楊東升，李 靜，蘇 敏，李佳偉

（海南大學材料與化工學院生物工程系，海南海口570228）

眾所周之，啤酒的風味和香氣對決定其質(zhì)量至關(guān)重要，同時這些參數(shù)受到二氧化碳壓力的影響[1-2]。一般認為，影響風味化合物產(chǎn)生的最直接因素是溶解二氧化碳，其濃度取決于所施加的溫度和背壓。另一方面，隨著市場需求的增加，啤酒廠不斷增大啤酒生產(chǎn)的反應器尺寸。巨大的發(fā)酵罐自然產(chǎn)生更高的靜水壓力，通常會增加溶解在啤酒中的二氧化碳濃度。在許多生物體中，包括酵母菌，高二氧化碳分壓對其生長有抑制作用[3-4]。啤酒中所有風味活性成分都是由酵母產(chǎn)生的，這些化合物最終將決定啤酒的最終質(zhì)量[5]。高級醇、酯類、乙醛、二甲基硫醚（DMS）和二氧化硫等是啤酒風味的關(guān)鍵元素。

啤酒酵母產(chǎn)生的高級醇是啤酒中最豐富的感官成分。高級醇的形成與酵母代謝氨基酸有關(guān)。這些化合物的產(chǎn)生可以通過兩個途徑發(fā)生。第一是埃利希提出的分解代謝途徑[6]，第二是氨基酸合成途徑[7]。正丙醇、異丁醇和異戊醇是啤酒中最重要的高級醇。異戊醇的氣味閾值范圍為25 mg/L，正丙醇為50 mg/L[8]。即使某些高級醇或酯的實際濃度低于它們的閾值，但其存在對于整體風味分布也很重要[9]。啤酒中的高級醇既是風味活性化合物，又是與?；o酶A衍生物反應生成酯的底物。有眾多的因素影響高級醇的形成，其中有酵母菌種、發(fā)酵溫度、酵母接種量、麥汁組成、麥汁通氧等[10]。高級醇的形成不僅會隨著較低的接種溫度和發(fā)酵溫度而減少，也會隨著CO2壓力的作用而降低[7，11]。有研究表明，較高的溫度增加了發(fā)酵速率和高級醇的產(chǎn)率和最終濃度，而不依賴于施加的背壓。然而，高級醇的濃度取決于CO2濃度[1]。

揮發(fā)性酯類是啤酒中風味物質(zhì)的最大組分。酯類在啤酒中含量僅為痕量，但它們對風味譜極為重要。啤酒中的揮發(fā)性酯類可分為乙酸酯類和中鏈脂肪酸（MCFA）乙酯兩大類。乙酸酯是啤酒的主要風味成分，因為它們的濃度遠高于其他揮發(fā)性酯[5]。啤酒中最重要的酯類是乙酸乙酯、乙酸異戊酯、己酸乙酯、乙酸異丁酯和乙酸苯酯。乙酸乙酯的形成不受氮源影響，使其成為濃度最高的酯[12]。酯類氣味閾值較低，乙酸異戊酯為0.2 mg/L，乙酸乙酯為15～20 mg/L[13-14]。酯在酵母中通過乙醇或高級醇、?；o酶A（主要是乙酰輔酶A）和酯合成酶的生化途徑合成。方差分析證實，溶解CO2濃度對最大生長速率、最大和初始酯產(chǎn)率有顯著的負面影響，并且這種效應比溫度效應更明顯[1]。在正常的啤酒發(fā)酵中，發(fā)酵溫度越高，發(fā)酵副產(chǎn)物越多。一種補救辦法是采用CO2的發(fā)酵罐背壓。CO2壓力升高，導致高級醇和酯的濃度降低，而鄰位二酮和乙醛的含量增加[15]。最大的酵母生長速率和酯產(chǎn)率與超過2 g/L溶解CO2濃度呈顯著負相關(guān)[1]。研究表明，凡是有利于酵母旺盛發(fā)酵的工藝條件，都有利于酯類的形成[16]，相反，酯和高級醇的形成隨著二氧化碳壓力增大而減少，卻主要是由于酵母生長的減少。

然而，CO2對高級醇形成的影響比對酯形成的影響要小[3]。另一方面，酯類的產(chǎn)生與麥汁濃度有關(guān)，而高濃度麥汁中的酵母產(chǎn)生更多的乙酸酯類。這導致了啤酒風味的不平衡，是由產(chǎn)生的揮發(fā)性化合物的不成比例的水平引起的[17-18]。這也可稱之為醇酯比失衡，研究證明，通過發(fā)酵醇酯比的合理控制，可以有效地控制啤酒風味質(zhì)量的一致性和均一性[19]。

1 材料與方法

1.1 材料

原料：啤酒大麥、啤酒花購自濟南雙麥有限公司；啤酒酵母Saccharomyces cerevisiae NCYC 1108由海南大學生物綜合實驗室保存。

試劑：正丙醇、異丁醇、異戊醇、乙酸乙酯、乙酸異戊酯、己酸乙酯，GR，阿拉丁試劑（上海）有限公司。

儀器設備：頂空氣相色譜HP6890N，細胞計數(shù)板。

1.2 實驗方法

麥汁制備：分別取20 kg和25 kg大麥芽粉碎，入100 L糖化鍋，加水80 L，按45℃保溫15 min，52℃保溫20 min，63 ℃保溫30 min，72 ℃保溫20 min，再加熱至78℃進行浸出糖化。麥汁過濾液合并加水55 L，二次過濾液（洗糟）煮沸70 min，煮沸10 min時和煮沸40 min時各加50 g酒花。冷卻，分別制得8 °P麥汁和12 °P麥汁各100 L[20]。

發(fā)酵條件：每個實驗使用100 L的兩種濃度的麥芽汁（8°P和12°P），麥芽汁充氧直到接種前飽和。發(fā)酵罐的排氣閥在接種后關(guān)閉，以產(chǎn)生背壓。在整個發(fā)酵過程中，壓力傳感器控制背壓分別保持在0、0.05 MPa和0.15 MPa，發(fā)酵在10℃下進行。每20 h取樣品，測定細胞數(shù)、麥汁密度和溶解CO2、總高級醇含量和總酯濃度。共測量10 d。

酵母活化：啤酒酵母菌株經(jīng)復蘇、瓊脂平板劃線挑取單菌落、接入20 mL麥汁培養(yǎng)基,25℃培養(yǎng)2 d。酵母加入裝有經(jīng)滅菌的1.5 L 8°P麥汁的3 L錐形燒瓶中，用濾膜密封燒瓶，20℃軌道振蕩擴培3 d。接種前2 h發(fā)酵溫度降至10℃。

高級醇和酯的檢測：采用頂空氣相色譜HP6890N（FID檢測器）測定正丙醇、異丁醇、異戊醇、乙酸乙酯、乙酸異戊酯、己酸乙酯。采用毛細管HP-NIONAX柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm膜厚）和頂空采樣器HP7694E。實驗條件如下：注入溫度為225℃；柱溫程序，在40℃下保持3 min，然后以5℃/min升溫到90℃；檢測器溫度，300℃；載氣，氮氣；載氣流量，30 mL/min；氫氣流量，40 mL/min；空氣流量，400 mL/min；分流比，6∶1；樣品瓶平衡溫度50℃；平衡時間，30 min；循環(huán)溫度，60℃；傳輸線溫度，65℃。工作站軟件PG2070AA[21-22]。

使用細胞計數(shù)板測定細胞數(shù)；溶解的CO2使用電位滴定儀測定；麥芽汁濃度采用錘度法測定[20，23]。

2 結(jié)果與分析

2.1 CO2背壓對CO2濃度、酵母數(shù)量、總高級醇和酯的影響

發(fā)酵方法如1.2部分所述，CO2背壓對基本發(fā)酵特性的影響見圖1—圖8。結(jié)果表明，施加0.05 MPa和0.15 MPa的CO2背壓顯著減緩了酵母生長，降低了總高級醇的最終濃度和總酯生成，增大了溶解CO2的最終濃度。麥汁濃度并未明顯影響CO2的增長趨勢，這可能與CO2濃度達到飽和有關(guān)。主發(fā)酵前期，CO2壓抑制酵母生長，生成CO2數(shù)量較少，主發(fā)酵后期，在發(fā)酵溫度一致的情況下，CO2積累達到一定水平，壓力越大，濃度越高（圖1）。

圖1 CO2濃度變化圖

在本實驗中，通過增大背壓來減少酵母細胞生長。由圖2可見，在主發(fā)酵前期，細胞生長曲線只是依照背壓水平分組，麥汁濃度的影響不大。不僅最大細胞計數(shù)減少了45%，而且達到最大值的時間延長了40～60 h（圖2），同一酵母，較低發(fā)酵溫度或較高CO2背壓可以控制最大酵母數(shù)量。在實際生產(chǎn)中，采用背壓工藝時可以選擇性狀優(yōu)良的酵母作為生產(chǎn)菌株，以消除CO2對其生長代謝的影響。

圖2 酵母數(shù)量變化圖

研究表明，細胞數(shù)量的減少導致較低的醇和酯濃度降低[24]。類似地，隨著研究中細胞數(shù)量的減少，總醇含量和總酯含量下降。另一方面，總高級醇和總酯的最終水平不僅取決于CO2背壓，也取決于麥汁濃度。12°P麥汁中總高級醇和總酯含量高于8°P麥汁（圖1）。雖然目前8°P啤酒市場在美國市場占有率很高，但這種啤酒在歐洲市場仍然不被接受，因為淡啤酒被認為是清淡型的，主要是因為缺乏口感[25]。

圖3顯示，在無背壓情況下，8°P和12°P麥汁中總高級醇含量均在75 h時達到最高值。在0.05 MPa和0.15 MPa背壓情況下，8°P麥汁中總高級醇含量均在120 h達到最高值，分別約為無背壓最高值的50%和45%，12°P麥汁中總高級醇含量均在200 h達到最高值，分別約為無背壓最高值的70%和60%。由此可見，麥汁濃度控制高級醇的累加效應，CO2背壓控制總高級醇最終生成量，控制效果是非常明顯的。

圖3 總高級醇含量變化圖

主酵時常壓發(fā)酵，雙乙酰還原結(jié)束再升壓，乙醛含量較低，酯含量較高[26]。這是一種提高酯含量的工藝方案。而提早升壓，結(jié)果是相反的。

圖4顯示，在無背壓情況下，8°P和12°P麥汁中總酯含量均在100 h達到最高值。在0.05 MPa背壓情況下，8°P和12°P麥汁中總酯含量分別在160 h和180 h達到最高值，分別約為無背壓最高值的66%和70%，在0.15 MPa背壓情況下，8°P和12°P麥汁中總酯含量同時在200 h達到最高值，分別約為無背壓最高值的52%和50%，由此可見，麥汁濃度控制總酯的累加效應，CO2背壓控制總酯最終生成量，控制效果比高級醇更明顯。

圖4 總酯含量變化圖

圖1—圖4表明，CO2背壓對溶解CO2、酵母數(shù)量、總高級醇和總酯含量有非常明顯的影響。這一結(jié)果與前人的研究結(jié)果不同，該研究在發(fā)酵過程中采用16℃的溫度，筆者認為，背壓或CO2濃度對CO2生產(chǎn)、高級醇生產(chǎn)和相關(guān)底物同化僅產(chǎn)生輕微影響[1]，即使最大值是由溫度或背壓控制的，對應于最大產(chǎn)率的時間也依賴于溫度[1]。本實驗中應用了10℃的較低溫度，這可以部分解釋結(jié)果的差異，因為眾所周知，在較低的溫度下，在相同的背壓下，麥芽汁中會產(chǎn)生更多的溶解CO2。溶解CO2的增加，降低了最大生長速率、總高級醇產(chǎn)率和總酯產(chǎn)率[1]。

2.2 CO2背壓對CO2溶解速率、酵母生長速率、高級醇和酯生成速率的峰值延遲和削減作用

圖1—圖4表明，總高級醇和總酯含量的峰值被顯著增加的背壓延遲，而且背壓對延遲總酯形成的影響大于總高級醇。我們知道，總高級醇含量和總酯含量峰值與酵母細胞的生長被抑制相關(guān)[15]。因此，進一步研究風味代謝物的生成速率的變化規(guī)律十分必要。由CO2背壓引起的一系列生長代謝延遲及其關(guān)系見圖5—圖8。

如圖5所示，在未形成背壓的發(fā)酵系統(tǒng)中，CO2溶解速率只在60 h處出現(xiàn)一個峰值。此時就是啤酒發(fā)酵的高泡期，在敞口發(fā)酵系統(tǒng)中，溫度決定了高泡期出現(xiàn)和延續(xù)的時間。在背壓0.05 MPa的條件下，CO2溶解速率峰值明顯被延遲至80 h，在背壓0.15 MPa的條件下，CO2溶解速率峰值延遲至120 h。CO2溶解速率延遲意味著酵母細胞生長代謝受到抑制。在背壓0.05 MPa的條件下，CO2溶解速率峰值明顯高于無背壓發(fā)酵和0.15 MPa背壓發(fā)酵，是否與較低壓或適當CO2濃度對酵母的生長代謝有刺激作用有關(guān)。

圖5 CO2溶解速率變化圖

酵母生長速率對應0、0.05 MPa、0.15 MPa背壓分別在60 h、80 h、120 h出現(xiàn)峰值，與CO2溶解速率延遲時間高度一致。酵母生長伴生大量CO2，通過測量CO2的生成量可以衡量酵母發(fā)酵活性。無背壓發(fā)酵，酵母產(chǎn)生的大量CO2排出發(fā)酵系統(tǒng)，可以充分解除CO2的抑制作用，形成較大峰值（圖6）。CO2的延遲與抑制作用似乎與麥汁濃度無相關(guān)性，背壓越高，對峰值的削減越明顯。

高級醇是酵母主要代謝產(chǎn)物，同樣對應0、0.05 MPa、0.15 MPa背壓分別在60 h、80 h、120 h出現(xiàn)峰值，與CO2溶解速率和酵母生長速率延遲時間一致（圖7）。高級醇生成的峰值受到背壓影響延遲與削減同樣解釋了酵母生長受到抑制。無背壓系統(tǒng)中高級醇的生成量是最大的（圖3）。當然，麥汁濃度與高級醇生成量和生成速率正相關(guān)，高濃麥汁在發(fā)酵過程中會出現(xiàn)高濃度高級醇的現(xiàn)象，這種現(xiàn)象可能通過背壓調(diào)節(jié)進行調(diào)控。施以背壓后，總高級醇生成速率峰值明顯下降（圖7），意味著生成趨勢變緩。

圖6 酵母生長速率變化圖

圖7 總高級醇生成速率變化圖

酯類是酵母發(fā)酵另一類主要風味代謝產(chǎn)物，對應 0、0.05 MPa、0.15 MPa背壓分別在 80 h、120 h、200 h出現(xiàn)峰值，按無背壓發(fā)酵延遲計算，總酯生成速率正常延遲時間是20 h，施以背壓后，延遲作用大大加強。背壓越大，延遲越明顯，0.05 MPa延遲增加20 h，0.15 MPa延遲增加40 h。而且經(jīng)過延遲后，總酯生成速率峰值被削減。同高級醇一樣，麥汁濃度與酯類生成量和生成速率正相關(guān)，高濃麥汁在發(fā)酵過程中會出現(xiàn)高濃度酯類的現(xiàn)象[27]，這種現(xiàn)象可能通過背壓調(diào)節(jié)進行調(diào)控。施以背壓后，總酯生成速率峰值明顯下降（圖8），意味著生成趨勢變緩，最終使由于麥汁濃度引起的總酯含量差異變小。

圖8 總酯生成速率變化圖

2.3 CO2背壓對啤酒主發(fā)酵醇酯比的影響

表1表明，采用0.15 MPa的CO2背壓都降低了總的高級醇和總酯，而減少幅度取決于背壓大小和麥汁濃度。在12°P麥汁中，高級醇降幅為37%，而8°P麥汁中，高級醇降幅為42%。在12°P麥汁中總酯的降幅為49%，8°P麥汁中的總酯的降幅為47%（圖3、圖 4）。在0.15 MPa的 CO2背壓下，在12°P麥汁中醇酯比提高了26%，8°P麥汁中只有10%。8°P麥汁所有發(fā)酵樣品醇酯比與12°P麥汁的相比均具有顯著差異；8°P麥汁無背壓與加背壓發(fā)酵樣品的醇酯比無顯著差異；12°P麥汁無背壓與0.05 MPa背壓發(fā)酵樣品的醇酯比無顯著差異而與0.15 MPa背壓發(fā)酵樣品的醇酯比有顯著差異（P＜0.05）（表1）。即CO2背壓可以平衡風味，尤其是高濃度麥汁啤酒。然而，低濃度麥汁啤酒受到輕微影響。

在啤酒中酯類的產(chǎn)生完全是酵母生成。由脂肪酸生成?；o酶A，再以底物的形式與醇反應生成酯類，因此，發(fā)酵過程的各種因素對酯類的形成將產(chǎn)生綜合影響，如發(fā)酵罐內(nèi)的溫度、壓力、發(fā)酵罐之間的溫度均勻率等等[19]。高級醇也受多因素影響，CO2背壓是影響因素之一，也是一種有效的調(diào)控方式。

3 結(jié)論

3.1 CO2背壓促進CO2的溶解，與麥汁濃度無關(guān)，抑制和延遲酵母生長代謝，背壓越高，對酵母生長速率峰值的削減越明顯。

表1 CO2背壓對啤酒主發(fā)酵第10天醇酯比的影響

3.2 CO2背壓顯著延遲高級醇和酯類的生成，控制總高級醇和總酯最終生成量，使總高級醇和總酯生成速率峰值明顯下降，同時削弱了由麥汁濃度控制高級醇和酯類生成量的累加效應。

3.3 CO2背壓可以提高醇酯比，減輕高濃麥汁啤酒發(fā)酵酯味突出的問題，平衡高濃度麥汁啤酒風味，對低濃度麥汁啤酒影響較小。