配子體型自交不親和調(diào)控機(jī)制的研究進(jìn)展*

李富婷， 唐飛， 高冬麗， 段思凡， 李云海， 李燦輝， 馬玲

(云南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,馬鈴薯科學(xué)研究院，云南 昆明 650500)

自然界中，40%的開(kāi)花植物中存在自交不親和(self-incompatibility,SI)現(xiàn)象，涵蓋了至少100種植物種類[1].對(duì)多數(shù)雌雄同株的植物而言，同一朵花中的雌雄蕊相互靠近，因此自身花粉容易落在自身的柱頭上.如果沒(méi)有自交不親和的生殖隔離，易造成自體受精，不利于基因間的重組，造成物種基因型單一，影響植物應(yīng)對(duì)復(fù)雜的生存環(huán)境，因此一直以來(lái)自交親和連同自交衰退被普遍認(rèn)為是造成物種滅絕的重要原因[2-3].因此對(duì)物種而言，存在著維持自交不親和的進(jìn)化壓力，這也是顯花植物普遍自交不親和的原因[4].

多數(shù)具有自交不親和現(xiàn)象的物種中，其自交不親和過(guò)程受到高多態(tài)性S位點(diǎn)的調(diào)控[5-6].研究發(fā)現(xiàn)S位點(diǎn)內(nèi)的基因是以一個(gè)整體的形式向后代傳遞.S位點(diǎn)內(nèi)的基因之間幾乎不發(fā)生重組，作為一個(gè)遺傳單元，完全符合孟德?tīng)栠z傳規(guī)律，因此S位點(diǎn)又被稱為S單倍型(S haplotype).S位點(diǎn)內(nèi)至少包含了分別決定雌雄配子特異性的S因子，而雌雄配子S因子之間的分子識(shí)別作用是植物對(duì)自我和異我花粉進(jìn)行區(qū)分的物質(zhì)基礎(chǔ)[7-8].

在被子植物漫長(zhǎng)的進(jìn)化過(guò)程中，出現(xiàn)了兩種截然不同的分子機(jī)制調(diào)控自交不親和過(guò)程[9].按照調(diào)控機(jī)制的不同，植物的自交不親和可以分為配子體型自交不親和和孢子體型自交不親和.配子體型自交不親和是指僅由雌雄配子的S因子類型決定了是否親和，而雌雄配子均是植物的配子體世代，因此稱之為配子體型自交不親和，典型代表是茄科、薔薇科和罌粟科；而孢子體型自交不親和是由花柱和花粉的S因子的類型共同決定的，其中花柱的S因子的類型起決定作用，而花柱是植物孢子體世代的器官，因此被稱為孢子體型自交不親和，典型代表是十字花科[5].配子體自交不親和是植物界分布最廣泛的自交不親和調(diào)控機(jī)制[10].下面將主要闡述以馬鈴薯所屬的茄科為代表的配子體型自交不親和的調(diào)控機(jī)制.

1 雌配子中的S因子

雌配子中決定自交不親和的S因子應(yīng)具有以下幾個(gè)特征：首先在花柱中高表達(dá)，其次具有高多態(tài)性，以區(qū)分不同類型的S單倍型[9].Bredemeijer等對(duì)煙草的花柱特異性蛋白進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，不同S基因型植株的花柱特異性蛋白的等電點(diǎn)和分子量均不相同，說(shuō)明花柱中雌配子S因子確實(shí)具有很高的多態(tài)性[11].Anderson等從煙草中首次克隆出了花柱特異性蛋白的全長(zhǎng)cDNA，繼而又證明其具有核酸酶活性，因此被命名為S-RNase[8,12-14].McClure等證實(shí)，授粉后自花花粉管中的rRNA被大量降解，異花花粉管中的rRNA不受影響，這表明自交時(shí)，S-RNase可能通過(guò)其核酸酶活性大量降解自花花粉管中的rRNA，從而終止花粉管的延伸[15].Huang等通過(guò)轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)了S-RNase的核酸酶活性對(duì)于自交不親和反應(yīng)是必須的[7].2012年，Juan等發(fā)現(xiàn)授粉2到8天內(nèi)，親和及不親和的花粉管中肌動(dòng)蛋白絲的形態(tài)存在明顯區(qū)別：在不親和的花粉管中，肌動(dòng)蛋白絲的聚合度由60%下降至20%，而自交親和的花粉管中，肌動(dòng)蛋白絲的聚合度始終維持在70%左右.說(shuō)明在自交不親和的花粉管中，除了rRNA被大量降解外，肌動(dòng)蛋白絲也發(fā)生了解聚，導(dǎo)致細(xì)胞骨架發(fā)生改變[16].2018年，在薔薇科蘋(píng)果中，發(fā)現(xiàn)S-RNase可直接抑制MdMVG的活性，后者參與調(diào)控花粉管細(xì)胞中的微絲平衡，最終造成花粉管細(xì)胞中微絲聚合與解聚的失衡，導(dǎo)致花粉管細(xì)胞骨架異常[17]；同年在中國(guó)梨中發(fā)現(xiàn),S-RNase可直接與肌動(dòng)蛋白絲結(jié)合，促進(jìn)肌動(dòng)蛋白絲解聚，最終造成花粉管細(xì)胞發(fā)生程序性死亡，并且S-RNase促進(jìn)肌動(dòng)蛋白絲解聚的能力不依賴于其核酸酶活性[18].

以上研究結(jié)果表明，S-RNase既能大量降解花粉管中的rRNA，也可以直接或間接導(dǎo)致肌動(dòng)蛋白絲大量解聚造成花粉管的細(xì)胞骨架發(fā)生解體.無(wú)論是降解rRNA還是解聚肌動(dòng)蛋白絲，均會(huì)對(duì)花粉管細(xì)胞造成不可逆的損害，終止花粉管延伸，最終導(dǎo)致花粉管細(xì)胞發(fā)生程序性死亡，因此對(duì)花粉管細(xì)胞而言，S-RNase具有細(xì)胞毒性，是一種“毒蛋白”.

迄今為止，已經(jīng)從茄科、薔薇科和玄參科等多種配子體型自交不親和植物中分離出近百個(gè)S-RNase基因[10].對(duì)其蛋白產(chǎn)物進(jìn)行序列比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，S-RNase是一種堿性糖蛋白，其N(xiāo)末端有一段22～27個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)肽區(qū)域，介導(dǎo)了S-RNase在花柱細(xì)胞中合成后向細(xì)胞外基質(zhì)分泌的過(guò)程.不同單倍型的S-RNase的糖基化修飾程度并不相同，去除糖基化修飾不會(huì)影響S-RNase的核酸酶活性，也不影響S-RNase誘導(dǎo)產(chǎn)生的自交不親和反應(yīng).S-RNase的糖基化修飾水平可能會(huì)影響產(chǎn)生自交不親和反應(yīng)時(shí)所需的S-RNase的最低量即自交不親和反應(yīng)中S-RNase的閾值水平[19].除糖基化修飾位點(diǎn)及信號(hào)肽區(qū)域外，茄科植物的S-RNase具有五個(gè)保守結(jié)構(gòu)域(Conserved region,C1-C5)和兩個(gè)高變結(jié)構(gòu)域(Hypervariable region,HVa和HVb)[20]，其中C1、C4和C5是疏水的，組成了S-RNase的內(nèi)核區(qū)域，C2和C3是核酸酶活性區(qū)域，其中C3結(jié)構(gòu)域上116位的His殘基對(duì)于維持核酸酶活性是必須的，突變His116可以導(dǎo)致S-RNase核酸酶活性喪失[21-22].兩個(gè)高變區(qū)域HVa和HVb位于C2和C3之間，組成高變結(jié)構(gòu)域的氨基酸殘基基本上屬于極性氨基端，是可溶性基團(tuán)，暴露在蛋白表面，可能是S-RNase的特異性決定部位，參與了S-RNase與其他蛋白的相互識(shí)別過(guò)程[20,23].

雖然目前對(duì)雌配子S-RNase的作用機(jī)制有比較深入的研究，但是S-RNase蛋白進(jìn)入花粉管細(xì)胞的方式并不清楚.2000年，Luu等通過(guò)免疫金標(biāo)記S-RNase的方法證實(shí)各種單倍型的S-RNase均能夠進(jìn)入花粉管細(xì)胞中，沒(méi)有基因型特異性[24]；2006年Goldraij等采用三重標(biāo)記法即用胼胝體抗體標(biāo)記花粉管細(xì)胞的膜系統(tǒng)，用S-RNase的抗體標(biāo)記各種基因型的S-RNase，同時(shí)用120KDa的抗體標(biāo)記120KDa蛋白，對(duì)親和與不親和的花粉管分別進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)親和型和非親和型花粉管均能從花柱傳導(dǎo)組織中吸收S-RNase蛋白，進(jìn)入花粉管中的S-RNase蛋白被限制在特殊的區(qū)域中，120KDa蛋白標(biāo)記著S-RNase蛋白存在區(qū)域的界限[25].2014年，Meng等發(fā)現(xiàn)花粉管吸收S-RNase需要高爾基體囊泡參與，微管蛋白調(diào)節(jié)了這一過(guò)程，證實(shí)了S-RNase是通過(guò)胞吞作用進(jìn)入花粉管細(xì)胞的[26]，但胞吞作用的具體環(huán)節(jié)(包括鑒定膜上負(fù)責(zé)識(shí)別S-RNase的蛋白分子)還需要深入研究.

通過(guò)對(duì)雌配子S因子的研究進(jìn)展總結(jié)得出雌配子S因子參與調(diào)控自交不親和的過(guò)程：雌配子S因子編碼一類糖蛋白，在花柱表皮細(xì)胞中合成后，分泌到花柱的傳導(dǎo)組織中，花柱傳導(dǎo)組織是花粉管延伸至胚珠的通道.配子體型自交不親和植物的柱頭屬于濕式柱頭，正常育性的花粉落在柱頭上，一般均能吸水萌發(fā)，萌發(fā)出的花粉管延伸到花柱傳導(dǎo)組織中時(shí)，傳導(dǎo)組織中的S-RNase通過(guò)胞吞作用進(jìn)入花粉管細(xì)胞中，S-RNase發(fā)揮其細(xì)胞毒性，大量降解自花花粉管細(xì)胞中的rRNA，并通過(guò)直接或者間接的方式促進(jìn)肌動(dòng)蛋白絲發(fā)生解聚，改變花粉管的細(xì)胞骨架，誘導(dǎo)花粉管細(xì)胞發(fā)生程序性死亡，終止花粉管的延伸.

無(wú)論是親和型或是不親和型的花粉管，均能吸收S-RNase蛋白，沒(méi)有S基因型特異性，而親和型的花粉管細(xì)胞可以正常延伸至胚珠，完成雙受精作用，說(shuō)明親和型花粉管存在解除S-RNase細(xì)胞毒性作用的“解毒機(jī)制”.事實(shí)上，在漫長(zhǎng)的進(jìn)化過(guò)程中，植物進(jìn)化出各種類型的 “解毒機(jī)制”，用于實(shí)現(xiàn)對(duì)花粉管繼續(xù)萌發(fā)與否的調(diào)控，其中最重要的就是由雄配子S因子介導(dǎo)的對(duì)S-RNase的“解毒機(jī)制”.

2 雄配子中的S因子

如果說(shuō)雌配子中的S因子編碼的是一類細(xì)胞“毒性蛋白”，那么雄配子中的S因子編碼的就是一類針對(duì)雌配子S因子的“解毒蛋白”.

在尋找花粉S因子的過(guò)程中，最早認(rèn)為作為花粉S因子的基因應(yīng)該具有以下特征：首先花粉S因子應(yīng)該在花粉中高表達(dá)；其次，花粉S因子應(yīng)該與S-RNase基因緊密連鎖，共同組成S位點(diǎn)；花粉S因子的基因序列存在與S-RNase基因的多態(tài)性相對(duì)應(yīng)的高度變異水平，以介導(dǎo)對(duì)不同S-RNase基因的識(shí)別作用.Lai等通過(guò)對(duì)S基因座進(jìn)行長(zhǎng)片段測(cè)序，首次在金魚(yú)草中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)編碼F-box蛋白的基因AhSLF-S2，該基因與S2-RNase緊密連鎖，在花粉中特異表達(dá)[27].Entanit等和Ushijima等人也分別從薔薇科果梅和扁桃的S位點(diǎn)中鑒定出多個(gè)編碼F-box蛋白的基因[28-29].在尋找花粉S因子的過(guò)程中，早期研究者認(rèn)為花粉S因子應(yīng)該類似于雌蕊S因子是一個(gè)具有高度多態(tài)性的基因，雖然在對(duì)含有S位點(diǎn)的長(zhǎng)染色體片段進(jìn)行測(cè)序時(shí)多次發(fā)現(xiàn)了F-box基因，但由于單一F-box基因的多態(tài)性顯著低于S-RNase基因的多態(tài)性，因此一直懷疑F-box基因是否是花粉S因子.直到借助于轉(zhuǎn)基因的方法在矮牽牛和金魚(yú)草中分別證明了F-box基因決定了花粉自交不親和特異性反應(yīng)，才首次確認(rèn)了S基因座里的F-box基因就是花粉S因子，并將之命名為S-locus F-box基因，縮寫(xiě)為SLF/SFB基因[30-31].在后續(xù)的研究中發(fā)現(xiàn)薔薇科植物中的花粉S因子的作用方式存在分離，因此為了相互區(qū)分，一般將李屬植物中的花粉S因子命名為S haplotype-specific F-box (SFB)基因，而在蘋(píng)果屬植物中被命名為S-locus F-box brothers(SFBB)基因，但也存在例外，整體而言薔薇科中的花粉S因子缺乏統(tǒng)一命名規(guī)則[6,32].

目前關(guān)于花粉S因子的研究以矮牽牛中研究的最為詳細(xì)，矮牽牛也成為研究花粉S基因功能使用最為廣泛的植物.由于不同物種中花粉S基因命名規(guī)則及作用方式存在較大不同，因此下文將主要總結(jié)矮牽牛中花粉S因子的研究進(jìn)展.

在Sijacic等確定了SLF基因是花粉S因子以后，研究表明F-box蛋白一般是作為E3泛素連接酶的亞基起作用，因此早期建立了蛋白降解模型用于解釋花粉S因子對(duì)S-RNase的作用.該模型認(rèn)為SLF蛋白作為E3泛素連接酶中的底物識(shí)別亞基，連同E1泛素活化酶和E2泛素連接酶一起，介導(dǎo)了對(duì)S-RNase的泛素化作用，被泛素化修飾的S-RNase經(jīng)由26S蛋白酶體降解，從而解除了S-RNase的細(xì)胞毒性作用[33-35].按照蛋白降解模型，所有異我型的S-RNase都會(huì)被SLF蛋白通過(guò)泛素途徑降解，但后來(lái)發(fā)現(xiàn)S3-SLF不能降解S2-RNase，而S7-SLF不能降解S5、S11和S19型S-RNase[36]，這一發(fā)現(xiàn)引導(dǎo)研究者們將注意力轉(zhuǎn)向S位點(diǎn)內(nèi)其他的F-box基因，并最終建立了協(xié)同性非自我識(shí)別模型用于解釋花粉S因子對(duì)S-RNase的解毒過(guò)程.該模型認(rèn)為：首先，花粉S因子不是某一個(gè)特定的F-box基因，而是由S位點(diǎn)內(nèi)多個(gè)F-box基因共同決定了花粉的自交不親和特性；其次，單一的SLF基因只能識(shí)別一種或一類S-RNase，介導(dǎo)其被26S蛋白酶體降解；再次，S位點(diǎn)內(nèi)的多個(gè)F-box基因共同作用，介導(dǎo)了對(duì)所有異我型S-RNase的降解；最后，沒(méi)有一種F-box基因可以降解自我型的S-RNase，因此矮牽牛自花授粉是不親和的，而雜交授粉是親和的[36-37].按照這個(gè)模型，花粉S因子指的是S位點(diǎn)中多個(gè)F-box基因的組合，這也解釋了為什么單一的F-box基因的多態(tài)性顯著低于S-RNase基因的多態(tài)性，而多種F-box基因的多態(tài)性顯著高于S-RNase基因的多態(tài)性，充分保證各種類型的異我型S-RNase均可被識(shí)別并降解.

在確定了花粉S因子是F-box基因的組合后，后續(xù)研究集中在對(duì)F-box基因的克隆和作用方式的研究上.在對(duì)F-box蛋白作用方式的研究中，Hua等在矮牽牛中首次鑒定了PiCUL1-G，PiSBP1，PiSBP1與F-box蛋白互作組成了SCF(Skp1/Cullin/F-box)復(fù)合體，該復(fù)合體可直接與各類S-RNase蛋白結(jié)合[33].Entani等證明了SCF復(fù)合體可以對(duì)各種類型的S-RNase蛋白進(jìn)行泛素化修飾，且被泛素化修飾的S-RNase蛋白經(jīng)由26S蛋白酶體降解[34]，這說(shuō)明盡管多個(gè)F-box基因共同組成了花粉S因子，通過(guò)協(xié)同性非自我識(shí)別系統(tǒng)對(duì)各類異我型S-RNase進(jìn)行識(shí)別，但單一的F-box基因仍然是通過(guò)蛋白降解模型發(fā)揮作用的，且各類F-box蛋白組成的SCF復(fù)合體中，除F-box蛋白以外的其他亞基均是相同的[38].

Williams等通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序在S2和S3單倍型的矮牽牛的S位點(diǎn)中，均鑒定出17個(gè)SLF基因[39]，其中8個(gè)SLF基因被證明參與了對(duì)各類S-RNase的識(shí)別過(guò)程[30,40-41]，其他SLF蛋白的功能還需要進(jìn)一步驗(yàn)證.目前在矮牽牛中鑒定出17個(gè)SLF基因，發(fā)現(xiàn)這些SLF基因均位于S-RNase基因物理序列的下游，具有相同的轉(zhuǎn)錄方向，且均與S-RNase基因的轉(zhuǎn)錄方向相反，目前還不清楚是否所有物種的S位點(diǎn)內(nèi)基因均具有這種特殊的排列及轉(zhuǎn)錄方向.

對(duì)花粉S因子及其作用方式進(jìn)行總結(jié)如下：花粉S因子編碼的是F-box蛋白，與Skp1和Cullin共同組成了SCF復(fù)合體，SCF復(fù)合體行使E3泛素連接酶的作用，實(shí)現(xiàn)對(duì)進(jìn)入花粉管細(xì)胞中的S-RNase的識(shí)別和泛素化修飾作用，被泛素化修飾的S-RNase最終被26S蛋白酶體降解從而解除了S-RNase的細(xì)胞毒性，花粉管可以繼續(xù)延伸，完成受精作用，一種F-box蛋白介導(dǎo)了對(duì)一個(gè)或一類S-RNase蛋白的識(shí)別作用，多種F-box蛋白協(xié)同作用識(shí)別并降解所有異我型S-RNase，但沒(méi)有一種類型的SLF蛋白可以介導(dǎo)對(duì)自我型S-RNase的識(shí)別和泛素化作用，因此自交不親和而雜交是親和的.

在花粉管細(xì)胞內(nèi)，SCF復(fù)合體對(duì)S-RNase的泛素化修飾程度并不是確定水平的，存在單泛素化修飾和多泛素化修飾.被單泛素化修飾的S-RNase可能并不會(huì)被26S蛋白酶體降解，而是被細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)分揀至液泡中存儲(chǔ)起來(lái)，而被多泛素化修飾的S-RNase才會(huì)直接被26S蛋白酶體降解，這可能是造成有的實(shí)驗(yàn)室觀察到S-RNase在花粉管細(xì)胞內(nèi)是被隔離在細(xì)胞膜系統(tǒng)內(nèi)[25]，而有的實(shí)驗(yàn)室則觀察到親和的花粉管內(nèi)的S-RNase是大量被降解的.可能S-RNase進(jìn)入花粉管后，在不同的時(shí)間或者泛素化程度不同，造成S-RNase的處理結(jié)果并不相同，這只是一種推測(cè)，還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證明，這也說(shuō)明了對(duì)配子體自交不親和過(guò)程的認(rèn)識(shí)還很模糊，需要進(jìn)一步深入研究.

3 研究展望

目前對(duì)以S-RNase的細(xì)胞毒性作用為基礎(chǔ)的配子體型自交不親和的分子調(diào)控機(jī)制取得了重大進(jìn)展，基本已確定了雌雄蕊S因子的基因編碼產(chǎn)物，并已確立了以協(xié)同性非自我識(shí)別模型為基礎(chǔ)的雌雄蕊S因子間的相互作用模式，但是還有很多未知的領(lǐng)域需要進(jìn)一步研究.對(duì)配子體型自交不親和調(diào)控機(jī)制需要深入研究的領(lǐng)域主要有以下幾點(diǎn)：

(1)薔薇科、茄科和車(chē)前草科的自交不親和均是以S-RNase的細(xì)胞毒性作用為基礎(chǔ)的，被認(rèn)為具有相同的S-RNase基因起源[42-43]，而茄科的SLF基因被認(rèn)為與薔薇科的SFBB基因具有相同的起源[41]，但是缺乏對(duì)配子體型自交不親和基因的宏進(jìn)化分析，特別是各類S單倍型的進(jìn)化動(dòng)力研究；

(2)各種SLF蛋白與S-RNase蛋白之間的識(shí)別作用是否有普遍規(guī)律？目前只鑒定了少數(shù)幾種SLF蛋白對(duì)各種類型S-RNase的識(shí)別作用，并不能回答為何特定類型的SLF蛋白只能識(shí)別一種至多幾種S-RNase以及為何所有的SLF蛋白均不能識(shí)別自我型S-RNase；

(3)SLF蛋白組成的SCF復(fù)合體對(duì)S-RNase的泛素化修飾程度及被泛素化修飾的S-RNase蛋白的命運(yùn)還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明，這決定了花粉S因子到底是以何種方式實(shí)現(xiàn)對(duì)S-RNase蛋白的解毒作用的；

(4)雖然已經(jīng)明確S-RNase蛋白是通過(guò)胞吞作用進(jìn)入花粉管的，但對(duì)這一過(guò)程的具體調(diào)控機(jī)制幾乎一無(wú)所知.

總體而言，自20世紀(jì)80年代鑒定出雌蕊S因子以后，對(duì)配子體型自交不親和的分子調(diào)控機(jī)制的研究一直是植物分子生物學(xué)的熱點(diǎn)問(wèn)題之一，新的實(shí)驗(yàn)技術(shù)及已取得的進(jìn)展將為全面解析配子體自交不親和的調(diào)控過(guò)程提供有力支撐.