI-1640培養(yǎng)基配制成所需濃度。

1.4 主要儀器 H1850臺(tái)式高速離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司)；Multiskan Go全波長全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀(Thermo Fisher Scientific公司)；MCO-18AIC二氧化碳培養(yǎng)箱(Panasonic 公司)。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 脾淋巴細(xì)胞的制備 取8只BALB/c小鼠，處死后用75%乙醇溶液浸泡10 min，生物安全柜內(nèi)無菌條件下摘取脾臟，撕去脾臟包膜，用眼科剪剪成小塊放置200目細(xì)胞篩網(wǎng)上，細(xì)胞篩網(wǎng)置于平皿(加入少量全血及組織稀釋液)中，使用注射器活塞研磨脾臟，研磨完全后使用全血及組織稀釋液沖洗篩網(wǎng)，收集細(xì)胞懸液后再經(jīng)濾網(wǎng)過濾，獲得脾臟單細(xì)胞懸液。取離心管，小心吸取單細(xì)胞懸液加于等量分離液液面上，保持兩液面界面清晰，室溫下，800 g離心20 min，離心后吸取第二層環(huán)狀乳白色淋巴細(xì)胞至離心管中，加入細(xì)胞洗滌液洗滌白膜層細(xì)胞，250 g離心10 min，棄上清，5 mL細(xì)胞清洗液洗滌細(xì)胞2次(250 g離心10 min)，用RPMI-1640完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清，青鏈霉素100 U·mL-1)重懸細(xì)胞，制備成脾淋巴細(xì)胞懸液。

1.5.2 透骨香各部位對(duì)CoA刺激的T淋巴細(xì)胞增殖的影響 將脾淋巴細(xì)胞懸液調(diào)整為細(xì)胞密度1.0×106/mL，接種于96孔板中，每孔100 μL細(xì)胞懸液，實(shí)驗(yàn)分組處理如下：各部位藥物組：每孔加入 50 μL CoA(終濃度為5 μg·mL-1)+50 μL藥物(終濃度分別為5、2.5、1 μg·mL-1)；CoA組：每孔加入50 μL CoA(終濃度為5 μg·mL-1)+50 μL RPMI-1640培養(yǎng)基；陰性對(duì)照組：每孔加入100 μL RPMI-1640培養(yǎng)基；溶劑對(duì)照組：每孔加入50 μL CoA(終濃度為5 μg·mL-1)+50 μL DMSO溶液(終體積分?jǐn)?shù)0.05%)。每組均設(shè)4個(gè)復(fù)孔。將96孔板置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，酶標(biāo)儀450 nm檢測(cè)光密度(OD)值，計(jì)算淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)(SI)。SI=實(shí)驗(yàn)組OD/陰性對(duì)照組OD。

1.5.3 透骨香水溶部位對(duì)細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-2(IL-2)、白細(xì)胞介素-10(IL-10)的影響 將脾淋巴細(xì)胞懸液調(diào)整為細(xì)胞密度1.0×106/mL，接種于96孔板中，每孔100 μL細(xì)胞懸液，實(shí)驗(yàn)分組處理如下：透骨香水溶部位組：每孔加入50 μL CoA(終濃度為5 μg·mL-1)+50 μL藥物(終濃度分別為5、2.5、1、0.5 μg·mL-1)；CoA組：每孔加入50 mL CoA(終濃度為5 μg·mL-1)+50 μL RPMI-1640培養(yǎng)基；陰性對(duì)照組：每孔加入100 μL RPMI-1640培養(yǎng)基。每組均設(shè)6個(gè)復(fù)孔，37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞上清液，嚴(yán)格按照試劑盒要求采用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞因子IL-2、IL-10的含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，多組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 透骨香各部位對(duì)CoA刺激的脾淋巴細(xì)胞增殖的影響 與陰性對(duì)照組比較，CoA組OD值顯著升高(P<0.05)，刺激指數(shù)明顯升高，提示CoA刺激脾淋巴細(xì)胞增殖作用顯著；與CoA組比較，透骨香正丁醇部位(2.5 μg·mL-1)及水溶部位(5、2.5、1 μg·mL-1)組OD值顯著降低(P<0.05)，刺激指數(shù)明顯降低，其中水溶部位(5 μg·mL-1)作用最強(qiáng)，其余部位組及DMSO溶劑對(duì)照組均無明顯差異(P>0.05)，提示透骨香水溶部位具有較強(qiáng)抑制脾淋巴細(xì)胞增殖的作用，結(jié)果見圖1、表1。

圖1 透骨香各部位對(duì)CoA刺激的脾淋巴細(xì)胞增殖的影響

組別劑量/μg·mL-1刺激指數(shù)陰性對(duì)照組-1CoA組-1.43151.428CoA+正丁醇部位2.51.30411.44351.465CoA+乙酸乙酯部位2.51.47011.41850.624CoA+水溶部位2.50.99211.358CoA+石油醚部位51.4072.51.40511.401

2.2 透骨香水溶部位對(duì)細(xì)胞因子的影響 與陰性對(duì)照組比較，CoA組IL-2、IL-10含量均顯著升高(P<0.05)，提示CoA刺激脾淋巴細(xì)胞增殖后細(xì)胞因子分泌顯著增強(qiáng)；與CoA組比較，透骨香水溶部位組(5、2.5、1 μg·mL-1)IL-2含量顯著降低(P<0.05)，IL-10含量顯著升高(P<0.05)，提示透骨香水溶部位對(duì)CoA刺激小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子IL-2具有抑制作用，對(duì)細(xì)胞因子IL-10具有促進(jìn)作用，結(jié)果見圖2～3。

圖2 透骨香水溶部位對(duì)CoA刺激的脾淋巴細(xì)胞分泌IL-2含量的影響

圖3 透骨香水溶部位對(duì)CoA刺激的脾淋巴細(xì)胞分泌IL-10含量的影響

3 討論

壯醫(yī)藥是我國中醫(yī)藥和民族傳統(tǒng)醫(yī)藥的重要組成部分，RA屬于中醫(yī)“痹證”范疇、壯醫(yī)的“發(fā)旺”范疇。壯醫(yī)認(rèn)為，病人多處潮濕之地，濕阻脈絡(luò)，繼而入骨，病久正氣虛衰，氣血不足，肝腎虛虧，氣滯血瘀，虛實(shí)夾雜，正氣損傷，濕滯黏膩，不易自散，故病情遷延難愈。治療當(dāng)以祛風(fēng)除濕，消腫止痛，益氣活血通絡(luò)[4-6]。壯藥透骨香為夾竹桃科植物筋藤(AlyxialevineiMerr.)的干燥根和莖，又名三托藤、九牛藤、坎香藤，主產(chǎn)于廣西和廣東，為廣西民間常用草藥，是民族藥“五松腫痛酊”中的原料藥材，具有祛風(fēng)除濕，消腫止痛，祛腐生肌之功效，用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎引起的風(fēng)濕痹痛、關(guān)節(jié)腫痛，效果甚佳。

RA是一種自身免疫性疾病，其中T淋巴細(xì)胞免疫功能異常是其發(fā)病的主要機(jī)制之一。研究證實(shí)，RA患者滑膜組織內(nèi)存在T淋巴細(xì)胞的異常增殖和活化， T淋巴細(xì)胞活化后可調(diào)控巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞、滑膜細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等功能，引起一系列免疫炎癥反應(yīng)，釋放大量細(xì)胞因子、抗體及酶類，浸潤滑膜組織，導(dǎo)致滑膜組織炎癥和增生從而引起關(guān)節(jié)損傷[7]。脾臟中含有大量的T淋巴細(xì)胞，絲裂原ConA能夠刺激T淋巴細(xì)胞活化增殖，促進(jìn)其分泌細(xì)胞因子及表達(dá)受體[8]，因此體外T淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蚰MRA免疫功能異常狀態(tài)進(jìn)行藥物篩選實(shí)驗(yàn)。本研究結(jié)果顯示，透骨香藥物4個(gè)部位中，正丁醇部位及水溶部位能夠明顯降低ConA誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)，其中水溶部位(5 μg·mL-1)作用最強(qiáng)，提示透骨香水溶部位具有較強(qiáng)抑制T淋巴細(xì)胞增殖作用。

RA患者發(fā)病過程中，體內(nèi)存在著T淋巴細(xì)胞亞群比例失衡，輔助性T細(xì)胞(Th)中Th1/Th2平衡紊亂，出現(xiàn)Th1極化和Th2分化阻礙[9]，引起細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)失調(diào)，滑膜細(xì)胞、淋巴細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生大量炎癥細(xì)胞因子，參與炎癥遷延和關(guān)節(jié)損傷，其中細(xì)胞因子IL-2和IL-10發(fā)揮重要作用。IL-2主要由Th1細(xì)胞分泌，又稱為T 細(xì)胞生長因子，可以與T 淋巴細(xì)胞表面的IL-2R結(jié)合激活T細(xì)胞，促進(jìn)T細(xì)胞的活化與增殖，具有免疫增強(qiáng)和免疫調(diào)節(jié)的作用，研究表明，活動(dòng)性RA患者血清中IL-2水平明顯升高[10-11]。IL-10主要由Th2細(xì)胞分泌，是一種負(fù)性免疫調(diào)節(jié)因子，可以通過降低單核細(xì)胞抗原提呈能力，阻止抗原特異性T細(xì)胞增殖，減少單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等產(chǎn)生促炎癥細(xì)胞因子和趨化因子，抑制炎癥反應(yīng)[12-13]。本研究結(jié)果顯示，透骨香水溶部位作用于ConA誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞后，細(xì)胞因子IL-2含量顯著降低，IL-10含量顯著升高，提示透骨香水溶部位能夠通過抑制T淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IL-2，促進(jìn)IL-10的生成，從而在RA中發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。

綜上所述，本研究對(duì)壯藥透骨香抗RA活性部位進(jìn)行了篩選研究，明確了透骨香水溶部位對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖具有較強(qiáng)抑制作用，是透骨香抗RA活性部位，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)細(xì)胞因子IL-2、IL-10分泌有關(guān)，為透骨香臨床用于治療RA提供了理論依據(jù)。但本研究僅限于藥物部位篩選，透骨香藥物化學(xué)成分及作用機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。